阅读说明：本技术 瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途 (Preparation method of stellera chamaejasme total diterpene and application thereof in pharmacy ) 是由 陈道峰 赵化顶 卢燕 李国雄 于 2018-05-29 设计创作，主要内容包括：本发明属中药制药领域,涉及一种从瑞香狼毒中富集总二萜成分的方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。本发明采用高速逆流色谱的方法从瑞香科植物瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)中富集总二萜类成分,并对所得的各组分进行了主要活性成分含量测定及抗HIV活性测试,结果显示,随着瑞香烷型总二萜成分含量的增加,抗HIV活性呈明显上升趋势。当富集组分中瑞香烷型总二萜含量大于29％时,即显示极强的抗HIV活性,EC<Sub>50</Sub>值可达到0.0034μg/mL,选择指数(SI)大于5800,高效低毒,与阳性对照药物齐多夫定相比具有明显的优势。本发明建立了从瑞香狼毒中快速富集总二萜的方法,方法简单,工艺合理,回收率高,弥补了现有技术中存在的固态支持物或载体的不可逆吸附、损耗等缺点,且富集的总二萜可以用于制备抗艾滋病毒药物。(The invention belongs to the field of traditional Chinese medicine pharmacy, and relates to a method for enriching total diterpene components from stellera chamaejasme and application of the diterpene components in preparation of anti-HIV drugs. The invention adopts a high-speed counter-current chromatography method to enrich total diterpenoid components from Stellera chamaejasme L (Thlerera chamaejasme L.) which is a Thymus plant, and the obtained components are subjected to content determination of main active components and anti-HIV activity test, and the result shows that the anti-HIV activity is in a trend of obviously increasing along with the increase of the content of the daphnane total diterpenoid components. When the content of daphnane type total diterpene in the enriched component is more than 29 percent, the enriched component shows extremely strong anti-HIV activity, the EC50 value can reach 0.0034 mu g/mL, the Selection Index (SI) is more than 5800, the enriched component has high efficiency and low toxicity, and the enriched component has obvious advantages compared with a positive control medicament zidovudine. The invention establishes a method for rapidly enriching the total diterpene from the stellera chamaejasme, has simple method, reasonable process and high recovery rate, makes up the defects of irreversible adsorption, loss and the like of a solid support or a carrier in the prior art, and the enriched total diterpene can be used for preparing the anti-HIV medicament.)

瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途

技术领域

本发明属中药制药领域，涉及瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途，具体涉及一种从瑞香狼毒中富集总二萜类成分的方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。

背景技术

瑞香狼毒(Stellera chamaejasme L.)为瑞香科(Thymelaeaceae)狼毒属(Stelleralinn)多年生草本植物，俗称断肠草、馒头花、山萝卜等，其药用部位为根，广泛分布于我国北方及西南地区，其性平，味苦辛，有毒，有逐水祛痰、破积杀虫之功效。现代药理学研究表明瑞香狼毒具有抗肿瘤、抗艾滋病毒、杀虫、抗菌等功效，尤其其中的抗艾滋病毒作用，受到国内外学者的高度关注。研究表明瑞香狼毒中的二萜类成分具有极强的抗艾滋病毒活性，但其含量低，而化学合成途径又因其结构复杂难以实现。因此，若能建立一种快速从瑞香狼毒中富集二萜类化合物的方法，将对研制高效低毒的抗艾滋病毒药物具有重要的现实意义。现有技术(陈道峰等，瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途，申请号：201510489802.8，公开号：106432263A)采用溶剂提取、萃取，经减压柱色谱、凝胶柱色谱的方法得到总二萜，经实践显示存在损失大、得率低，且操作复杂、耗时长等缺陷。高速逆流色谱是一种无需固定相作为载体的快速富集色谱技术，已被证实其具回收率高，效率高，尤其适用于含量较低的成分，且能减少有机溶剂的使用量，目前已被广泛应用于天然产物的富集分离。

基于现有技术的现状，本申请的发明人拟提供一种从瑞香狼毒中快速富集总二萜类成分的高速逆流色谱方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。

发明内容

本发明的目的是基于现有技术的现状，提供瑞香狼毒总二萜的制备方法及其在制药中的用途，具体涉及从瑞香科植物瑞香狼毒中富集总二萜成分的方法及其在制备抗艾滋病毒药物中的用途。

本发明为实现上述目的采用的技术方案是：

一种从瑞香狼毒中制备抗艾滋病毒的瑞香烷型总二萜的方法，包括以下步骤：

(1)将瑞香狼毒药材与有机溶剂按适当比例混合，提取数次，合并提取液，浓缩回收溶剂并蒸干，得浸膏；

所述的有机溶剂选自甲醇、或乙醇、或乙腈、或丙酮；所述的提取方法选自加热回流提取、或闪式提取、或超声提取、或渗漉提取；

(2)将步骤(1)中所得的浸膏以水混悬后，用有机溶剂萃取数次，合并萃取液，浓缩回收溶剂并蒸干，得萃取物；所述的有机溶剂选自石油醚、或环已烷、或正已烷、或乙酸乙酯；

(3)步骤(2)中所得萃取物通过高速逆流色谱富集，以正己烷(石油醚)：乙酸乙酯：甲醇：水(1～3：1：1～3：0.4～2；v/v)的混合液为溶剂体系，充分混合后静置分层，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，根据流出液的高效液相色谱或质谱确定含有瑞香烷型二萜类的色谱峰，并收集合并所对应的流出液，浓缩，得到粗的总二萜A和B；

(4)分别以石油醚(正己烷)：乙酸乙酯：甲醇：水为1～2：1：1～1.6：1～1.4(v/v)溶剂体系对步骤(3)中所得粗的总二萜A和以石油醚(正己烷)：乙腈：水为2：0.5～1.3：0.7～1.5(v/v)溶剂体系对步骤(3)中所得粗的总二萜B继续采用高速逆流色谱分离，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，采用梯度洗脱的方式进行洗脱，根据流出液的紫外光谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，浓缩，得到含量更高的总二萜C和D；

(5)将上述步骤(1)～(4)所得的各个样品进行佛波醇-12-苯甲酰氧基-13-葵酯(1)、尼地吗啉(2)、单纯杆菌素(3)萨布毒素A(4)、胡拉毒素(5)等活性成分的含量测定和抗艾滋病毒(HIV)活性测试；结果显示，步骤(2)所得萃取物经过富集后，总二萜含量大幅度提高；同时抗艾滋病毒活性明显增强，其EC₅₀值由最初提取物的0.53μg/mL降低到0.0056μg/mL，活性增强了将近100倍，选择指数也提高了80多倍。当富集组分中瑞香烷型总二萜含量大于29％时，即显示极强的抗HIV活性，EC₅₀值可达到0.0034μg/mL，且细胞毒性较小(CC₅₀>20)，选择指数(SI)大于5800，可以用于制备抗艾滋病毒药物。

本发明建立了从瑞香狼毒中快速富集总二萜的方法，该方法简单，工艺合理，回收率高，弥补了现有技术中存在的固态支持物或载体的不可逆吸附、损耗等缺点，所得到的总二萜组分成分明确，含量高，抗艾滋病毒活性强，毒性低，适合于大规模生产。本方法可以用于瑞香狼毒中总二萜类化合物的大规模富集，所得的总二萜可以用于制备抗艾滋病毒药物。

附图说明

图1为实施例1的富集方法流程图。

图2为佛波醇-12-苯甲酰氧基-13-葵酯(1)、尼地吗啉(2)、单纯杆菌素(3)萨布毒素A(4)、胡拉毒素(5)的结构。

图3为实施例1中瑞香狼毒总二萜制备过程中各个样品的液相色谱图。

具体实施方式

实施例1：瑞香狼毒总二萜的富集方法

取瑞香狼毒药材1000g，用小型粉碎机粉碎后，加入7L 95％乙醇加热回流提取3次，每次1小时，合并提取液，浓缩蒸干，得浸膏(DFC-SC-E)174g。将浸膏分散于3L温水中，用环己烷萃取4次，每次3L，得环己烷萃取部位各(DFC-SC-C)21.7g。将所得萃取物通过高速逆流色谱富集，以正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1：1；v/v)的混合液为溶剂体系，充分混合后静置分层，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，分别用1～2倍柱体积的正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1：1；1：1：1.3：0.7；1：1：1.6：0.4；v/v)的下相洗脱，根据流出液的高效液相色谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并所对应的流出液，浓缩，得到总二萜粗提物0.65g(DFC-SC-C2)和1.51g(DFC-SC-C3)。将以上两部分分别继续进行高速逆流色谱富集，分别以正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(2：1：1.6：1.4；v/v)和正己烷：乙腈：水(2：0.7：1.3；v/v)的溶剂体系进一步的富集，根据流出液的紫外光谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，浓缩，得到瑞香狼毒总二萜34mg(DFC-SC-C21)和466mg(DFC-SC-C31)。

实施例2：瑞香狼毒总二萜的富集方法

取瑞香狼毒药材500g，用小型粉碎机粉碎后，加入3L甲醇，超声提取3次，每次30分钟，过滤，浓缩蒸干，得浸膏69g。将浸膏分散于1L温水中，用正已烷萃取4次，每次1L，得正已烷萃取部位各8g。将所得萃取物通过高速逆流色谱富集，以正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(2：1：1.5：1.5；v/v)的混合液为溶剂体系，充分混合后静置分层，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，分别用1～2倍柱体积的正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(2：1：1.5：1.5；2：1：2.1：0.9；v/v)的下相洗脱，根据流出液的高效液相色谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，得到粗总二萜0.27g和0.72g。将以上两部分分别继续进行高速逆流色谱富集，分别以石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1：1；v/v)和石油醚：乙腈：水(2：0.5：1.5；v/v)的溶剂体系进一步的富集，根据流出液的紫外光谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，浓缩，得到瑞香狼毒总二萜12mg和221mg。

实施例3：瑞香狼毒总二萜的富集方法

取瑞香狼毒药材500g，用小型粉碎机粉碎后，加入3L乙腈，闪式提取5次，每次3分钟，抽滤，浓缩蒸干，得浸膏76g。将浸膏分散于1L温水中，用乙酸乙酯萃取4次，每次1L，得乙酸乙酯萃取部位各16.2g。将所得萃取物通过高速逆流色谱富集，以石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(3：1：2：2；v/v)的混合液为溶剂体系，充分混合后静置分层，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，分别用1～2柱体积的石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(3：1：2：2；3：1：2.5：0.5；3：1：3：1；v/v)的下相洗脱，根据流出液的高效液相色谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，得到粗总二萜0.32g和0.89g。将以上两部分分别继续进行高速逆流色谱富集，分别以正己烷：乙酸乙酯：甲醇：水(2：1：1.6：1.4；v/v)和正己烷：乙腈：水(2：0.9：1.1；v/v)的溶剂体系进一步的富集，根据流出液的紫外光谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，浓缩，得到瑞香狼毒总二萜13mg和209mg。

实施例4：瑞香狼毒总二萜的富集方法

取瑞香狼毒药材500g，用小型粉碎机粉碎后，加入3L丙酮，渗漉提取3次，每次4小时，滤液浓缩蒸干，得浸膏49g。将浸膏分散于1L温水中，用石油醚萃取4次，每次1L，得石油醚萃取部位各6.1g。将所得萃取物通过高速逆流色谱富集，以石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1.2：0.8；v/v)的混合液为溶剂体系，充分混合后静置分层，上相为固定相，下相为流动相，将固定相充满高速逆流色谱的色谱柱，设定在600～1000r/min转速和水浴温度为15～30℃的条件下，以1～3mL/min的流速注入流动相，至两相溶剂在柱中达到平衡状态，进样，分别用1～2柱体积的石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(1：1：1.2：1.8；1：1：1.5：1.5；v/v)的下相洗脱，根据流出液的高效液相色谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，直到没有二萜类成分流出，得到粗总二萜0.23g和0.65g。将以上两部分分别继续进行高速逆流色谱富集，分别以石油醚：乙酸乙酯：甲醇：水(2：1：1.6：1.4；v/v)和正己烷：乙腈：水(2：0.7：1.3；v/v)的溶剂体系，进行进一步的富集，根据流出液的紫外光谱或质谱确定含有二萜类的色谱峰，收集合并含有二萜类成分的洗脱液，浓缩，得到瑞香狼毒总二萜15mg和211mg。

实施例5：

以佛波醇-12-苯甲酰氧基-13-葵酯(1)、尼地吗啉(2)、单纯杆菌素(3)萨布毒素A(4)、胡拉毒素(5)为对照品，采用UPLC-MS的方法对实例1中各个样品中主要二萜进行含量测定并对总瑞香烷型二萜进行半定量。含量测定的方法采用标准曲线法，液相色谱条件为：0～2min，乙腈：水＝50％：50％；2～42min，乙腈：水＝50％：50％～90％：10％；42～45min，乙腈：水＝90％：10％～100％：0％；45～67min，100％乙腈；流速0.3mL/min；柱温25℃；检测波长230nm；各个样品的含量如表1所示。

表1.瑞香狼毒中总二萜富集方法1中各样品得率(％)及其中二萜类成分的含量(％)

备注：NF表示未检测到；得率表示浸膏提取率或每步样品较上一步样品的得率。

实施例6：瑞香狼毒中总二萜富集方法1中各样品的抗HIV活性测试

取实施例1中得到的关键活性组分进行抗HIV活性(EC₅₀)测试和细胞毒活性(CC₅₀)测试，并计算治疗指数(SI，CC₅₀/EC₅₀)。抗HIV活性测试方法为应用HIV-1NL4-3病毒株感染MT₄细胞(感染倍数＝0.001)，同时加入不同浓度的药物，感染48小时后加入含适宜浓度药物的新鲜基质以维持细胞的正常生长，4天后采用P24ELISA试剂盒分析病毒的复制情况，实验以齐多夫定(AZT)为阳性药物；以上活性部位对MT4细胞的细胞毒作用采用细胞存活实验，通过测定代谢的活性细胞中ATP的含量，来确定细胞的存活率。结果显示(如表2所示)，当一步富集后组分中总二萜含量明显提升，样品即显示极强的抗HIV活性，EC₅₀值可达到0.0051～0.0056μg/mL，选择指数(SI)为2352～2857，进一步富集后，样品的EC₅₀值可达到0.0025～0.0034μg/mL，选择指数(SI)大于5882～8000。

表2.瑞香狼毒总二萜富集方法1中各样品的抗HIV活性与细胞毒性测试结果