阅读说明：本技术 从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途 (Macrocyclic diterpenoid compounds separated from euphorbia multocida as well as preparation method and application thereof ) 是由 阿吉艾克拜尔·艾萨 奥布力喀斯木·艾散 汤丹 于 2020-06-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途,以密花大戟(<I>E.glomerulans</I>)的全草为原料,用有机溶剂提取,通过溶剂萃取法、正相硅胶柱层析法、反相硅胶柱层析法、Sephadex LH-20凝胶柱层析法中的三种至四种方法进行分离,得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)三个新的假白榄烷型大环二萜类化合物,并对这式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)三个化合物进行了抗肿瘤多药耐药逆转活性测定,结果表明：所述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)三个新的假白榄烷型大环二萜类化合物具有不同程度的抗肿瘤多药耐药逆转活性,与抗肿瘤药物联合使用可不同程度地逆转肿瘤耐药细胞对抗肿瘤药物的耐药性,可用于制备抗肿瘤多药耐药逆转药物。(The invention relates to macrocyclic diterpenoid compounds isolated from euphorbia multocida, a preparation method and application thereof, namely euphorbia multocida (A) E.glomerulans ) The whole plant is taken as a raw material, is extracted by an organic solvent, and is separated by three to four methods of a solvent extraction method, a normal phase silica gel column chromatography, a reverse phase silica gel column chromatography and a Sephadex LH-20 gel column chromatography to obtain three new pseudo-bruane-type macrocyclic compounds of a formula (I), a formula (II) and a formula (III)Diterpenoid compounds, and the determination of the anti-tumor multi-drug resistance reversal activity of the three compounds of the formula (I), the formula (II) and the formula (III) shows that: the three new pseudo-bruane macrocyclic diterpenoid compounds of the formula (I), the formula (II) and the formula (III) have anti-tumor multi-drug resistance reversing activities with different degrees, can reverse the drug resistance of tumor drug-resistant cells to anti-tumor drugs with different degrees when being used together with anti-tumor drugs, and can be used for preparing the anti-tumor multi-drug resistance reversing drugs.)

从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体涉及密花大戟中的三个新的大环二萜类化合物及其在制备肿瘤多药耐药逆转药物或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物中的用途。

背景技术

大戟属(Euphorbia L.)植物具有重要的药用价值，在治疗肿瘤方面也有广泛的应用。从大戟属植物中分离得到的化合物主要有倍半萜、二萜、三萜等类型，其中研究报道最多的是二萜类成分。二萜类化合物具有抗肿瘤、抗病毒、抗菌等活性，对抗癌药物的研究具有重要价值。密花大戟(Euphoria Glomerulans)是大戟科大戟属多年生草本植物。现主要分布于中亚和新疆奇台、乌鲁木齐、霍城、巩留等地。目前为止对密花大戟药效作用的物质基础尚未阐明。因此，对密花大戟中的大环二萜类成分进行系统的研究，明确其药理活性的物质基础，发现特异活性的二萜新化合物，具有重要意义。

大戟属(Euphorbia L.)植物富含大环二萜类成分。大环二萜类化合物，即分子中含有六元以上环状结构的二萜类化合物，骨架结构丰富多变，生物活性多种多样，包括细胞毒、多药耐药逆转、抗菌、抗HIV病毒等活性。目前已经发现的假白榄烷(Jatrophane)二萜的数量最多，假白榄烷二萜的结构特点是骨架由一个五元环和一个十二元环稠合而成，即5/12环系。经过前期研究发现，假白榄烷二萜通常是高氧化态并普遍具有分子量700以上的较大分子结构，其结构之所以丰富，是因为在骨架上常具有各种取代基，如乙酰氧基、丙酰氧基、苯甲酰氧基、异丁酰氧基、吡啶酰氧-3-基等。这些取代基在环上的位置不同，数目不同，构型不同，形成了这类化合物的丰富多变性。其构效关系研究表明，骨架上取代基对其药理作用影响比较大，所以假白榄烷型化合物取代方式决定了该类化合物的新颖性。

肿瘤多药耐药(multidrug resistance，MDR)，即一种药物作用于肿瘤使之产生耐药性后，该肿瘤对从未接触、结构无关、靶点不同、机制各异的多种抗肿瘤药也具有交叉耐药性的现象。MDR有多种形成机制，其中最主要的机制之一是ABC家族转运蛋白(目前研究最广泛、最深入的为ABCB1基因编码的P-糖蛋白，P-gp)的过表达，导致药物外排增加，形成耐药性。近年来，许多从大戟属植物中分离得到的大环二萜类化合物被发现具有显著的抗肿瘤多药耐药逆转活性，因而成为研究热点之一。

发明内容

本发明的目的在于，提供一种从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途。以密花大戟(Euphoria Glomerulans)的全草为原料，用溶剂提取，通过溶剂萃取法、正相柱层析法、反相柱层析法、Sephadex LH-20凝胶柱层析法中的两种至三种方法进行分离，得到式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)3个新的假白榄烷型大环二萜类化合物。本发明对所述的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)假白榄烷型大环二萜类化合物进行了体外细胞毒活性测定及多药耐药逆转活性测定。结果表明：所述新的式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物萜类化合物具有不同程度的抗肿瘤多药耐药逆转活性，可用于制备抗肿瘤多药耐药逆转药物中的应用，或将其与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。

本发明所述的一种从密花大戟中分离的大环二萜类化合物，该化合物的结构式为：

其中：式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3，7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；

式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮；

式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮。

所述从密花大戟中分离的大环二萜类化合物的制备方法，按下列步骤进行：

a、以密花大戟全草为原料，粉碎后，在室温下，用5-10倍量体积浓度为50-99％的乙醇溶液、无水乙醇，体积浓度为50-99％的甲醇溶液、无水甲醇、纯丙酮或体积浓度为50-99％的丙酮溶液进行室温下的渗漉、冷浸或加热回流提取，真空浓缩得到密花大戟粗提物；

b、将步骤a得到的粗提物用乙腈分散，再加入环己烷、正己烷或石油醚萃取，再加入乙腈萃取2-5次，将乙腈萃取液真空蒸干溶剂浓缩，得到萃取物浸膏；

或将步骤a得到的粗提物用石油醚、正己烷或环己烷分散，再加入乙腈萃取2-5次，将乙腈萃取液真空蒸干溶剂浓缩，得到萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏经正相硅胶柱层析、反相硅胶柱层析、SephadexLH-20凝胶柱层析，制备反相柱层析法中的三种或四种进行分离，即得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮。

步骤c中所用正相硅胶柱层析法为常压或加压柱层析，其填料为硅胶，其洗脱剂为体积比100:1-0:1的石油醚、环己烷、正己烷、丙酮、三氯甲烷、乙酸乙酯、甲醇中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。

步骤c中所用反相柱层析法为常压或加压柱层析，洗脱剂为体积浓度为30-99％的甲醇溶液或10-99％的乙腈溶液或10-99％的乙腈-甲醇-水混合溶液，采用等度洗脱或梯度洗脱。

步骤c中所用Sephadex LH-20凝胶柱层析法为常压柱层析，洗脱剂为体积比1:1的甲醇、二氯甲烷、三氯甲烷中至少两种溶剂的混合物，采用等度洗脱或梯度洗脱。

所述从密花大戟中分离的大环二萜类化合物在制备肿瘤多药耐药逆转药物中的用途。

所述密花大戟中的大环二萜类化合物，式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物在制备与抗肿瘤药物组合的药物中的用途。

本发明所述的从密花大戟中分离的大环二萜类化合物及其制备方法和用途，通过所述方法获得的3个新的大环二萜类化合物经过肿瘤多药耐药逆转活性测定，实验结果表明：所述式(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物能够不同程度地抑制耐药细胞中P-糖蛋白介导的药物排外作用，从而表现出乳腺癌多药耐药逆转活性，可用于制备抗肿瘤多药耐药逆转药物或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤组合药物。

本发明所述的密花大戟中的大环二萜类化合物，可通过从植物中分离纯化得到，也可以经本领域技术人员熟知的化学修饰方法合成获得。

本发明所述的密花大戟中的大环二萜类化合物，采用高分辨质谱、一维和二维核磁共振谱等现代波谱手段确定其结构，结构鉴定过程如下：

式(Ⅰ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D+87(c 0.2,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)230(4.06)nm；ECD(MeOH)214(Δε-4.31)，235(Δε+7.61)，255(Δε+0.22)，301(Δε+3.13)nm；HRESI(+)MS给出准分子离子峰m/z 697.2610[M+Na]⁺(计算值为C₃₈H₄₂O₁₁Na 697.2625)，确定其分子式为C₃₈H₄₂O₁₁；根据¹H，¹³C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，其¹H和¹³C NMR数据归属见表1[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅱ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D-5(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)230(4.04)nm；ECD(MeOH)218(Δε-1.69),220(Δε-1.77),237(Δε+2.08),254(Δε-0.47),301(Δε+0.69)nm；根据HRESI(+)MS(m/z 757.2831[M+Na]⁺，计算值为C₄₀H₄₆O₁₃Na757.2836)确定其分子式为C₄₀H₄₆O₁₃；根据¹H，¹³C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯。其¹H和¹³CNMR数据归属见表1[600MHz(¹H)，150MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

式(Ⅲ)化合物为白色无定型粉末，[α]25D+91(c 0.1,MeOH)；UV(MeOH)λ_max(logε)229(4.26)nm；ECD(MeOH)203(Δε+0.81),217(Δε-12.94),236(Δε-0.43),245(Δε-0.83),299(Δε+4.71)nm；根据其¹³C NMR和HRESI(+)MS(m/z 663.2771[M+Na]⁺，理论值C₃₅H₄₄O₁₁Na 663.2781)数据确定其分子式为C₃₅H₄₄O₁₁；根据¹H，¹³C NMR以及二维核磁共振数据确定其结构，骨架类型为假白榄烷(Jatrophane)型，命名为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧基-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯。其¹H和¹³C NMR数据归属见表1[400MHz(¹H)，100MHz(¹³C)，溶剂：CDCl₃]。

表1.(Ⅰ)、式(Ⅱ)和式(Ⅲ)化合物的¹H和¹³C NMR数据[δ(ppm),J(Hz)]

附图说明

图1为本发明所述式(Ⅰ)化合物的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)谱图；

图2为本发明所述式(Ⅰ)化合物的¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)谱图；

图3为本发明所述式(Ⅱ)化合物的¹H NMR(600MHz,CDCl₃)谱图；

图4为本发明所述式(Ⅱ)化合物的¹³C NMR(150MHz,CDCl₃)谱图；

图5为本发明所述式(Ⅲ)化合物的¹H NMR(400MHz,CDCl₃)谱图；

图6为本发明所述式(Ⅲ)化合物的¹³C NMR(100MHz,CDCl₃)谱图。

具体实施方式

实施例1

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用30L丙酮渗漉法提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用乙腈分散，加入环己烷进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用石油醚-乙酸乙酯＝100:1-0:1为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，其中第F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿-丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；F9E再经Sephadex LH-20柱层析，体积比1:1的氯仿:甲醇分离，得到组分F9E1-F9E5；其中F9E3段经制备反相柱C₁₈ 5μm 150×10mm分离，以体积比48:52乙腈:水混合溶液为洗脱剂，等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将第F12段组分经Sephadex LH-20柱体积比1:1氯仿:甲醇层析分离，得到组分F12A-F12E；其中F12BC再经制备反相柱C₁₈ 5μm 150×10mm分离，以体积比50:50的乙腈:水混合溶液为洗脱剂，等度洗脱，得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例2

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用50L无水甲醇渗漉法提取，减压蒸干溶剂，得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用乙腈分散，加入正己烷进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的环己烷:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分(F1-F16)，其中第F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；F9E再经Sephadex LH-20柱层析分离，用甲醇洗脱得到组分F9E1-F9E5；其中F9E3段经制备反相柱C₁₈ 5μm 150×10mm分离，以浓度为48％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将第F12段组分经Sephadex LH-20柱层析分离，用甲醇洗脱得到组分F12A-F12E；其中将F12BC组分经RP-18反相柱分离，以浓度为20％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集50％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为57％的乙腈-水溶液等度洗脱得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例3

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用60L浓度为80％的甲醇-水溶液冷浸提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用正己烷分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，其中第F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；将F9E组分经RP-18反相柱分离，以浓度为30％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为48％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将F12段组分经Sephadex LH-20柱层析分离，用甲醇洗脱得到组分F12A-F12E；其中将F12BC组分经RP-18反相柱分离，以浓度为30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集55％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为57％的乙腈-水溶液等度洗脱得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例4

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用50L无水乙醇渗漉提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用石油醚分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的石油醚:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，将F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；将F9E组分经RP-18反相柱分离，以浓度为30％-100％的乙腈-水溶液梯度洗脱，收集50％乙腈-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱C₁₈ 5μm10×250mm分离，以浓度为48％的乙腈-水溶液等度洗脱得到(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将F12段组分经Sephadex LH-20柱层析分离，用体积比为1:1的二氯甲烷:甲醇洗脱，得到组分F12A-F12E；将F12BC组分用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为50％的乙腈-水溶液等度洗脱得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例5

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用60L的浓度为70％的乙醇-水溶液冷浸提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用环己烷分散，加入乙腈进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的环己烷:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，将F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；将F9E组分经RP-18反相柱分离，以浓度为40％-100％的甲醇-水溶液梯度洗脱，收集60％甲醇-水溶液的洗脱液，减压蒸干后采用制备反相柱C₁₈ 5μm10×250mm分离，以浓度为68％的甲醇-水溶液等度洗脱得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将F12段组分经Sephadex LH-20柱层析分离，用体积比为1:1的三氯甲烷:甲醇洗脱，得到组分F12A-F12E；将F12BC组分用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为50％的乙腈-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例6

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后用70L的浓度为90％的乙醇-水溶液温度80℃下回流提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用乙腈分散，加入石油醚进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的石油醚:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，将F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；F9E再经Sephadex LH-20柱层析，无水甲醇洗脱分离，得到组分F9E1-F9E5；将F9E3段用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为68％的甲醇-水溶液等度洗脱得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将F12段组分经Sephadex LH-20柱层析分离，用体积比为1:1的三氯甲烷:甲醇洗脱，得到组分F12A-F12E；将F12BC组分用制备反相柱C₁₈ 5μm 10×250mm分离，以浓度为60％的甲醇-水溶液等度洗脱，得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例7

a、取密花大戟全草4.7kg，粉碎后室温下用40L的浓度为80％的丙酮-水溶液渗漉法提取，减压蒸干溶剂得到密花大戟粗提物浸膏；

b、将步骤a得到的粗提物浸膏用乙腈分散，加入环己烷进行萃取，合并乙腈层，减压蒸干乙腈得到乙腈萃取物浸膏；

c、将步骤b得到的乙腈萃取物浸膏用正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的正己烷:乙酸乙酯为溶剂系统进行梯度洗脱，流分经硅胶薄层层析(TLC)分析，合并相同流分，得到16段组分F1-F16，将第F9段组分经正相硅胶柱分离，用体积比100:1-0:1的氯仿:丙酮为溶剂系统进行梯度洗脱，得到组分F9A-F9J；F9E再经Sephadex LH-20柱层析，体积比1:1的二氯甲烷:甲醇洗脱分离，得到组分F9E1-F9E5；将F9E3段经制备反相柱C₁₈ 5μm 150×10mm分离，以体积比48:52的乙腈:水混合溶液为洗脱剂，等度洗脱，得到式(Ⅰ)化合物为(2S^*,3S^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,15R^*)-3,7-二苯甲酰氧基-15-羟基-5,8-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮，和式(Ⅲ)化合物为(2S,3S,4R,5R,7S,8R,13S,15R)-3-苯甲酰氧基-15-羟基-8-异丁酰氧-5,7-二乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9,14-二酮；将第F12段组分经Sephadex LH-20柱体积比1:1的氯仿：甲醇层析分离，得到组分F12A-F12E；将F12BC再经制备反相柱C₁₈ 5μm 150×10mm分离，以体积比50:50的乙腈:水混合溶液为洗脱剂，等度洗脱，得到式(Ⅱ)化合物为(2R^*,3R^*,4R^*,5R^*,7S^*,8R^*,13S^*,14R^*,15R^*)-5,7-二苯甲酰氧基-3,15-二羟基-2,8,14-三乙酰氧基假白榄烷-6(17),11E-二烯-9-酮。

实施例8

本发明所述的从密花大戟全草中分离的大环二萜类化合物在制备抗肿瘤多药耐药逆转药物或与抗肿瘤药物组合制备抗肿瘤药物中的用途，以人乳腺癌细胞株及其阿霉素耐药株为例；

将实施例1-7任意一种式(Ⅰ)—式(Ⅲ)化合物的细胞毒和耐药指数测试：

材料与试剂：高糖DMEM培养基购自HyClone公司；双抗、胎牛血清FBS和胰蛋白酶购自Gibco公司；噻唑蓝(MTT)购自Biosharp公司；二甲基亚砜(DMSO)购自Amresco公司；罗丹明123购于Sigma公司；盐酸阿霉素和盐酸维拉帕米购自Sigma-Aldrich公司；剩余其他试剂或溶剂均购自于天津致远化学试剂有限公司；

细胞株：人乳腺癌细胞株MCF-7及人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR(购自中国科学院上海细胞库)；

细胞培养：人乳腺癌细胞株MCF-7及其阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR在高糖DMEM完全培养基(高糖DMEM培养基+10％FBS+1％双抗)中培养；所有细胞均置于温度为37℃，CO₂浓度5％的培养箱中维持传代培养；耐药株(MCF-7/ADR细胞)在阿霉素浓度为1μg/mL的完全培养基中耐药培养2代以维持阿霉素的耐药性；随后用无阿霉素的完全培养基培养两周后方可用于实验；

实验方法：即MTT法，将处于对数生长期的MCF-7或MCF-7/ADR细胞以5×10⁴个/mL的浓度接种于96孔板(100μL/孔)，在温度37℃培养箱孵育24h后，加入供试单体化合物(20μL/孔)，设不同浓度梯度，每个梯度设3-6个复孔；另设无细胞空白对照组，溶剂二甲基亚砜(DMSO)对照组及阳性药物对照组；肿瘤细胞在温度37℃、5％CO₂条件下培养48h后弃去上清液，加入噻唑蓝(MTT)液(5mg/mL，用PBS配制，以1:9的比例与完全培养基混匀，每孔100μL)，在温度37℃、5％CO₂条件下继续培养2h；弃去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，待甲臜溶解后，用酶标仪检测各孔570nm的吸光度值(A)；按下列公式计算供试单体化合物对肿瘤细胞的存活率和抑制率：细胞存活率％＝(化合物OD-空白组OD/溶剂对照组OD-空白组OD)×100％；细胞抑制率％＝1-细胞存活率％＝[1-(化合物OD-空白组OD/溶剂对照组OD-空白组OD)]×100％，根据每个浓度下的抑制率,用graphpad软件经公式拟合得IC₅₀；逆转倍数(RF)＝(单用DOX-IC₅₀)/(联用DOX和化合物IC₅₀)；

实验结果：密花大戟全草中分离得到的式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物对人乳腺癌细胞株MCF-7和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的存活率，见表2：

表2.密花大戟全草中式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物在10μM浓度下对人乳腺癌细胞株MCF-7和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR的存活率

由表可知，式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物在10μM浓度下对人乳腺癌细胞株MCF-7和人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR均未表现出细胞毒性(存活率＞80％)。

实施例9

式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物逆转肿瘤多药耐药活性测试：

本实验选择密花大戟全草中分得的大环二萜类化合物(Ⅰ)-(Ⅲ)与抗肿瘤药阿霉素(DOX)联用，检测联用前后对耐药细胞的生长抑制，进行多药耐药逆转活性测试；

实验方法：将处于对数生长期的人乳腺癌阿霉素耐药细胞株MCF-7/ADR细胞以5×10⁴个/mL的密度接种于96孔板(每孔100μL)，在温度37℃培养箱中孵育24h后加入阿霉素和供试单体化合物或阳性对照药维拉帕米(每孔20μL)，设不同浓度梯度，设3-6个复孔，并设空白对照组和溶剂二甲基亚砜(DMSO)对照组；肿瘤细胞在温度37℃、5％CO₂条件下培养48h后弃去上清液，加入噻唑蓝(MTT)(5mg/mL，用生理盐水配制，以1:9的比例与完全培养基混匀，每孔100μL)，在温度37℃、5％CO₂条件下继续培养2h后弃去上清液，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，待甲臜溶解后，用酶标仪检测各孔570nm的吸光度值(A)，按下列公式计算供试单体化合物对肿瘤细胞生长的抑制率：细胞活力百分比％＝(化合物OD-空白组OD/溶剂对照组OD-空白组OD)×100％；细胞抑制率％＝1-细胞活力％＝[1-(化合物OD-空白组OD/溶剂对照组OD-空白组OD)]×100％，用graphpad，经公式拟合得IC₅₀；逆转倍数(RF)＝(单用DOX-IC₅₀)/(联用DOX和化合物IC₅₀)；

实验结果：式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物与阿霉素联用对MCF-7/ADR细胞的半数抑制浓度(IC₅₀)及其逆转倍数见表3：

表3式(Ⅰ)化合物与阿霉素联用对MCF-7/ADR细胞的半数抑制浓度和逆转倍数

如表3所示，式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物与阿霉素联用后与阿霉素单独作用相比，IC₅₀值明显降低，降低程度以逆转倍数表示，式(Ⅰ)-式(Ⅲ)化合物的逆转倍数(22.16,20.80,43.63)与阳性对照药维拉帕米(29.29)相比，式(Ⅲ)化合物具有较强的逆转肿瘤多药耐药的活性。