阅读说明：本技术 包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物 (Cosmetic composition comprising neem leaf extract ) 是由 郭起成 金贤贞 李智惠 姜恩斌 具守兰 于 2019-09-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物。具体来讲,公开一种包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物、包含上述化妆料组合物的化妆品组合物以及包含印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液组合物,其特征在于,作为有效成分包含印度苦楝树(Azadirachta indica)叶提取物,具有抗菌功效、抗炎症功效以及抗污染功效,尤其是上述抗污染功效是指防止空气中的污染物质、细微粉尘或重金属粒子的皮肤吸附并保护皮肤细胞的功效。(The present invention relates to a cosmetic composition comprising an extract of neem leaves. Specifically disclosed are a cosmetic composition containing an extract of neem tree leaves, a cosmetic composition containing the same, and a Pickering emulsion composition containing an extract of neem tree leaves, which are characterized by containing an extract of neem tree (Azadirachta indica) leaves as an active ingredient and having antibacterial, anti-inflammatory, and anti-pollution effects, particularly, the anti-pollution effects are effects of preventing skin adsorption of airborne pollutants, fine dusts, or heavy metal particles and protecting skin cells.)

包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物

技术领域

本发明涉及一种包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物、包含上述化妆料组合物的化妆品组合物以及包含印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液组合物。

背景技术

细微粉尘是一种直径为10μm以下的非常细微的颗粒状物质，会对皮肤造成很大的影响，当附着在皮肤上并与油分混合时将造成废物的沉积，而且在渗透到毛孔内部并造成砷、镉、铅等重金属的混入时还可能会导致如粉刺以及疖子等皮肤问题。细微粉尘对于具有如粉刺等皮肤疾病的患者更为致命，近年来粉刺疾病患者正在急剧增加，而且受到疾病困扰的年龄段也从过去的十几岁扩大到了二十几岁，其主要的原因在于饮食习惯的西方化、现代人群的压力增加以及如上所述的细微粉尘等环境污染影响。

目前，在因为细微粉尘等导致的皮肤问题的改善方面主要使用粉刺用化妆品且绝大多数是以杀菌剂为主要成分的产品，从而因为担心可能出现的副作用而难以有效地拓展市场。此外，为了解决因为细微粉尘而导致的皮肤问题，还能够采用在外出之后经常洗脸或为了阻隔与细微粉尘的接触而涂抹护肤化妆品的方法。在目前已开发出的与细微粉尘相关的化妆品中，大部分都是利用细微气泡对包含化妆残留物在内的细微粉尘以及各种污染物进行彻底清洗的洁面产品。但是，通过洗脸只能清除与皮肤接触的细微粉尘中的一部分，那些通过毛孔等途径渗透到皮肤内的细微粉尘却难以被有效清除。因此，通过防止细微粉尘与皮肤接触或渗透到皮肤内而保护皮肤显得尤为重要。

此外，导致人类老化的原因中包括多种不同的因素，当人体患上各种疾病时将生成促进老化的因素之一即活性氧，从而引发氧化作用并通过与DNA、细胞膜以及皮肤的主要构成物质即蛋白、多聚糖以及脂质发生反应而导致细胞的损伤以及皮肤的老化，而为了去除如上所述的活性氧，正在积极开展功能性食品以及化妆品领域的相关研究。

此外，目前已知紫外线(Ultraviolet；UV)能够促进黑色素(melanin)的生成，而过度的黑色素合成以及沉积会导致如黄褐斑、雀斑等影响美观的皮肤疾病，黑素体(Melanosome)中包含正常合成黑色素所需要的酶，其中，最具代表性的包括酪氨酸酶相关蛋白-1(tyrosinase related protein-1；TRP-1)、酪氨酸酶(tyrosinase)以及酪氨酸酶相关蛋白-2(tyrosinase related protein-2；TRP-2)等。

因为过度的活性氧(reactive oxyzen species，ROS)而造成的氧化应激作为外部因素会导致细胞的损伤，而作为内部因素会因为氧化应激诱发的炎症(inflammation)而导致病理性损伤。炎症反应是为了应对外部刺激而在生命体内发生的正常防御机制，在发生炎症反应时，将生成诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase；iNOS)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α；TNF-α)、一氧化氮(Nitric oxide；NO)、白细胞介素-1β(interleukin-1β；IL-1β)以及环氧酶-2(cyclooxygenase-2；COX-2)。为了应对因为氧化应激而发生的老化以及炎症性疾病，正在持续开展各类研究活动。

随着年龄的增长，皮肤的厚度将逐渐变薄、皱纹增加且皮肤弹性也将逐渐减少。之所以出现这种现象，是因为用于对体内的新陈代谢进行调节的荷尔蒙分泌减少以及皮肤的细胞活性下降，从而导致皮肤构成蛋白的生物合成活动减少。此外，因为紫外线照射而增加的自由基(free radical)以及有害活性氧，还会导致皱纹加深以及皮肤变厚的皮肤光老化现象。随着这种老化程度的提高，构成皮肤的如胶原蛋白(collagen)、弹性蛋白(elastin)以及透明质酸(hyaluronic acid)等结构蛋白的生成能力将随之降低且I型胶原蛋白水解酶(type I collagenase)(基质金属蛋白酶(Matrix metalloproteinase；MMP))的生物合成活动将随之增加，从而导致更多的皮肤结构蛋白被分解。而且，通过如上所述的过程累积的氧化应激还将进一步促进皮肤的老化。在因为紫外线照射而增加的蛋白酶中，用于对基质进行分解的基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase；MMPs)会在皮肤的光老化过程中起到非常重要的作用。皮肤真皮内的细胞外基质(extracellular matrix)起到维持皮肤的结构以及弹性功能的作用，其中的80％以上由I型前胶原(type I procollagen)构成。当皮肤暴露在紫外线的照射下时将造成基质金属蛋白酶(MMPs)表达的增加，而增加的基质金属蛋白酶(MMPs)将使构成皮肤的胶原质发生分解并因此导致基质蛋白的匮乏，从而引发皮肤的老化问题。

此外，印度苦楝树是一种苦楝树科的常绿乔木，其学名为Azadirachta indica，英文名为“Neem”或“Nim tree”。印度苦楝树栖息在如印度、尼泊尔、巴基斯坦、孟加拉国、斯里兰卡以及马尔代夫等热带以及亚热带地区，能够快速生长到15～20m的高度，在印度大陆适用于如虫害防治、牙齿健康、防沙漠化以及传统医学等领域。

先行技术文献

专利文献

1.韩国注册专利第10-1412111号(2014.06.19.)

2.日本公开专利第2010-512381号(2010.04.22.)

发明内容

发明所要解决的问题

本发明人通过对能够有效地防止如活性氧、紫外线、细微粉尘等内外部因素所导致的老化的提取物进行研究发现，印度苦楝树叶提取物对活性氧所导致的皮肤老化或皱纹、紫外线所导致的黑色素生成促进、细微粉尘等所导致的皮肤老化以及皮肤疾病等具有良好的功效并完成了本发明。

因此，本发明要解决的技术课题在于提供一种作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物以及包含上述化妆料组合物的化妆品组合物。

此外，本发明要解决的技术课题在于提供一种能够利用上述印度苦楝树叶提取物的药理活性广泛地应用于如食品、化妆品以及医疗等多种产业的皮克林乳液。

但是，本发明要解决的技术课题并不限定于在上述内容中提及的课题，相关行业的从业人员将能够通过下述记载明确理解未被提及的其他技术课题。

用于解决问题的方案

为了解决如上所述的本发明的技术课题，本发明提供一种包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物，其特征在于：作为有效成分包含印度苦楝树(Azadirachta indica)叶提取物，具有抗菌功效、抗炎症功效以及抗污染功效，其中，上述抗污染功效是指防止空气中的污染物质、细微粉尘或重金属粒子的皮肤吸附并保护皮肤细胞的功效。

本发明的特征在于：上述抗污染功效包括通过防止透明质酸的分解而防止皮肤吸附的功能，上述抗菌功效是对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的增殖抑制功能。

此外，本发明的特征在于：上述化妆料组合物还包括抗氧化功效、美白功效以及皱纹改善功效。

此外，本发明的特征在于：上述印度苦楝树叶提取物为热水提取的印度苦楝树叶提取物、乙醇提取的印度苦楝树叶提取物或丙酮提取的印度苦楝树叶提取物。

此外，本发明提供一种化妆品组合物，包含上述作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物。较佳地，本发明的特征在于：上述化妆品组合物为精华液、安瓿、香皂、补剂及身体精华液、乳液、护肤液、乳霜(水包油型、油包水型或多相型)、溶液、悬浮液(无水或含水)、无水生成物(油或乙二醇类)、凝胶或粉末形态。

此外，为了解决如上所述的本发明的另一技术课题，本发明提供一种包含印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液组合物，其特征在于：作为有效成分包含印度苦楝树(Azadirachta indica)叶提取物，还包含添加相、水相以及添加剂，具有抗菌功效、抗炎症功效以及抗污染功效，其中，上述抗污染功效是指防止空气中的污染物质、细微粉尘或重金属粒子的皮肤吸附并保护皮肤细胞的功效。

本发明的特征在于：上述皮克林乳液组合物是通过将包含利用热水、乙醇或丙酮提取出的印度苦楝树(Azadirachta indica)叶提取物、添加相、水相以及添加剂的组合物以10,000rpm至20,000rpm进行30秒至5分钟的粉碎处理之后再以300至800rpm进行1至5分钟的混合处理的方式制造。

此外，本发明的特征在于：上述抗污染功效包括通过防止透明质酸的分解而防止皮肤吸附的功能，上述抗菌功效是对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的增殖抑制功能。

此外，本发明的特征在于：上述皮克林乳液组合物还包括抗氧化功效、美白功效以及皱纹改善功效。

发明效果

适用本发明的作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物，具有防止空气中的污染物质、细微粉尘或重金属粒子的皮肤吸附并保护皮肤细胞的效果即抗污染(anti-pollution)功效。借此，能够在因为污染物质、细微粉尘以及重金属等的吸附而导致的皮肤疾病或皮肤炎症、抗菌等方面呈现出显著的效果，还能够改善皮肤细胞并维持皮肤保湿效果以及皮肤屏障。借此，适用本发明的化妆料组合物能够通过作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物而提供具有抗菌、抗炎症以及抗污染(anti-pollution)功效和抗氧化、美白以及皱纹改善功效的化妆料组合物。

此外，通过对适用本发明的印度苦楝树叶提取物在不同溶剂下的抗氧化效果、抗菌效果、抗炎症效果(粉刺改善)、美白效果(皮肤色素沉积缓解)以及皱纹改善效果等进行验证，能够利用上述验证结果提升在所需用途方面的应用价值。

此外，本发明能够通过提供包含从印度苦楝树叶提取出的有效成分的组合物而适用于如食品、化妆品以及医药品等，尤其是在作为化妆品使用时能够提供以更加稳定的形态包含有效成分以及其他添加成分的皮克林乳液组合物。借此，能够促进作为有效成分的印度苦楝树叶提取物的经皮吸收并提升使用感。

附图说明

图1对适用本发明之一实施例的印度苦楝树提取方法进行了图示。

图2a对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力测定结果进行了图示。

图2b对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS cation radical)清除能力测定结果进行了图示。

图2c对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的超氧化物歧化酶(SOD)类似活性效果测定结果进行了图示。

图2d对对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)清除能力测定结果进行了图示。

图3对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的(a)酪氨酸酶(tyrosinase)抑制活性测定结果以及(b)弹性蛋白酶(elastase)抑制活性效果测定结果进行了图示。

图4对适用本发明之一实施例的印度苦楝树叶提取物的(a)巨噬细胞(Macrophagecell)生存率测定结果以及(b)一氧化氮(NO)抑制活性测定结果进行了图示。

图5对适用本发明之实施例1(热水提取)、实施例2(乙醇提取)以及实施例3(丙酮提取)的印度苦楝树叶提取物的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及环氧酶-2(COX-2)表达抑制测定结果进行了图示。

图6a对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物的一氧化氮合酶信使核糖核酸(iNOS mRNA)表达抑制率测定结果进行了图示。

图6b对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物的黑色素瘤细胞(Melanoma cell)(B16F10)细胞毒性确认结果进行了图示。

图6c对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物的酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)以及酪氨酸酶(Tyrosinase)表达抑制确认结果进行了图示。

图6d对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物的酪氨酸酶相关蛋白-1信使核糖核酸(TRP-1mRNA)表达抑制结果进行了图示。

图7对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物的(a)人角质形成细胞(Human keratinocyte cell)生存率确认结果以及(b)基质金属蛋白酶-1(MMP-1)和丝聚合蛋白(Filaggrin)表达确认结果进行了图示。

图8对适用本发明之实施例2(乙醇提取)的印度苦楝树叶提取物中的(a)角质形成细胞(HaCaT cell)以及(b)纤维芽细胞(CCD-986sk cell)的细胞生存率确认结果进行了图示。

图9对适用本发明之一实施例的抗污染试验结果进行了图示，其中，(a)为利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene，BP)进行处理时印度苦楝树叶提取物中的角质形成细胞(HaCaTcell)的细胞生存率确认结果，(b)为利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene，BP)进行处理时印度苦楝树叶提取物中的纤维芽细胞(CCD-986sk cell)的细胞生存率确认结果，(c)为利用细微粉尘进行处理时印度苦楝树叶提取物中的纤维芽细胞(CCD-986sk cell)的细胞生存率确认结果。

图10对适用本发明之一实施例的皮克林乳液制造方法进行了图示。

图11对适用本发明之一实施例的皮克林乳液保湿剂在不同的甘油(Glycerin)含量、1,3-丁二醇(1,3-BG)含量以及丙二醇(Propandiol)含量下的剂型变化进行了图示。

图12对适用本发明之一实施例的皮克林乳液在不同的复合保湿剂含量下的经表皮失水(TEWL)水分蒸发测定结果进行了图示。

图13对适用本发明之一实施例的皮克林乳液在不同的pH值下的剂型变化、在不同的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)原料pH含量下的剂型变化以及在不同的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)含量下的剂型变化进行了图示。

具体实施方式

在对本发明进行详细的说明之前需要理解的是，在本说明书中所使用的术语只是用于对特定的实施例进行描述，并不是为了对本发明的范围进行限定，本发明的范围应仅通过权利要求书的范围作出定义。除非另有提及，否则在本说明书中所使用的所有技术术语以及科学术语的含义与具有一般知识的人员所通常理解的含义相同。

在本说明书以及权利要求书的所有范围之内，除非另有提及，否则术语包含(comprise，comprises，comprising)是指包含所提及的物件、步骤或一系列物件以及步骤，但并不旨在排除任意其他物件、步骤或一系列物件或一系列步骤存在。

此外，除非另有明确的相反记载，否则适用本发明的各个实施例能够与其他任何实施例结合。尤其是记载为较佳或有利的某个特征能够与记载为较佳或有利的其他特征以及多个特征结合。

适用本发明之一实施例的组合物包含印度苦楝树叶提取物，即包含所提取出的植物有效成分，能够在用于从细微粉尘以及重金属等保护皮肤的化妆品、用于抑制粉刺以及缓解皮肤色素沉积的功能性化妆品、食品以及医药品等中使用。在本说明书中，上述“有效成分”的含义是指能够单独呈现出所需要的活性或其自身没有活性但与载体一起使用时能够呈现出活性的成分。

本发明的一个方面提供一种作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物的化妆料组合物。

上述包含于本发明的印度苦楝树叶提取物能够通过溶剂提取法进行提取，而作为在溶剂提取法中所使用的溶剂，能够使用从由如水、碳原子数为1-4的无水或含水低级醇(例如甲醇、乙醇、丙醇以及丁醇)、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油、丙酮、二乙醚、乙酸乙酯、乙酸丁酯、二氯甲烷、三氯甲烷、己烷以及上述之混合物构成的组中选择的溶剂。

较佳地，能够利用热水、乙醇或丙酮进行提取，从而使其包含印度苦楝树的有效成分。在上述情况下，通过将印度苦楝树叶浸泡到作为溶剂的热水、乙醇或丙酮中之后进行提取而获得上述印度苦楝树叶提取物。根据所使用的溶剂，其提取方法也将有所不同。具体来讲，在利用热水对上述印度苦楝树叶进行提取时，在将干燥的印度苦楝树叶浸泡到8至12倍重量的热水中之后在90至110℃下进行3至5小时的提取。此时，将如上所述的提取步骤重复执行至少2次以上，较佳地执行3次以上而获得提取物为宜。此外，在利用乙醇或丙酮对上述印度苦楝树叶进行提取时，使用60至80％的乙醇或丙酮溶液作为溶剂并将干燥的印度苦楝树叶浸泡到8至12倍重量的乙醇或丙酮溶液中之后在常温下进行20至30小时的提取。此时，将如上所述的提取步骤重复执行至少2次以上，较佳地执行3次以上而获得提取物为宜。

此外，上述提取出印度苦楝树有效成分的印度苦楝树叶提取物能够提供抗菌效果、抗炎症效果(粉刺改善)以及抗污染(anti-pollution)效果。

首先，关于抗菌效果，印度苦楝树叶提取物具有对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)以及痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)呈现出增值抑制的抗菌效果。具体来讲，在增殖透明区(Clear zone)测定试验中，乙醇或丙酮提取的印度苦楝树叶提取物在金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)中从2㎎/disc开始呈现出了1.0±0㎝以上的透明区(clear zone)，且所有的印度苦楝树叶提取物在痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)中从5㎎/disc开始呈现出了1.1±0㎝以上的透明区(clearzone)。

此外，关于抗炎症效果，印度苦楝树叶提取物具有能够在巨噬细胞(Macrophagecell)即RAW 264.7中呈现出90％以上的生存率、对一氧化氮(NO)呈现出抑制活性、对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及环氧酶-2(COX-2)呈现出蛋白质表达抑制活性的抗炎效果。

尤其是乙醇或丙酮提取的印度苦楝树叶提取物在100μg/ml浓度下的一氧化氮(NO)抑制活性率优秀，可高达65％以上，而乙醇提取的印度苦楝树叶提取物的一氧化氮(NO)抑制活性最为优秀。此外，乙醇提取的印度苦楝树叶提取物具有诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白质表达抑制活性，而丙酮提取的印度苦楝树叶提取物具有诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及环氧酶-2(COX-2)蛋白质表达抑制活性。具体来讲，乙醇提取的印度苦楝树叶提取物在100μg/ml浓度下的诱导型一氧化氮合酶信使核糖核酸(iNOS mRNA)表达抑制率最为优秀，可高达97％以上。

此外，关于抗污染效果，印度苦楝树叶提取物在人类皮肤细胞即角质形成细胞(HaCaT cell)以及纤维芽细胞(CCD-986sk cell)中具有能够通过印度苦楝树提取物改善被苯并a芘(Benzo[α]pyrene，BP)刺激的细胞的抗污染功效。上述苯并芘是在化学燃料等的不完全燃烧过程中生成的多环芳烃的一种，是不仅包含于煤烟中还包含于空气中的污染物质。尤其是，在角质形成细胞(HaCaTcell)中与仅利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)进行处理的细胞相比在25μg/ml下呈现出了92％以上的改善效果，而在纤维芽细胞(CCD-986skcell)中在25μg/ml下呈现出了81％以上的改善效果。

此外，印度苦楝树叶提取物在纤维芽细胞(CCD-986sk cell)具有能够通过印度苦楝树提取物改善被细微粉尘刺激的细胞而对细胞进行保护的抗污染功效。具体来讲，在纤维芽细胞(CCD-986sk cell)中与仅利用微细粉尘进行处理的细胞相比在100μg/ml下呈现出了85％以上的改善效果。

此外，印度苦楝树叶提取物还具有对形成皮肤屏障的透明质酸进行保护的效果。在适用本发明的一实施例中，在使形成皮肤屏障并参与皮肤保湿的透明质酸与10ppm的铁成分和1％的印度苦楝树提取物以及0.2％的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)发生反应之后对透明质酸的粘度进行了测定，通过其结果可以确认，印度苦楝树提取物与铁成分结合的效果优于乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)，从而能够测定出较高的粘度值。这表示能够利用印度苦楝树叶提取物防止透明质酸的分解，而且其效果与用于吸附重金属等的乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)相比更佳优秀。

因此，通过将印度苦楝树叶提取物包含到化妆品组合物中，能够实现防止空气中的污染物质、细微粉尘或重金属粒子的皮肤吸附并保护皮肤细胞的效果即抗污染(anti-pollution)功效。借此，能够在因为污染物质、细微粉尘以及重金属等的吸附而导致的皮肤疾病或皮肤炎症、抗菌等方面呈现出显著的效果，还能够改善皮肤细胞并维持皮肤保湿效果以及皮肤屏障。

此外，上述提取出印度苦楝树有效成分的印度苦楝树叶提取物不仅能够提供如上所述的抗菌效果、抗炎症效果(粉刺改善)以及抗污染(anti-pollution)效果，还能够提供抗氧化效果、美白效果以及皱纹改善效果。

关于抗氧化效果，印度苦楝树叶提取物的多元酚含量高达50㎎/g以上，具有如2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力、2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS⁺radical)清除能力、超氧化物歧化酶(SOD)类似活性能力以及超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)清除能力等抗氧化效果。

尤其是，热水提取的印度苦楝树叶提取物在1,000μg/ml浓度下的2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力可高达40％以上，且2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS⁺radical)清除能力可高达70％以上，其结果最为优秀。乙醇提取的印度苦楝树叶提取物在1,000μg/ml浓度下的超氧化物歧化酶(SOD)类似活性能力可高达20％以上，且超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)清除能力可高达95％以上，其结果最为优秀。丙酮提取的印度苦楝树叶提取物具有高达70㎎/g以上的最高的多元酚含量。

此外，关于美白效果，印度苦楝树叶提取物具有能够呈现出酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性的皮肤色素沉积缓解效果即美白效果。尤其是，乙醇或丙酮提取的印度苦楝树叶提取物在1,000μg/ml浓度下的酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性率优秀，可高达45％以上，而乙醇提取的印度苦楝树叶提取物的酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性最为优秀。

进而，酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性最为优秀的乙醇提取的印度苦楝树叶提取物在黑色素瘤细胞(Melanoma cell)即B16F10中呈现出85％以上的生存率，且在10μg/ml的浓度下具有高达85％以上的酪氨酸酶相关蛋白-1信使核糖核酸(TRP-1mRNA)表达抑制能力。

此外，关于皱纹改善效果，印度苦楝树叶提取物具有能够呈现出弹性蛋白酶(Elastase)抑制活性的皱纹改善效果。尤其是，乙醇或丙酮提取的印度苦楝树叶提取物在1,000μg/ml浓度下的弹性蛋白酶(Elastase)抑制活性率优秀，可高达20％以上，而乙醇提取的印度苦楝树叶提取物的弹性蛋白酶(Elastase)抑制活性最为优秀。

进而，弹性蛋白酶(Elastase)抑制活性最为优秀的乙醇提取的印度苦楝树叶提取物在人角质形成细胞(Human keratinocyte cell)中呈现出90％以上的生存率，且在10μg/ml的浓度下具有基质金属蛋白酶-1(MMP-1)表达抑制能力。

如上所述，通过作为有效成分包含印度苦楝树叶提取物，能够提供具有抗菌、抗炎症以及抗污染(anti-pollution)功效和抗氧化、美白以及皱纹改善功效的包含适用本发明的化妆料组合物的化妆品。如上所述的包含印度苦楝树叶提取物的化妆品是一种皮肤及身体护理化妆品，能够被制造成如精华液、安瓿、香皂、补剂及身体精华液、乳液、护肤液、乳霜(水包油型、油包水型、多相型)、溶液、悬浮液(无水以及含水)、无水生成物(油以及乙二醇类)、凝胶或粉末等多种剂型。

此时，上述化妆品组合物除了印度苦楝树叶提取物之外还能够包含允许在皮肤化妆品制剂中使用的载体。作为上述载体，能够使用如醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、防腐剂、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳剂、稳定剂、紫外线阻隔剂、显色剂、香料以及稀释剂等。

因为能够作为上述醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、防腐剂、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳剂、稳定剂、紫外线阻隔剂、显色剂、香料以及稀释剂使用的具体的化合物以及组合物术语本行业公知的信息，因此相关从业人员能够选择使用适当的化合物或组合物。

接下来将对几个实例进行说明。作为醇，能够使用高级醇、丙二醇、1,3-丁二醇、甘油、山梨糖醇以及聚乙二醇等水溶性多元醇等，作为油，能够使用如鳄梨油、棕榈油、牛油以及荷荷巴油等，作为防腐剂，能够使用羟苯乙酯以及羟苯丁酯等，作为保湿剂，能够使用透明质酸、硫酸软骨素(chondroitin sulfate)以及吡咯烷酮羧酸盐等，而作为稀释剂，能够使用乙醇以及异丙醇。

具体来讲，当化妆品的剂型为糊剂、霜剂或凝胶剂时，作为载体成分能够使用如动物纤维、植物纤维、蜡、石蜡、淀粉、黄芪胶、纤维素衍生物、聚乙二醇、硅、膨润土、二氧化硅、滑石粉或氧化锌等。

此外，当剂型为粉剂或喷雾剂时，作为载体成分能够使用如乳糖、滑石粉、二氧化硅、氢氧化铝、碳酸钙或聚酰胺粉末等，尤其是在喷雾剂中，还能够追加包含如氯氟烃、丙烷/丁烷或二甲醚等推进物。

此外，当剂型为溶液或乳浊液时，作为载体成分能够使用溶剂、溶剂化剂或乳浊化剂，例如，能够使用如水、乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、苯甲醇、苯甲酸苄酯、丙二醇、1,3-丁基乙二醇油、甘油脂肪族酯、聚乙二醇或山梨聚糖的脂肪酸酯。

此外，当剂型为悬浊液时，作为载体成分能够使用如水、乙醇或丙二醇等液状稀释剂、如乙氧基化异硬脂醇、聚氧化乙烯山梨糖醇酯以及聚氧化乙烯山梨聚糖酯等悬浊液、微晶纤维素，间羟基铝、膨润土、琼脂或黄芪胶等。

此外，当剂型为含表面活性剂的洁面剂时，作为载体成分能够使用如脂肪醇硫酸盐、脂肪醇醚硫酸盐、磺基琥珀酸单酯、羟乙基磺酸盐、咪唑啉衍生物、甲基牛磺酸盐、肌氨酸盐、脂肪酸酰胺醚硫酸盐、烷基酰胺甜菜碱、脂肪醇、脂肪酸甘油酯、脂肪酸二乙醇酰胺、植物油、亚油精衍生物或乙氧基化甘油脂肪酸酯等。

此外，适用本发明之一实施例的包含印度苦楝树叶提取物的香皂，能够通过将印度苦楝树叶提取物包含到香皂基材上的方式制造，作为添加剂，能够包含如皮肤保湿剂、乳化剂、硬水软化剂等。

作为上述香皂基材，能够使用如椰子油、棕榈油、大豆油、蓖麻子油、橄榄油以及棕榈仁油等植物油脂或如牛油、猪油、羊油以及鱼油等动物油脂等，作为上述皮肤保湿剂，能够使用如甘油、赤藓糖醇、聚乙二醇、丙二醇、丁二醇、戊二醇、己二醇、肉豆蔻酸异丙酯、硅衍生物、芦荟汁以及山梨糖醇等，作为上述乳化剂，能够使用天然油、蜡、脂肪醇、碳氢化合物类以及天然植物提取物等，作为上述硬水软化剂，能够使用乙二胺四乙酸四钠等。

适用本发明的香皂组合物，还能够作为添加剂追加包含如抗菌剂、分散剂、泡沫抑制剂、溶剂、防水垢剂、防蚀剂、香料、色素、金属离子封闭剂、防氧化剂以及防腐剂等。

此外，本发明的另一个方面提供一种通过包含印度苦楝树叶提取物而具有抗菌、抗炎症以及抗污染(anti-pollution)功效和抗氧化、美白以及皱纹改善功效的皮克林乳液组合物。如上所述的皮克林乳液组合物是指以固态粒子稳定化的乳液，作为有效成分包含印度苦楝树(Azadirachta indica)叶提取物，还包含添加相、水相以及添加剂，能够促进作为有效成分的印度苦楝树叶提取物的经皮吸收并提升使用感。

此时，上述印度苦楝树叶提取物能够是如上所述的热水提取的印度苦楝叶提取物、乙醇提取的印度苦楝树叶提取物以及丙酮提取的印度苦楝树叶提取物，其中，能够根据皮克林乳液组合物的使用用途选择使用在相应用途上呈现出最佳功效的提取物。

上述印度苦楝树叶提取物相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含0.5至5重量％，较佳地包含0.5至3重量％为宜。

上述添加相包含从由碳酸钙、二氧化硅、黏土、锂藻土、石墨、乳胶、磁粉(magneticparticle)以及碳纳米管(CNT)构成的组中选择的1种以上，较佳地使用二氧化硅为宜。

上述添加相相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含1至10重量％，较佳地包含3至8重量％为宜。

上述水相包含水以及保湿剂，上述保湿剂包含从由甘油(Glycerin)、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)、山梨糖醇(Sorbitol)、乙二醇(Ethylene glycol)以及丙二醇(Propandiol)构成的组中选择的1种以上。较佳地，对甘油(Glycerin)、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)以及丙二醇(Propandiol)等3种进行混合使用为宜。

上述水相相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含75至95重量％，较佳地包含80至85重量％为宜。

上述水相对于水相的整体重量份包含50至80重量％，较佳地包含60至70重量％为宜。上述保湿剂相对于水相的整体重量份包含20至50重量％，较佳地包含30至40重量％为宜。

具体来讲，当作为保湿剂使用甘油(Glycerin)时，相对于水相的整体重量份包含10至70重量％，当作为保湿剂使用1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)时，相对于水相的整体重量份包含10至30重量％，而当作为保湿剂使用丙二醇(Propandiol)时，相对于水相的整体重量份包含10至40重量％。更较佳地，作为保湿剂对(Glycerin)、1,3-丁二醇(1,3-Butylene Glycol)以及丙二醇(Propandiol)进行混合使用，且将上述3种以1:0.8～1.2:0.8～1.2的比例进行混合并相对于水相的整体重量份包含30至40重量％为宜。

上述添加剂包含抗氧化剂、防腐剂以及pH调节集中的一种以上，上述抗氧化剂包含如L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)、α-生育酚(α-tocopherol)、多元酚(polyphenol)、鼠尾草酸(carnosic acid)、硫辛酸(lipoic acid)、2-氨基乙烷磺酸(2-aminoethanesulfonic acid)、芳香羧酸(aromatic carboxylic acid)以及上述之组合物，上述防腐剂包含如1,2-己二醇(1,2-hexanediol)、甘油辛酸酯(glyceryl caprylate)、羟苯甲酯(methylparaben)、水杨酸(salicylic acid)、对羟基苯甲酸异丙酯(isopropylparaben)、苯氧乙醇(phenoxyethanol)以及上述之混合物，上述pH调节剂包含如柠檬酸(Citric acid)或L-精氨酸(L-arginine)。

上述添加剂相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含2.2至12重量％。具体来讲，上述抗氧化剂相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含2至10重量％。上述防腐剂相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含0.1至1.0重量％，较佳地包含0.1至0.5重量％为宜。

上述pH调节剂应能够将皮克林乳液组合物的pH值调节至2至4的范围，具体来讲相对于皮克林乳液组合物的整体重量份包含0.1至1.0重量％，较佳地包含0.1至0.5重量％为宜。

上述皮克林乳液组合物是通过将上述成分以上述含量进行混合并以10,000rpm至20,000rpm进行30秒至5分钟的粉碎处理之后再以300至800rpm进行1至5分钟的混合处理的方式获得。

当将包含上述印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液组合物作为化妆品使用时，作为皮肤及身体护理化妆品，能够被制造成如精华液、安瓿、香皂、补剂及身体精华液、乳液、护肤液、乳霜(水包油型、油包水型、多相型)、溶液、悬浮液(无水以及含水)、无水生成物(油以及乙二醇类)、凝胶或粉末等多种剂型，包含上述印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液组合物相对于整体化妆品包含0.05至100重量％，而安瓿剂型能够由包含上述印度苦楝树叶提取物的皮克林乳液100重量％构成。

此外，在包含上述皮克林乳液组合物的化妆品制剂中，作为允许使用的载体，还能够包含如醇、油、表面活性剂、脂肪酸、硅油、防腐剂、湿润剂、保湿剂、粘度调节剂、乳剂、稳定剂、紫外线阻隔剂、显色剂、香料以及稀释剂等，具体信息请参阅上述内容。

接下来，将结合实施例以及试验例对本发明进行详细的说明，但是本发明并不限定于此。

<实施例1至实施例3-印度苦楝树叶提取物的制造>

在本发明的实施例中所使用的印度苦楝树(Azadirachta indica)叶，是从TNHHSBJ Viet Nam Co.购入。

为了制造出适用实施例1的热水提取物(AIW)，首先重复执行3次利用干燥试料10倍重量的超纯水作为溶剂在100℃下进行4小时提取的过程，接下来利用过滤纸(No.20filter paper,Hyundai micro Co.,Ltd.,Korea)对提取液进行过滤，然后执行浓缩、冻结干燥以及粉末化。

为了制造出适用实施例2的70％乙醇提取物(AIE)以及适用实施例3的70％丙酮提取物(AIA)，首先通过重复执行3次利用干燥试料10倍重量的溶剂在常温下进行24小时浸泡提取的过程而获得提取液，接下来按照与热水提取物相同的方法对残留的提取物执行粉末化(图1)。

热水提取物的收率为16.55％，70％乙醇提取物的收率为29.32％，而70％丙酮提取物的收率为26.38％。在将各个提取物包管道4℃的冷藏室并将其作为接下来的试验例的试料使用。

<试验例1-抗氧化效果测定>

(1)测定试剂

在抗氧化效果测定试验中所使用的试剂如下所述。

2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)diammonium salt)、过硫酸钾(Potassiumperoxodisulfate)、叔丁基羟基茴香醚(Butylated hydroxy anisole)、L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)、丹宁酸(Tannic acid)、表没食子儿茶酚没食子酸酯(Epigallocatechingallate)、2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl)、焦棓酸(Pyrogallol)、2,6-二羟基嘌呤(2,6-dihydroxypurine)、氯化硝基四氮唑蓝(Nitro bluetetrazolium)、黄嘌吟氧化酶(Xanthine oxidase)等使用了Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis,MO,USA)的产品。福林酚试剂(Folin-ciocalteu phenol reagent)使用了Junsei chemical Co.,Ltd.(Japan)的产品。乙醇(Ethanol)、2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol)、氯化氢(Hydrogen chloride)、磷酸二氢钾(Potassium phosphate monobasic)以及磷酸氢二钾(Potassium phosphatedibasic)等使用了Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(Korea)的产品。

在各个试验中将试料以10㎎/ml溶解到蒸馏水之后再稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度。

(2)多元酚化合物总含量测定

利用Folin-Denis方法对多元酚化合物总含量进行了测定。将各个试料以10㎎/ml溶解到蒸馏水之后再稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度。在添加0.2ml的福林西奥卡特试剂(Folin ciocalteu reagent)并均匀混合之后在室温下放置3分钟。在3分钟之后添加0.5ml的0.7M碳酸钠(Na₂CO₃)饱和溶液并混合，然后按照不同的浓度分别投入各0.5ml的提取物并进行1小时的反应，接下来在725nm下对其吸光度进行了测定。在通过利用丹宁酸(Tannic acid)的标准曲线换算出对应的量之后对多元酚总含量进行了测定。

酚类组分大量包含于天然物质内，目前已有诸多研究报告指出其主要作用在于清除自由基，此外，如黄酮类或酚酸以及花青素等酚类组分在如2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)自由基清除活性等抗氧化活性方面起到非常重要的作用。在本试验中作为基本物质使用了丹宁酸(Tannic acid)并利用标准曲线对印度苦楝树提取物的多元酚含量进行了测定，其结果如下述表1所示。

表1

如上述表1所示，可以确认印度苦楝树的热水提取物(AIW)为52.94㎎/g、70％乙醇(Ethanol)提取物(AIE)为51.37㎎/g、70％丙酮(Acetone)提取物(AIA)为73.45㎎/g，在各个溶剂提取物中，70％丙酮提取物(AIA)的多元酚含量最高。与药用植物提取物的多元酚含量分析(Shin JH,Jang JR,Kang MJ,Shin JH(2018)Physiological Activity of FiveKinds of Medicinal Plant Extracts with Various Solvents and TheirComposites.Journal of life science,28,3,320-330.)中的葛花(6.46㎎/g)、葛根(5.50㎎/g)以及甘菊(2.48㎎/g)等相比，可以确认热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)、丙酮提取物(AIA)的多元酚含量较高。

(3)2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除效果测定

利用Blois方法对2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力的效果进行了测定。利用99％的乙醇(ethanol)将2,2-二苯基-1-苦基肼(2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl，DPPH)溶解到0.45mM的浓度，再将各个提取物稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度。作为阳性对照组，使用了叔丁基羟基茴香醚(Butylated hydroxyanisole，BHA)。接下来，向96孔板(well plate)添加120μl的各个提取物和60μl的2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)并在室温条件下遮光进行15分钟的反应，然后在517nm下利用酶标仪(ELISA reader)对其清除活性进行了测定。

2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

1,1-二苯基-2-苦基肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)用于推电子能力的测定，物质本身具有非常稳定的自由基(free radical)，是一种在517nm下呈现出与其他波长不同的光吸收特性的紫蓝色的组分物质。2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)在有机溶剂即乙醇等中稳定，因为会在抗氧化机制过程中因为质子-自由基清除(proton-radicalscavenger)而发生脱色，因此能够轻易地通过肉眼确认其抗氧化活性。通过测定2,2-二苯基-1-苦基肼自由基(DPPH radical)清除能力而对印度苦楝树叶提取物的抗氧化功效进行了测定，其结果如图2a所示。

如图2a所示，热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)均呈现出了浓度依赖性的抗氧化效果，整体来讲热水提取物(AIW)在相同浓度下具有更优秀的活性。在1,000μg/ml浓度下，热水提取物(AIW)呈现出了41.41％的效果，乙醇提取无(AIE)以及丙酮提取物(AIA)分别呈现出了34.09％以及30.61％的效果，可以确认热水提取物(AIW)与剩余的其他提取物相比具有更高的效果。

(4)2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS⁺radical)清除效果测定

按照2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子脱色试验(ABTS⁺cationdecolorization assay)方法，对利用2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS radical)的抗氧化力进行了测定。在将7mM 2,2-联氮-双(2,2-azino-bis)以及2.4mM过硫酸钾(potassium persulfate)以相同比例混合并在遮光条件下放置12～24小时而使其发生反应之后进行了试验。将各个提取物稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度，作为阳性对照组使用了叔丁基羟基茴香醚(Butylated hydroxy anisole，BHA)。接下来，向96孔板(well plate)添加100μl的ABTS⁺和100μl的各个提取物并在25℃下进行7分钟的反应，然后在734nm的波长下测定吸光度并显示为抑制率(％)。

2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS+radical)清除能力(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

关于2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)自由基(ABTS radical)清除能力，在2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)与过硫酸钾(potassium persulfate)发生反应时将生成2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS+radical)并呈现出特有的颜色即青绿色，而在添加试料时将变成浅绿色，因此能够同时对供氢型抗氧化剂(hydrogen donating antioxidant)以及断链型抗氧化剂(chain breakingantioxidant)进行测定。因为在与抗氧化物质反应时吸光度将发生变化，因此与2,2-二苯基-1-苦基肼(DPPH)清除能力试验方法一起被广泛地适用于多种研究。通过测定2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基(ABTS cation radical)清除能力而对印度苦楝树叶提取物的抗氧化功效进行测定的结果如图2b所示。

如图2b所示，在最高浓度即1,000μg/ml下热水提取物(AIW)呈现出了73.55％的抑制率，乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)分别呈现出了69.60％以及62.24％的抑制率。可以确认，热水提取物(AIW)在相同的浓度下呈现出了最高的2,2'-联氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)阳离子自由基清除活性(ABTS⁺cation radical scavengingactivity)。

(5)超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase)类似活性效果测定

按照Marklund方法对超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)类似活性进行了测定。将各个试料稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度，作为阳性对照组使用了L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)。向96孔板(well plate)添加20μl的各个试料溶液、130μl的50mM三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(Tris-HCl buffer)(pH8.5)以及溶解于蒸馏水的20μl的7.2mM焦棓酸(pyrogallol)并在室温条件下遮光进行20分钟的反应，接下来通过测定420nm下的吸光度而对焦棓酸(pyrogallol)的量进行了测定。

超氧化物歧化酶(SOD)类似活性能力(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)是一种通过在生物体内与有害的超氧阴离子自由基(superoxide anion radical，·O₂)发生反应而生成过氧化氢(H₂O₂)的酶，存在于使用氧气的所有生物体内，是在生物体内对活性氧所造成的问题起到防御作用的代表性的活性氧抑制剂。此外，作为参与对因为氧分子被还原而生成的超氧阴离子自由基(superoxide anion radical，·O₂ ^-·2O₂+2e^-→2·O₂ ^-)进行清除的防御机制的酶(2O₂ ^-+2H⁺→H₂O₂+O₂ ^-)，能够起到预防毒性极强的羟自由基(hydroxy radical)生成的作用，因此可以作为抗炎症原材料或用于防止皮肤老化的美容原材料，在如化妆品等产品中作为添加剂使用。通过测定印度苦楝树叶提取物的超氧化物歧化酶(SOD)类似活性效果而对印度苦楝树叶提取物的抗氧化效果进行测定的结果如图2c所示。

如图2c所示，可以确认热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)在最高浓度即1,000μg/ml的浓度下的效果分别为12.82％、24.13％、7.38％，其效果顺序依次为乙醇提取物(AIE)>热水提取物(AIW)>丙酮提取物(AIA)。

(6)超氧阴离子自由基(superoxide anion radical)清除效果测定

按照氯化硝基四氮唑蓝(Nitroblue tetrazolium，NBT)还原方法对超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)清除能力进行了测定。将各个试料稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度并向0.1ml的各个试料和0.4ml的0.1M磷酸钾缓冲液(Potassiumphosphate buffer)(pH 7.5)添加2ml的溶解有氯化硝基四氮唑蓝(NBT)(0.24mM)以及黄嘌呤(Xanthine)(0.4mM)的基质(substrate)并添加2ml的黄嘌呤氧化酶(Xanthine oxidase)(0.2U/ml)，接下来在37℃下进行20分钟的反应之后添加1ml的1N盐酸(HCl)并在560nm下对吸光度进行了测定。作为阳性对照组，使用了表没食子儿茶酚没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)。

抑制率(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)是在需氧细胞的酶促或非酶促步骤中生成极强毒性的自由基(radical)，与皮肤老化相关并参与氧化反应的开始步骤。此外，还参与如过氧化氢、羟自由基、单线态氧等活性氧的生成，从而对脂质、脱氧核糖核酸(DNA)以及蛋白等造成氧化损伤。在如上所述的过程中，当抗氧化物质因为与超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)发生反应而被清除时，以紫色表达的现象将有所减少，而利用上述吸光度的变化能够对抗氧化效果进行测定。通过测定超氧阴离子自由基(Superoxide anion radical)清除能力而对印度苦楝树叶提取物的抗氧化效果进行测定的结果如图2d所示。

如图2d所示，在最高浓度即1,000μg/ml下，热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)分别呈现出了81.37％、96.04％、52.30％的结果。在相同的浓度下，乙醇提取物(AIE)呈现出了最高的功效，进而按照热水提取物(AIW)、丙酮提取物(AIA)的顺序呈现出了超氧阴离子自由基(superoxide anion radical)清除能力。

<试验例2-抗菌效果测定>

(1)菌株以及培养基

在抗菌效果测定中所使用的菌株以及培养基如下所述。

作为菌株，使用了大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、白色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)以及白色念珠菌(Candida albicans)等。作为培养基，使用了营养液体培养基(Nutrient broth，NB)、胰蛋白酶大豆液体培养基(Tryptic soy broth，TSB)、岐阜厌氧培养基(Gifu anaerobic medium，GAM)、营养琼脂(Nutrient agar，NA)以及胰蛋白酶大豆琼脂(Tryptic soy agar，TSA)等。

(2)细菌培养

作为在抗菌力测定试验中使用的菌株，使用了大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)KCTC 2441、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)KCTC 1916、阴沟肠杆菌阴沟亚种(Enterobacter cloacae subsp cloacae)KCTC 2361、白色葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)KCTC 1917、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)KCTC 1750，作为粉刺诱发菌，使用了痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)KCTC 3065。作为霉菌，对白色念珠菌(Candida albicans)KCTC 7965进行继代培养并在试验中使用。关于预处理培养以及本试验的培养的液体培养基，作为大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)、白色葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)以及阴沟肠杆菌阴沟亚种(Enterobacter cloacae subsp cloacae)的液体培养，使用了从Difco Lab.(Sparks,U.S.A)购入的营养液体培养基(Nutrient broth，NB)，作为金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的液体培养基，使用了从Difco Lab.(Sparks,U.S.A)购入的胰蛋白酶大豆液体培养基(Tryptic soy broth，TSB)，作为痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes)的液体培养基，购买使用了岐阜厌氧培养基(Gifu anaerobicmedium)(GAM，Nissui Co.Japan)，作为白色念珠菌(Candida albicans)的液体培养基，购买使用了酵母菌霉菌液体培养基(Yeast Mold broth)(YMB，Sparks,U.S.A)。关于固体培养基，营养琼脂(Nutrient agar，NA)、胰蛋白酶大豆琼脂(Tryptic soy Agar，TSA)、酵母菌霉菌琼脂(Yeast Mold agar，YMA)是从Difco Lab.(Sparks，U.S.A)购入，而岐阜厌氧培养基(Gifu anaerobic medium，GAM)是从Nissui Co.Japan购入，在试验过程中在向培养基添加琼脂粉末(Agar Powder)之后用于试验。

(3)增殖透明区(Clear Zone)测定

利用纸盘(Paper disc)对增值抑制率进行了测定。即，通过将在平板培养基中培养的1接种环的各个菌株投入到15ml的液体培养基进行18～24小时培养而激活，接下来将0.1ml的菌液接种到15ml的液体培养基中并进行4～8小时培养，然后将每个平板培养基中的菌数接种到约1×10⁶个细胞并利用灭菌棉棒均匀涂抹。将灭菌的滤纸盘(Filter paperdisk)(8㎜，Tokyo，Japan)放置在固体平板培养基中并将不同浓度的试料吸收至0.05ml/disk，接下来将细菌利用37℃的培养箱而将真菌利用25℃的培养箱进行12～48小时的培养，然后通过测定盘(disc)周围的透明区(㎜)直径而对其抑制活性进行确认。

通过纸盘琼脂扩散法(Paper disc agar diffusion assay)分析了印度苦楝树叶提取物的抗菌效果，对增殖透明区(Clear zone)进行测定的结果如下述表2所示。

表2

如上述表2所示，可以确认印度苦楝树叶提取物对大肠埃希氏杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、铜绿色假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、白色念珠菌(Candida albicans)没有抗菌效果，乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)在金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中从2㎎/disc开始形成了1.0±0㎝以上的透明区(clear zone)，热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)在痤疮丙酸杆菌(Propionibacteriumacnes)中从5㎎/disc开始形成了1.1±0㎝以上的透明区(clear zone)。

<试验例3-美白效果测定>

(1)测定试剂

在美白效果测定中所使用的试剂如下所述。

3,4-二羟基-L-苯基丙氨酸(3,4-dihydroxy-L-phenylalanine)、蘑菇源性酪氨酸酶(Tyrosinase from mushroom)等购买使用了Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis，MO，USA)的产品。磷酸二氢钠二水物(Sodium phosphate monobasic dihydrate)、无水磷酸氢二钠(Sodium phosphate dibasic anhydrous)等使用了Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(Korea)的产品。在美白效果测定中所适用的小眼畸形相关转录因子(MITF)、酪氨酸酶(Tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)2次抗体(antibodies)是从Santa Cruz(Biotech，CA，USA)购入。

(2)蘑菇(Mushroom)源性酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性测定

按照Yagi等方法对酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性进行了测定。将各个试料稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度，作为阳性对照组使用了L-抗坏血酸(L-ascorbicacid)。在对40μl的将10mM L-多巴(L-DOPA)溶解到80μl的67mM磷酸钠缓冲液(sodiumphosphate buffer)(pH 6.8)中的基质(substrate)以及40μl的试料进行混合的混合液中添加40μl的蘑菇酪氨酸酶(mushroom tyrosinase)[125unit/ml]并在37℃下进行10分钟的反应，接下来在492nm下对吸光度进行了测定。

酪氨酸酶(Tyrosinase)抑制活性率(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

黑素细胞(melanocyte)是在表皮基底层的色素细胞内的黑素体(melanosome)中经过生物合成而形成，其中，黑色素(melanin)是决定皮肤色调的重要因子。酪氨酸(tyrosine)作为氨基酸的一种，是用于合成黑色素的物质。酪氨酸(Tyrosine)通过黑色素瘤细胞(melanoma cell)内的酪氨酸酶(tyrosinase)氧化成L-3,4-二羟基苯丙氨酸(L-3,4-dihydroxy phenylalanine，DOPA)以及多巴醌(DOPA quinone)。接下来，多巴醌(DOPAquinone)将进一步转换成5,6-二羟基吲哚(5,6-dihydroxyindole)、多巴色素(DOPAchrome)、吲哚-5,6-醌(indole-5,6-quinone)，而吲哚-5,6-醌(indole-5,6-quinone)通过聚合生成黑色素(melanin)。为了测定出能够对如上所述的在皮肤内的黑色素(melanin)聚合体生物合成进行抑制的酪氨酸酶(tyrosinase)抑制活性，对蘑菇(mushroom)源性酪氨酸酶(tyrosinase)抑制活性进行了测定，其结果如图3(a)所示。

如图3(a)所示，在最高浓度即1,000μg/ml的浓度下热水提取物(AIW)为32.77％、乙醇提取物(AIE)为47.21％、丙酮提取物(AIA)为45.36％，在相同的浓度下乙醇提取物(AIE)呈现出了最高的活性。虽然与作为阳性对照组使用的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)相比效果较低，但是可以确认印度苦楝树叶提取物作为天然物质具有较高的效果，因此判定其可以起到一定的美白作用。

<试验例4-皱纹改善效果测定>

(1)测定试剂

在皱纹改善效果测定试验中所使用的试剂如下所述。

N-琥珀酰-丙酰氨-丙酰氨-丙酰氨-对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Ala-p-nitroanilide)以及猪胰脏源性弹性蛋白酶(Elastase from porcine pancreas)等使用了Sigma aldrich Co.,Ltd.(St.Louis，MO，USA)的产品。2-氨基-2-(羟甲基)丙烷-1,3-二醇(2-Amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol)、氯化氢(Hydrogen chloride)等使用了Duksan pure chemicals Co.,Ltd.(Korea)的产品。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)以及丝聚合蛋白(Filaggrin)2次抗体(antibodies)是从Santa Cruz(Biotech，CA，USA)购入。

(2)弹性蛋白酶(Elastase)抑制效果测定

参考Cannell等的方法对弹性蛋白酶抑制活性(Elastase inhibition activity)进行了试验。利用酶标仪(ELISA)在405nm的波长下对使用N-琥珀酰-(L-丙酰氨)₃-对硝基苯胺(N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanailide)时以36℃的条件在25分钟之内从基质生成的对硝基苯胺(p-nitroanilide)的量进行了测定。接下来，在将各个试料稀释成5、10、50、100、500、1000μg/ml的浓度之后分别取40μl的试料液，接下来添加40μl的溶解到50mM浓度的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液(tris-HCl buffer)(pH8.6)中的猪胰脏弹性蛋白酶[0.5unit/ml]溶液，然后作为基质添加溶解到50mM浓度的三羟甲基氨基甲烷缓冲液(trisbuffer)(pH 8.6)中的N-琥珀酰-(L-丙酰氨)₃-对硝基苯胺(N-succinyl-(L-Ala)₃-p-nitroanailide)并进行20分钟的反应，接下来对其结果进行测定。作为阳性对照组，使用了表没食子儿茶酚没食子酸酯(Epigallocatechin gallate，EGCG)。

弹性蛋白酶(Elastase)抑制活性率(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

弹性蛋白(Elastin)是一种用于在真皮内维持皮肤弹性的非常重要的蛋白质，存在于皮肤的结缔组织，参与组织的伸缩性以及柔韧性。弹性蛋白酶(elastase)是用于对如上所述的弹性蛋白(elastin)进行分解的酶，是导致皱纹以及皮肤下垂等皮肤老化问题的原因之一。因此，弹性蛋白酶(elastase)抑制剂能够通过改善皮肤皱纹而起到防老化的作用，印度苦楝树叶提取物的弹性蛋白酶(elastase)抑制活性效果的测定结果如图3(b)所示。

如图3(b)所示，在最高浓度即1,000μg/ml下，热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)分别为17.56％、24.24％以及21.92％，乙醇提取物(AIE)所呈现出的活性最高。

<试验例5-抗炎症效果测定>

(1)细胞株以及试剂

在细胞的生存率测定中所使用的细胞株即小鼠巨噬细胞(Murine macrophagecell，RAW 264.7)、大鼠黑色素瘤细胞(Mouse melanoma cell，B16F10)，使用了Americantype culture collection(Manassas，VA，USA)的产品。人角质形成细胞(HumanKeratinocyte cell，HacaT)，使用了从韩国韩方振兴院购买的细胞。改良杜氏伊戈尔培养基(Dulbecco's modified eagle medium，DMEM)、胎牛血清(Fetal bovine serum，FBS)等购买使用了LONZA Co.的产品。0.25％胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(trypsin-EDTA)、0.4％台盼蓝染色剂(trypan blue stain)购买使用了gibco BRL Co.(Grand Island，NY，USA)的产品，3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide，MTT)试剂购买使用了Sigma chemical Co.Ltd.(St.Louis，MO，USA)的产品。

(2)细胞毒性测定

1)细胞培养

在本试验中使用的RAW 264.7巨噬细胞(macrophage cell)、B16F10黑色素瘤细胞(melanoma cell)、HacaT角质形成细胞(keratynocyte cell)，是使用添加了1％青霉素/链霉素(penicillin/streptomycin)(100unit/ml)以及10％胎牛血清(FBS)的改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)在37℃、5％CO₂培养箱(incubator)中进行了继代培养。

2)利用噻唑蓝比色法(MTT assay)的细胞生存率测定

按照Carmichael的方法对细胞生存率进行了测定。将细胞株RAW 264.7、B16F10、HacaT以1×10⁴个细胞/孔的量添加到96孔板(well plate)，并在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂条件进行了24小时的培养。将热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)、丙酮提取物(AIA)分别稀释成5、10、25、50、100、250、500μg/ml的浓度之后以200μl/孔进行了24小时的处理。接下来，以20μl/孔的量添加制备成2.5㎎/ml浓度的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液并在培养3～4小时之后移除培养液，然后以100μl/孔的量添加二甲亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)并在室温下进行10分钟的反应，接下来通过在540nm下测定吸光度而导出了结果。

细胞生存率(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

通过噻唑蓝比色法(MTT assay)对使用印度苦楝树(Azadirachta indica)时的巨噬细胞(macrophage cell)的细胞生存率进行了确认，其结果如图4(a)所示。

如图4(a)所示，对不同的浓度进行测定的结果，在5、10、50、100μg/ml的浓度下热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)均呈现出了90％以上的生存率，蛋白质印迹法(Western blot)、实时聚合酶链反应(Real-time PCR)是在设定为10、50、100μg/ml的3个区间之后进行了试验。

3)一氧化氮(Nitric oxide)生成抑制效果测定

关于一氧化氮(Nitric oxide，NO)测定，是利用亚硝酸盐(Nitrite)以及硝酸盐(nitrate)对细胞上清液的一氧化氮(Nitric oxide，NO)的量进行了测定。将细胞株RAW264.7以4×10⁴个细胞/孔的量添加到96孔板(well plate)，并在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂条件进行了24小时的培养。接下来，将培养液更换成未添加血清的改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)，并通过利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)进行处理而诱导了炎症反应。接下来，利用脂多糖(LPS)处理成1ppm/孔并利用不同浓度的各个试料溶液进行处理，然后在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂的条件进行了24小时的培养。接下来，将100μl的细胞培养液移动到新的96孔板(well plate)并在添加100μl的格里斯试剂(Griessreagent)之后在常温下进行5分钟的反应，最后对540nm下的吸光度进行测定并计算出结果。

一氧化氮(NO)生成量(％)＝(1-试料添加组的吸光度/未添加组的吸光度)×100

为了对印度苦楝树(Azadirachta indica)在巨噬细胞(Macrophage cell)即RAW264.7中的壳聚糖-葡糖酸盐(Chitosan-Gluconate)的一氧化氮(Nitric oxide)抑制程度进行测定，利用不同的溶剂以及不同的浓度对样本进行处理并对其一氧化氮(NO)量进行测定的结果如图4(b)所示。

如图4(b)所示，在最高浓度即100μg/ml下，热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)分别呈现出了35.7％、68.86％、66.45％的抑制效果。在相同的浓度下，乙醇提取物(AIE)呈现出了最高的一氧化氮(NO)抑制活性。

(3)利用蛋白质印迹法(Western blot)的蛋白质表达测定

为了对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧酶-2(COX-2)、酪氨酸酶(Tyrosinase)、酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)、基质金属蛋白酶(MMP-1)以及丝聚合蛋白(Fillagrin)的蛋白质表达进行确认，将细胞株RAW 264.7、HacaT细胞以3×10⁵个细胞/孔、将B16F10以2×10⁵个细胞/孔的量添加到6孔板(well plate)，并在37℃、5％CO₂的培养箱(incubator)中进行了24小时的培养。接下来将培养液更换成未添加血清的改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)，然后为了诱导细胞的验证、美白处理、皱纹改善反应，RAW264.7利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)而B16F10利用α-黑素细胞刺激素(Alpha-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)处理成1ppm/孔并利用不同浓度的各个试料溶液进行处理，接下来在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂的条件进行了24小时的培养。对于HacaT细胞，在利用磷酸盐缓冲液(PBS)对除未处理组之外的所有试验组进行1次洗涤之后投入磷酸盐缓冲液(PBS)并照射了紫外线-B(UV-B)(300mJ/㎝²)。在照射之后利用不同浓度的试料溶液进行处理并培养24～48小时。接下来，在移除培养基之后利用磷酸盐缓冲液(PBS)进行1次洗涤并利用分别包含0.1％的磷酸酶(phosphatase)以及蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)的RIPA缓冲液处理成60μl/孔而使细胞溶解，然后利用离心分离机在4℃、12,000rpm条件下进行15分钟的离心分离，接下来将所获得的上清液移动到新的试管。膜(membrane)是利用Digital reciprocating shaker设备按照5％脱脂牛奶(skimmilk)2小时、第一抗体(Primary antibody)2小时、1X TBST溶液10分钟(重复3次)、第二抗体(Secondary antibody)1小时、1X TBST溶液10分钟(重复3次)的顺序执行封闭(blocking)过程，接下来利用HRP基质(substrate)显色试剂进行2分钟的反应，然后利用蛋白质印迹成像系统(western imaging system)(CAS-400SM，Davinch-K Co.,Ltd.，Korea)设备确认条带并进行定量以及结果计算。

为了确认印度苦楝树对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、环氧酶-2(COX2)造成的影响，将利用脂多糖(LPS)诱导的大鼠巨噬细胞(mouse macrophages cell)(RAW 264.7)利用10、50、100μg/ml浓度的热水提取物(AIW)、乙醇提取物(AIE)以及丙酮提取物(AIA)进行处理并在24小时之后进行回收，接下来通过蛋白质印迹法(western blot)对其表达进行了确认。作为对照组，使用了吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(Ammoniumpyrrolidinedithiocarbamate，PDTC)。作为管家基因(House keeping gene)，使用了β-肌动蛋白(β-actin)。其结果如图5所示。

如图5所示，可以确认乙醇提取物(AIE)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)、丙酮提取物(AIA)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)以及环氧酶-2(COX-2)的蛋白质表达呈现出了抑制效果。

(4)信使核糖核酸(mRNA)分离以及实时聚合酶链反应(Real-time PCR)分析

将细胞株RAW 264.7、B16F10以及HacaT以3×10⁵个细胞/孔的量添加到6孔板(well plate)，并在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂条件进行了24小时的培养。接下来将培养液更换成未添加血清的改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)，然后为了诱导细胞的验证、美白处理、皱纹改善反应，RAW 264.7利用脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)而B16F10利用α-黑素细胞刺激素(Alpha-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)处理成1ppm/孔并利用不同浓度的各个试料溶液进行处理，接下来在37℃、5％CO₂的培养箱(incubator)中进行了24小时的培养。对于HacaT细胞，在利用磷酸盐缓冲液(PBS)对除未处理组之外的所有试验组进行1次洗涤之后投入磷酸盐缓冲液(PBS)并照射了紫外线-B(UV-B)(300mJ/㎝²)。在照射之后利用不同浓度的试料溶液进行处理并培养24～48小时。接下来在移除培养基之后利用磷酸盐缓冲液(PBS)进行1次洗涤，然后将TRI-Solution添加至1ml/孔而使细胞完全溶解，接下来移动到新的试管并在常温下进行5分钟的培养。接下来在向每个试管添加三氯甲烷(chloroform)并强烈地漩涡振荡(vortex)之后再进行5分钟的培养。接下来在4℃下以12000rpm进行20分钟的离心分离，然后将透明的上清液500μl移动到新的试管。在向上清液添加500μl的异丙醇(Isopropyl alcohol)并倒转(inverting)多次之后进行5分钟的培养，然后在4℃下以12000rpm进行20分钟的离心分离并移除上清液。利用1ml的75％乙醇(ethanol)对残留在底部的颗粒进行洗涤之后完全干燥，接下来利用50μl的焦碳酸二乙酯水(DEPC water)进行溶解。接下来执行利用吸光度的核糖核酸(RNA)定量，然后利用TProfessional basic thermocycler设备合成出互补脱氧核糖核酸(cDNA)。接下来利用power SYBR green PCR master mix试剂以及各个引物(primer)、互补脱氧核糖核酸(cDNA)，通过step one real-time pcr system设备重复执行40次在95℃下10秒、60℃下15秒、72℃下20秒的反应温度循环条件，再通过分析程序(analysis program)执行定量分析。在试验中所适用的序列(sequence)如下述表3所示。

表3

因为与现有的聚合酶链反应(PCR)相比能够实现快速测定且污染率较低，因此实时聚合酶链反应(Real-time PCR)被广泛使用。通过上述蛋白质印迹法(Western blot)试验以及抗氧化试验的结果可以确认乙醇提取物(AIE)的功效最佳，因此在本试验中选择乙醇提取物(AIE)进行了试验。利用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)测定出的乙醇提取物(AIE)对诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的信使核糖核酸(mRNA)表达抑制率结果如图6a所示。

如图6a所示，乙醇提取物(AIE)在最高浓度即100μg/ml下的诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达抑制效果达到97.49％。

<试验例6-印度苦楝树叶提取物的美白功效测定>

(1)黑色素瘤细胞(Melanoma cell，B16F10)的细胞毒性确认

通过噻唑蓝比色法(MTT assay)对在印度苦楝树(70％乙醇提取)中的黑色素瘤细胞(Melanoma cell)的细胞生存率进行确认的结果如图6b所示。

如图6b所示，乙醇提取物(AIE)在2.5、5、10、25μg/ml的浓度下均呈现出了85％以上的生存率，而蛋白质印迹法(Western blot)在设定为靠前的3个区间之后进行了试验。

(2)通过蛋白质印迹法(Western blot)确认酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)以及酪氨酸酶(Tyrosinase)表达抑制

参与黑色素(Melanin)的生物合成的α-黑素细胞刺激素(Alpha-Melanocyte-stimulating hormone，α-MSH)与用于激活环磷酸腺苷(cAMP)路径的黑素皮质素-1受体(melanocortin-1receptor，MC1R)一起对黑色素(melanin)的合成进行调节，当细胞中的环磷酸腺苷(cAMP)持续增加时，环磷酸腺苷依赖性蛋白激酶A(PKA，cAMP-dependent proteinkinase or protein kinase A)将使环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB，cAMP ResponseElement Binding Protein)磷酸化，从而使对酪氨酸酶(Tyrosinase)的基因表达进行诱导的小眼畸形相关转录因子(MITF)的表达增加。为了确认印度苦楝树提取物对黑色素(melanin)生成造成的影响，通过蛋白质印迹法(Western blot)试验确认了对黑色素生成造成影响的因子(酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)、酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)以及酪氨酸酶(Tyrosinase))，其结果如图6c所示。

如图6c所示，通过黑色素形成抑制相关的试验结果可以确认，乙醇提取物(AIE)在利用α-黑素细胞刺激素(α-MSH)诱导的最高浓度即10μg/ml中对酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)呈现出了36.35％的抑制率，而对剩余的其他因子即酪氨酸酶相关蛋白-2(TRP-2)以及酪氨酸酶(Tyrosinase)没有呈现出抑制效果。

(3)通过实时聚合酶连锁反应(Real-time PCR)确认酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)表达抑制

利用实时聚合酶链反应(Real-time PCR)测定出的乙醇提取物(AIE)对酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)的信使核糖核酸(mRNA)表达抑制率结果如图6d所示。

如图6d所示，乙醇提取物(AIE)在最高浓度即100μg/ml下的酪氨酸酶相关蛋白-1(TRP-1)表达抑制效果为87.43％，与作为对照组的熊果苷(Arbutin)在100μg/ml浓度下的14.86％呈现出了更高的抑制效果。

<试验例7-印度苦楝树叶提取物的皱纹改善功效测定>

(1)人角质形成细胞(Human keratinocyte cell，HacaT)的细胞毒性确认

通过噻唑蓝比色法(MTT assay)对在印度苦楝树(70％乙醇提取)中的人角质形成细胞(Human keratinocyte cell)的细胞生存率进行确认的结果如图7(a)所示。

如图7(b)所示，乙醇提取物(AIE)在1、2.5、5、10、25μg/ml的浓度下呈现出了90％以上的生存率，而蛋白质印迹法(Western blot)在设定为2.5、5、10μg/ml的3个区间之后进行了试验。

(2)通过蛋白质印迹法(Western blot)确认基质金属蛋白酶(MMP-1)以及丝聚合蛋白(Fliaggrin)的蛋白质表达

基质金属蛋白酶(MMPs)是从包括皮肤的纤维芽细胞、角质形成细胞在内的多种细胞分泌，目前为止已发现了约20多种类型。基质金属蛋白酶-1(MMP-1)为I型胶原酶(Collagenase 1)，以I型以及III型胶原蛋白为基质。被称之为丝聚合蛋白原(Profilaggrin)的前驱体是角质形成细胞的主要特征即角质透明蛋白颗粒细胞，会在体内积聚。在本试验中对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)以及丝聚合蛋白(Fliaggrin)的蛋白质表达进行了确认，其结果如图7(b)所示。

如图7(b)所示，可以确认乙醇提取物(AIE)在最高浓度即10μg/ml下对基质金属蛋白酶-1(MMP-1)呈现出了9.93％的抑制率，而对丝聚合蛋白(Filaggrin)呈现出了32.52％的保湿效果。

<试验例8-印度苦楝树叶提取物的抗污染(anti-pollution)功效测定>

(1)细胞毒性确认

通过噻唑蓝比色法(MTT assay)对在印度苦楝树(70％乙醇提取)中的角质形成细胞(HaCaT cell)、纤维芽细胞(CCD-986sk cell)的细胞生存率进行确认的结果如图8所示。

如图8(a)所示，角质形成细胞(HaCaT cell)在乙醇提取物(AIE)的5、10、25、50、100μg/ml浓度下呈现出了90％以上的生存率(其中，C代表没有利用紫外线-B(UV-B)进行处理的组。数据为3个独立试验的平均值±标准偏差(SD)。与对照组相比具有显著性差异。*p<0.05,**p<0.01)。

如图8(b)所示，纤维芽细胞(CCD-986sk cell)在乙醇提取物(AIE)的5、10、25、50、100μg/ml浓度下呈现出了90％以上的生存率(其中，C代表仅利用改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)进行处理的组。数据为3个独立试验的平均值±标准偏差(SD)。与对照组相比具有显著性差异。*p<0.05,**p<0.01)。

(2)通过皮肤细胞保护确认抗污染(anti-pollution)功效

对于角质形成细胞即HaCaT细胞以及纤维芽细胞即CCD-986sk细胞，分别利用印度苦楝树70％乙醇提取物(70％ethanol extracts)执行了抗污染效果试验。

1)首先将HaCaT细胞以1×10⁴个细胞/孔的量在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂条件进行了24小时的培养。接下来将培养液更换成未添加血清的改良杜氏伊戈尔培养基(DMEM)，并通过利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene，BP)进行处理而完成刺激。接下来，利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene，BP)处理成100ppm/孔并利用不同浓度的各个试料溶液进行处理，然后在培养箱(incubator)中以37℃、5％CO₂的条件进行了24小时的培养。接下来，以20μl/孔的量添加制备成2.5㎎/ml浓度的3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)溶液并在培养3～4小时之后移除培养液，然后以100μl/孔的量添加二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)并在室温下进行10分钟的反应，接下来通过在540nm下测定吸光度而导出了结果。

2)对于CCD-986sk细胞，按照与上述相同方式执行了利用苯并a芘(BP)的抗污染试验，并在利用150ppm/孔的细微粉尘替代苯并a芘(BP)之后执行了抗污染试验。

其结果如图9所示。

如图9(a)所示，在仅利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)对细胞进行处理时呈现出了约30％的杀灭率，而在利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)进行处理的细胞上再利用5、10、25、50、100μg/ml浓度的印度苦楝树提取物进行处理时，与仅利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)进行处理的细胞相比在25μg/ml以上的浓度下呈现出了90％以上的改善效果(其中，N代表没有利用苯并a芘进行处理的组，C代表仅利用苯并a芘进行处理的组。数据为3个独立试验的平均值±标准偏差(SD)。与对照组相比具有显著性差异。*p<0.05,**p<0.01)。

如图9(b)所示，在仅利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)对CCD-986sk细胞进行处理时呈现出了约31％的杀灭率，而在利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)进行处理的细胞上再利用5、10、25、50、100μg/ml浓度的印度苦楝树提取物进行处理时，与仅利用苯并a芘(Benzo[α]pyrene)进行处理的细胞相比在25μg/ml以上的浓度下呈现出了80％以上的改善效果(其中，N代表没有利用苯并a芘进行处理的组，C代表仅利用苯并a芘进行处理的组。数据为3个独立试验的平均值±标准偏差(SD)。与对照组相比具有显著性差异。*p<0.05,**p<0.01)。

如图9(c)所示，在仅利用细微粉尘对CCD-986sk细胞进行处理时呈现出了约23％的杀灭率，而在利用细微粉尘进行处理的细胞上再利用5、10、25、50、100μg/ml浓度的印度苦楝树提取物进行处理时，与仅利用细微粉尘进行处理的细胞相比在100μg/ml的浓度下呈现出了85％以上的改善效果(其中，N代表没有利用细微粉尘进行处理的组，C代表仅利用细微粉尘进行处理的组。数据为3个独立试验的平均值±标准偏差(SD)。与对照组相比具有显著性差异。*p<0.05,**p<0.01)。

(3)通过透明质酸分解防止确认抗污染(anti-pollution)功效

为了确认印度苦楝树70％乙醇提取物(70％ethanol extracts)是否能够保护参与皮肤保湿的透明质酸免受重金属的侵害，使铁粉(325㎎)和印度苦楝树70％乙醇提取物(70％ethanol extracts)0.5g以及乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)发生反应。

表4

通过测定透明质酸的粘度而确认透明质酸的分解防止效果，其结果如下述表4所示。因为当透明质酸因为重金属而发生分解时溶液的粘度会有所降低，因此粘度越低就代表越多的透明质酸发生了分解。如上述表4所示，与通常在吸附重金属时所适用的络合物形成物质即乙二胺四乙酸二钠(EDTA-2Na)相比，包含印度苦楝树提取物时与铁结合的效果更佳良好，即所测定到的粘度更高。借此，能够确认印度苦楝树提取物能够进一步提升透明质酸分解防止效果。

<试验例9-皮克林乳液的制造及稳定性测定>

(1)皮克林乳液的制造原料

作为皮克林乳液(Pickering emulsion)剂型的添加相，使用了没有进行涂层处理的二氧化硅(Silica)(Silica silylate,CABOT)。水相作为保湿剂使用了甘油(Glycerin)(Vegetable Glycerin，LG H&H)、1,3-丁二醇(1,3-BG)(1,3-Butylene Glycol，Cosnet)以及丙二醇(Propandiol)(1,3-Propanediol，USA)。作为抗氧化剂使用了维生素C(VitaminC)(L-ascorbic acid，DAEJUNG)。作为防腐剂使用了己二醇(Hexanediol)(1,2-Hexanediol，K1Solution)以及乙基己基甘油(Ethylhexylglycerin)(Ethylhexylglycerin，K1Solution)。

(2)皮克林乳液的制造

为了制造出气包油型乳液(W/A emulsion)，在按照下述表5对水相进行计量之后将粉末形态的甲硅烷基化硅石(Silica Silylate)投入到粉碎机并以15,500rpm进行1分钟的粉碎，接下来转移到烧杯并利用Agi混合器(Agi mixer)以500rpm进行3分钟的处理，从而制造出粉末精华形态的皮克林乳液(图10)。

表5

在本实施例中通过保湿剂与pH调节、L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的含量，选择皮克林乳液的形成状态最佳的含量进行了制造。皮克林乳液能够通过利用水相包裹二氧化硅(Silica)成分而阻挡空气并提升其稳定性。因此，可以认为皮克林乳液的复合保湿剂以及L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)含量对氧化稳定性起到重要的作用。在接下来的试验例中，对不同的原料组合下的剂型变化进行了确认。

(3)不同的保湿剂(甘油，Glycerin)含量下的剂型变化

对作为保湿剂使用的甘油(Glycerin)的不同含量下的粉末形成进行了确认。在按照如下述表6所示的含量将甘油(Glycerin)以10％为单位逐渐增加至70％时的剂型变化结果如图11(a)所示，如图11(a)所示，即使是所添加的甘油(Glycerin)含量达到70％也能够顺利地制造出粉末剂型。

表6

(4)不同的保湿剂(1,-3丁二醇，1,3-Butylene Glycol)含量下的剂型变化

对作为保湿剂使用的1,-3丁二醇(1,3-Butylene Glycol，1,3-BG)的不同含量下的粉末形成进行了确认。在按照如表7所示的含量将1,-3丁二醇(1,3-BG)以10％为单位逐渐增加至40％时的剂型变化结果如图11(b)所示，如图11(b)所示，即使是所添加的1,-3丁二醇(1,3-BG)以含量达到30％也能够顺利地制造出粉末剂型。

表7

(5)不同的保湿剂(丙二醇，Propandiol)含量下的剂型变化

对作为保湿剂使用的丙二醇(Propandiol)的不同含量下的粉末形成进行了确认。在按照如表8所示的含量将丙二醇(Propandiol)以10％为单位逐渐增加至50％时的剂型变化结果如图11(c)所示，如图11(c)所示，即使是所添加的丙二醇(Propandiol)含量达到40％也能够顺利地制造出粉末剂型。

表8

(6)不同的复合保湿剂含量下的经表皮失水(TEWL)水分蒸发测定结果

在按照如表9所示的含量对作为保湿剂使用的甘油(Glycerin)、1,3-丁二醇(1,3-Butylene glycol)以及丙二醇(Propandiol)进行混合之后按照A、B、C、D对粉末形成进行了确认。如图12所示，在利用经表皮失水(TEWL)水分蒸发测定仪对经表皮失水量的差异进行测定时，与作为对照组使用的水相比，在4小时之后的失水量在A、B、C、D中分别为15.93、4.06、18.86、12.6g/m²/h，其失水量较低，且其中复合保湿剂C的保湿力最佳，因此在接下来的试验中使用了复合保湿剂C。

表9

(7)不同的pH下的剂型变化

利用柠檬酸(Citric acid)和L-精氨酸(L-arginine)按照如表10所示的方式将水相的pH调整至3～10，并对不同的pH下的二氧化硅(Silica)的皮克林乳液(Pickeringemulsion)剂型的形成状态进行确认，其结果如图13(a)所示。如图13(a)所示，在pH为3～9时能够形成乳液(emulsion)，而在pH为10时会出现附着在壁面上的情况。因此，在接下来的试验中将pH的范围定为3～9。

表10

(8)L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)原料在不同的pH含量下的剂型变化

在将L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)剂量为1％并对水相的pH分别进行测定，如表11所示，A的pH测定值为2.98，而B则利用L-精氨酸(L-arginine)将pH调节至6.5，接下来在45℃的腔室中放置一周之后进行测定，其结果如图13(b)所示。如图13(b)所示，B的稳定性受到的破坏，而A与第一天进行比较时呈现出了类似的结果。因此，在接下来的试验中将投入L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)之后的pH调整至2～4。

表11

(9)不同的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)含量下的剂型变化

为了确认不同的L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)(维生素C)含量下的剂型变化而进行了试验。在如表12所示地将L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)含量增加到2.00％、5.00％、10.00％、15.00％的结果如图13(c)所示，即使是添加到10％也能够稳定地形成粉末剂型。

表12

(10)不同的温度及时间下的pH测定

皮肤的pH能够通过对皮肤的皮脂膜进行测定而得出，大体上包含于弱酸性范围之内。当超出如上所述的范围时，皮肤中的微生物增殖将变得活跃且可能会导致刺激、感染以及瘙痒等症状。因此，化妆品必须在如上所述的pH范围内制造并维持相应的pH状态。为了对按照如表5所示的组成制造的皮克林乳液组合物的pH变化进行测定，在60天内维持25℃的温度以及暗室条件的情况下进行了确认，其结果如下述表13所示。

表13

皮克林乳液	pH
		0天	3.6
3天	3.5
		7天	3.5
14天	3.4
		21天	3.7
28天	3.7
		1个月	3.8
2个月	3.8

(11)不同的温度及时间下的相变测定

为了对按照如表5所示的组成制造的皮克林乳液组合物的相变、变质以及分离等稳定性进行测定，在60天内维持0℃、25℃以及45℃的温度条件的情况下进行了确认，其结果如表14所示。根据所测定的结果可以确认，在45℃下L-抗坏血酸(L-ascorbic acid)的稳定性受到了破坏并变成黄色的粉末，说明其不稳定，而在其他温度即0℃以及25℃下维持了白色的粉末形态。因此可以确认，当温度提高时剂型的稳定性可能会受到破坏。

表14

皮克林乳液	0℃	25℃	45℃
				0天	○	○	○
3天	○	○	○
				7天	○	○	×
14天	○	○	×
				21天	○	○	×
28天	○	○	×
				1个月	○	○	×
2个月	○	○	×

在如上所述的各个实施例中所例示的特征、结构以及效果等，能够由具有实施例所属领域的一般知识的人员与其他实施例进行组合或变形实施。因此，与上述组合或变形相关的内容也应解释为包含在本发明的范围之内。