阅读说明：本技术 一类4,5-二取代基胡椒碱衍生物及其制备方法和应用 (4, 5-disubstituted piperine derivatives, and preparation method and application thereof ) 是由 许敏 罗佳 袁浩洋 伍俊琪 于 2020-05-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有治疗老年痴呆症药物4,5-二取代基胡椒碱衍生物的制备方法和应用。具体涉及具有治疗老年痴呆症药物的不对称合成方法,本方法按不同的合成路线分别制备(4R,5R)、(4S,5S)、(4S,5R)或(4R,5S)4,5-二取代基胡椒碱异构体类衍生物。其中,本发明的一类衍生物具有良好的治疗老年痴呆症的活性,且未显示急性毒性,在临床上可进行口服、静脉注射、肌肉注射等方式应用。(The invention discloses a preparation method and application of a 4, 5-disubstituted piperine derivative serving as a medicament for treating senile dementia. In particular to an asymmetric synthesis method of a medicament for treating senile dementia, which respectively prepares (4R,5R), (4S,5S), (4S,5R) or (4R,5S)4, 5-disubstituted piperine isomer derivatives according to different synthesis routes. The derivatives have good activity for treating senile dementia, do not show acute toxicity, and can be clinically applied in oral administration, intravenous injection, intramuscular injection and other modes.)

一类4,5-二取代基胡椒碱衍生物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及有机合成和药物化学领域，特别是一种4,5-二取代基胡椒碱衍生物的合成方法，及其在治疗和预防阿尔茨海默病药物中的用途。

背景技术

阿尔茨海默病(AD)，又称为老年痴呆症，是一种起病隐匿的进行性发展的神经系统退行性疾病。临床表现为渐进性记忆力减退、认知功能障碍和日常行为异常等，严重影响社交、职业与生活功能，AD的病因迄今未明。近年国内外众多研究者从不同角度提出了各种发病假说，如Aβ假说、tau蛋白假说、神经递质失调假说以及慢性炎症假说等。基于这些假说，科研工作者开发了不同的药物。这些药物的作用靶点主要为乙酰胆碱酯酶(如：他克林、石杉碱甲)丁酰胆碱酯酶(如：利斯的明、加兰他敏)和N-甲基-D-天门冬氨酸(如：美金刚)，其中胆碱酯酶是抗AD的重要靶点。但是，因AD的发病机理极其复杂，现有的治疗AD药物存在副作用都较大，疗效不明显等缺点。因此，非常有必要发现新的治疗或预防AD的活性分子。

胡椒碱(piperine)是从胡椒中提取的一种天然酰胺类化合物，具有抗感染、抗氧化、免疫调节等广泛的生物活性。目前，对于胡椒碱及其衍生物的活性研究主要在于抗肿瘤、抗抑郁、降脂等方面，例如：5-(3',4'-次甲二氧苯基)-戊烯酰丙胺有优于胡椒碱的抗抑郁作用。但是，没有文献或专利关于4,5-二取代胡椒碱衍生物具有治疗或预防老年痴呆症的报道。

近期，我们课题组从胡椒属植物假荜拔的干燥茎叶中分离出胡椒生物碱的新衍生物，4,5-二取代基胡椒碱。同时，我们以胡椒碱作为底物，通过Sharpless不对称二取代基化反应、Mitsunobu反应等完成了全新的(4R,5R)、(4S,5S)、(4S,5R)和(4R,5S)-二取代基胡椒碱四种不同构型衍生物的不对称合成。胆碱酯酶活性筛选和化合物诱导的老年痴呆症斑马鱼体内筛选提示，只有4R,5S-二取代基胡椒碱能显著改善老年痴呆症斑马鱼的认知和反应能力，且不抑制胆碱酯酶的活性，该研究结果表明4R,5S-二取代基胡椒碱有可能有新的抗AD作用机制。

综上所述，本发明的创新性体现在4,5-二取代基胡椒碱衍生物是首次在天然产物中分离得到的一类全新化合物，且通过不对称合成的方法首次合成了4,5-二取代基胡椒碱(4R,5R)、(4S,5S)、(4S,5R)和(4R,5S)四种构型，进一步证明胡椒碱不具有抗AD活性，4,5-二取代基为该类衍生物的关键活性中心。本发明的优越性表现在4,5-二取代基胡椒碱不作用于AD公认的的靶点——胆碱酯酶，且4R,5S-二取代基胡椒碱在动物体内表现出优异的抗AD活性，且未显示急性毒性，提示4R,5S-二取代基胡椒碱有可能具有新的抗AD作用机制。

发明内容

本发明的目的是将胡椒碱的4位二键加成断开形成4、5位二羟基，并将4、5位羟基替换为生物电子等排体，合成一系列含有不同4、5位取代基及构型的胡椒碱类化合物。

本发明的另一目的是提供一种合成一系列含有不同4、5位取代基及构型的胡椒碱类化合物的方法。

本发明的再一目的是提供一种所述含有不同4、5位取代基及构型的胡椒碱类衍生物在制备或预防老年痴呆症药物中的应用。

本发明所述的含有不同4、5位取代基及构型的胡椒碱类衍生物具体结构如通式I所示：

其中，

R₁为芳环/芳杂环

R₂为-OH，-NH₂，-SH

R₃为-OH，-NH₂，-SH

本发明提供了一种所述含有不同4、5位取代基及构型的胡椒碱类衍生物的制备方法。该方法包括如下步骤：

以胡椒碱为底物，在铁氰化钾、碳酸钾、二水合锇酸钾和金鸡纳碱衍生物的作用下4位二键加成断开生成化合物Ⅰ；其中金鸡纳碱衍生物为(DHQ)2PHAL或(DHQD)2PHAL；溶剂为水：叔丁醇＝1:1的混合溶液。

化合物Ⅰ在底物Ⅰ、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯作用下生成化合物Ⅱ，其中，底物Ⅰ为对硝基苯甲酸或亚氨基二碳酸1-(1,1-1-二甲基乙基)酯、硫代乙酸，溶剂为二氯甲烷、四氢呋喃。

将化合物Ⅱ在底物Ⅱ作用下生成化合物Ⅲ，其中，底物Ⅱ为碳酸钾或三氟乙酸、氢化锂铝，溶剂为四氢呋喃、乙醚。

其中，生成的化合物Ⅰ即为(4R,5R)、(4S,5S)构型的4,5-二羟基胡椒碱衍生物，在对硝基苯甲酸、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯作用下转变构型生成(4S,5R)和(4R,5S)构型的4,5-二羟基胡椒碱衍生物。

本发明根据胡椒碱的4位二键加成断开形成4、5位二羟基，并将4、5位羟基替换为生物电子等排体，合成一系列含有不同4、5位取代基的胡椒碱衍生物。

化合物Ⅰ在亚氨基二碳酸1-(1,1-1-二甲基乙基)酯、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯作用下生成化合物Ⅱ，溶剂为四氢呋喃；将化合物Ⅱ在三氟乙酸作用下生成化合物Ⅲ为包含四种构型的4,5-二氨基胡椒碱，溶剂为二氯甲烷。

化合物Ⅰ在硫代乙酸、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯作用下生成化合物Ⅱ，溶剂为四氢呋喃；将化合物Ⅱ在氢化铝锂作用下生成化合物Ⅲ为包含四种构型的4,5-二巯基胡椒碱，溶剂为乙醚。

进一步地，在化合物Ⅰ的合成反应中，反应温度为室温，反应时间为12-24小时。其中胡椒碱与铁氰化钾、碳酸钾、二水合锇酸钾、鸡纳碱衍生物的物质的量之比为1～2：2.5～4.5：2.5～4.5：0.01～0.1：0.05～0.1；

进一步地，化合物Ⅰ在底物Ⅰ、三苯基膦和偶氮二羧酸二乙酯作用下生成化合物Ⅱ的反应中，反应温度为40-60℃，反应时间为4-6小时。其中化合物Ⅰ与底物Ⅰ、三苯基膦、偶氮二羧酸二乙酯的物质的量之比为1～2：1～2：1～2：1～2。

进一步地，化合物Ⅱ在底物Ⅱ作用下生成化合物Ⅲ的反应中，反应温度为40～55℃，反应时间为8-10小时。

本发明还提供了一种含有4,5-二取代基胡椒碱的衍生物在制备治疗或预防阿尔茨海默病的药物中的应用。

本发明的一类衍生物具有良好的抗老年痴呆活性，在临床上可以为片剂、丸剂、胶囊剂、颗粒剂、微囊片剂、混悬剂、滴丸、口服液体、注射剂、气雾剂、吸入剂、栓剂或是皮下给药剂型中的任何一种。

进一步地，4,5-二取代基胡椒碱的衍生物为4R,5S-二取代基胡椒碱衍生物或4S,5R-二取代基胡椒碱衍生物。

本发明的有益效果是：本发明提供含有不同4、5位取代基的胡椒碱新型衍生物的制备方法，并首次发现4R,5S-二取代基胡椒碱在实验动物老年痴呆症中表现出活性的医药或大健康产品新用途。与目前治疗老年痴呆的药物相比，所述4,5-二取代基胡椒碱虽没有抑制胆碱酯酶，但4R,5S-二取代基胡椒碱在斑马鱼抗老年痴呆症实验中表现出优异的活性，这就提示我们4R,5S-二取代基胡椒碱在抗老年痴呆症中具有全新的作用机制，可用于制备预防或治疗老年痴呆症的药物。

附图说明

图1是胡椒碱及四种构型的4,5二羟基胡椒碱恢复老年痴呆症斑马鱼的移动速度的示意图。

图2是胡椒碱及四种构型的4,5二羟基胡椒碱恢复老年痴呆症斑马鱼的反应能力的示意图；

具体实施方式

本申请发明人发现，动物体内施用本发明的4,5二取代胡椒虽然不可以显著抑制胆碱酯酶，但是在化合物诱导老年痴呆症斑马鱼模型中，能显著改善老年痴呆症斑马鱼的认知和反应能力。也就是说，4,5二取代胡椒不是通过胆碱酯酶发挥抗老年痴呆作用，而是作用于其他靶点，这就意味着4,5二取代胡椒具有一个新的抗AD的机制，治疗/缓解脑功能及其障碍疾病的相关症状，而不会完全抑制所有活性，也没有出现毒副作用。

本发明的含有不同4、5位取代基的胡椒碱新型衍生物和制备方法在如下实施例中更详细地叙述，但实施例不构成对本发明的限制，基于本发明所作的任何变换或替换，均属于本发明的保护范围。

实施例1

4R,5R-二羟基胡椒碱(化合物1)的制备：

取5mL水和5mL叔丁醇，搅拌均匀作为溶剂。向混合溶剂中加入铁氰化钾(807.7mg,2.45mmol)，碳酸钾(339.1mg,2.45mmol)，二水合锇酸钾(1.3mg,3.5μmol),(DHQ)2PHAL(5.4mg,0.701mmol)后在室温下反应20min，然后加入胡椒碱(200mg,0.701mmol),将混合物在室温下搅拌24h。向混合物中加入无水亚硫酸钠(1.5443mg,12.3mmol)室温下搅拌12h，终止反应。将反应液加入到25mL水中，用乙酸乙酯(25×3mL)萃取，合并有机相真空浓缩得粗产品。通过快速柱色谱法(硅胶，DCM:MeOH＝35:1)纯化所得粗产品，得到相应的4R,5R-二羟基胡椒碱，为透明油状物，产率为44.5％(99.8mg)；¹H NMR(600MHz,MeOD)δ6.88(d,J＝1.5Hz,1H),6.80(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.76(d,J＝7.9Hz,1H),6.51(dd,J＝15.3,4.9Hz,1H),6.43(dd,J＝15.3,1.5Hz,1H),5.91(dd,J＝5.3,1.2Hz,2H),4.45(d,J＝6.7Hz,1H),4.31(ddd,J＝6.7,4.9,1.5Hz,1H),3.58–3.47(m,2H),3.43-3.37(m,2H),1.68–1.62(m,2H),1.55–1.46(m,4H)。

实施例2

4S,5S-二羟基胡椒碱(化合物2)的制备：

取5mL水和5mL叔丁醇，搅拌均匀作为溶剂。向混合溶剂中加入铁氰化钾(807.7mg,2.45mmol)，碳酸钾(339.1mg,2.45mmol)，二水合锇酸钾(1.3mg,3.5μmol)，(DHQD)2PHAL(5.4mg,0.701mmol)后在室温下反应20min，然后加入胡椒碱(200mg,0.701mmol)，将混合物在室温下搅拌24h。向混合物中加入无水亚硫酸钠(1.5443mg,12.3mmol)室温下搅拌12h。将反应液加入到25mL水中，用乙酸乙酯(25×3mL)萃取，合并有机相真空浓缩得粗产品。通过快速柱色谱法(硅胶，DCM:MeOH＝35:1)纯化所得粗产品，得到相应的4S,5S-二羟基胡椒碱，为透明油状物，产率为44.4％(99.4mg)；¹H NMR(600MHz,MeOD)δ6.90(d,J＝1.5Hz,1H),6.83(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.78(d,J＝7.9Hz,1H),6.53(dd,J＝15.3,4.9Hz,1H),6.45(dd,J＝15.3,1.5Hz,1H),5.93(dd,J＝4.9,1.5Hz,2H),4.47(d,J＝6.7Hz,1H),4.34(ddd,J＝6.7,4.9,1.5Hz,1H),3.61–3.50(m,2H),3.46–3.40(m,2H),1.70–1.65(m,2H),1.57–1.49(m,4H).

实施例3

4S,5R-二羟基胡椒碱(化合物3)的制备：

用4.5mL的THF溶解化合物1(285mg,0.893mmol)于10mL反应管中,向反应管中依次加入对硝基苯甲酸(149.2mg,0.893mmol)，三苯基膦(234.2mg,0.893mmol)搅拌均匀后抽尽反应管中空气，将反应管置于冰水浴(0℃)中，5min后在冰水浴条件下向反应管中滴加偶氮二乙酸二乙酯(141μL,0.893mmol)搅拌均匀，后将反应管在N₂保护下置于45℃油浴锅中搅拌5h。将反应液真空浓缩后通过快速柱色谱法(硅胶，P:EtOAc＝1:1+.0.1％HOAc)纯化得粗产品。通过半制备液相色谱仪(COSMUSIL 5SL-Ⅱ,正己烷：EtOAc＝10％-100％)纯化所得粗产品，得到化合物1a，为白色固体，产率为5.5％(22.9mg)。

用250μL的THF溶解化合物1a(9.3mg,19.9μmol)于5mL反应管中，向反应管中加入50μL H₂O后搅拌均匀，然后向反应管中加入碳酸钾(13.7mg,99.3μmol)搅拌均匀后置于45℃油浴锅中反应10h。然后向反应液中滴加1M HCl调节反应液PH值至弱酸性，用乙酸乙酯(3×3mL)萃取，合并有机相真空浓缩得粗产品。通过快速柱色谱法(硅胶，石油醚：EtOAc＝1:1)纯化所得粗产品，得到化合物3(4S,5R-二羟基胡椒碱)，为透明油状物，产率为41.2％(2.6mg)；¹H NMR(600MHz,MeOD)δ6.81(d,J＝1.5Hz,1H),6.73(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.67(d,J＝8.0Hz,1H,6.68–6.64(m,1H,overLap),6.38(dd,J＝15.3,1.5Hz,1H),5.82(dd,J＝2.1,1.1Hz,2H),4.47(d,J＝5.5Hz,1H),4.23(td,J＝5.3,1.5Hz,1H),3.47(t,5.5,2H),3.39(t,5.5,2H),1.61–1.56(m,2H),1.48–1.43(m,4H).

实施例4

4R,5S-二羟基胡椒碱(化合物4)的制备：

用4.5mL的THF溶解化合物2(245mg,0.767mmol)于10mL反应管中,向反应管中依次加入对硝基苯甲酸(128.5mg,0.767mmol)，三苯基膦P(201.3mg,0.76mmol)搅拌均匀后抽尽反应管中空气，将反应管置于冰水浴(0℃)中，5min后在冰水浴条件下向反应管中滴加偶氮二乙酸二乙酯(134μL,0.767mmol)搅拌均匀，后将反应管在N₂保护下置于45℃油浴锅中搅拌5h。将反应液真空浓缩后通过快速柱色谱法(硅胶，P:EtOAc＝1:1+.0.1％HOAc)纯化得粗产品。通过半制备液相色谱仪(COSMUSIL 5SL-Ⅱ,正己烷：EtOAc＝10％-100％)纯化所得粗产品，得到化合物2a，为白色固体，产率为5.0％(17.8mg)。

用250μL的THF溶解化合物2a(8.7mg,18.6μmol)于5mL反应管中，向反应管中加入50μL H₂O后搅拌均匀，然后向反应管中加入碳酸钾(12.9mg,92.9μmol)搅拌均匀后置于45℃油浴锅中反应10h。然后向反应液中滴加1M HCl调节反应液PH值至弱酸性，用乙酸乙酯(3×3mL)萃取，合并有机相真空浓缩得粗产品。通过快速柱色谱法(硅胶，石油醚：EtOAc＝1:1)纯化所得粗产品，得到化合物4(4R,5S-二羟基胡椒碱)，为透明油状物，产率为40.4％(2.4mg)；¹H NMR(600MHz,MeOD)δ6.81(d,J＝1.5Hz,1H),6.73(dd,J＝7.9,1.5Hz,1H),6.67(d,J＝7.9Hz,1H),6.68–6.64(m,1H,overLap),6.38(dd,J＝15.3,1.5Hz,1H),5.82(dd,J＝2.1,1.1Hz,2H),4.47(d,J＝5.5Hz,1H),4.23(td,J＝5.5,1.5Hz,1H),3.47(t,5.5,2H),3.39(t,5.5,2H),1.60–1.56(m,2H),1.48–1.43(m,4H).

实施例5

以实施例1-4制备得到的4R,5R-二羟基胡椒碱、4S,5S-二羟基胡椒碱、4R,5S-二羟基胡椒碱、4S,5R-二羟基胡椒碱及胡椒碱作为待测物进行抗乙酰胆碱酯酶活性测试：

取NaH₂PO₄·2H₂O 3.121g加水溶解，定溶至100mL得到0.2mol/L的NaH₂PO₄；Na₂HPO₄·12H₂O 71.64g加水溶解，定溶至1000mL得到0.2mol/L的Na₂HPO₄。取上述配制的26.5mL NaH₂PO₄和473.5mL Na₂HPO₄充分混合后，得到0.2mol/L pH＝8.0的PBS，再将此溶液稀释1倍得到0.1mol/L pH＝8.0的PBS；b.取上述配制的39mL NaH₂PO₄和61mL Na₂HPO₄充分混合后，得到0.2mol/L pH＝7.0的PBS，再将此溶液稀释1倍，得到0.1mol/L pH＝7.0PBS。

先用pH＝8.0的PBS配制成1000U/mL乙酰胆碱酯酶(AchE)的母液，再稀释成4U/mL的储备液-80℃保存，实验时再将储备液稀释成0.4U/mL的乙酰胆碱酯酶液。准确称取8.8mgATCI(碘化硫代乙酰胆碱)，溶于去离子水中，定溶至50mL，4℃放置(现配现用)；0.6mmol/LDTNB[5,5'-二硫代二(2-硝基苯甲酸)]的配制：准确称取11.9mg DTNB和0.75g NaHCO₃溶于pH＝7.0的PBS中，定溶至50mL，避光保存(现配现用)。阳性药石杉碱甲用色谱级甲醇配成10mg/mL的初始浓度，待测物用色谱级甲醇配成100mg/mL的初始浓度。实验时阳性对照和待测物均稀释为5个浓度(阳性对照：100，10，1，0.1，0.01mg/mL；待测物：100，50，25，12.5，6.25mg/mL)，每个浓度做3组平行实验。分别分为如下几个组测试：实验组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL待测物，10μL 0.4U/mL的AchE溶液，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min,然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。实验控制组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL待测物，10μL PBS(pH＝8.0),20μL0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。空白组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL甲醇，10μL 0.4U/mL的AchE溶液，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。空白对照组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL甲醇，PBS(pH＝8.0)，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。

用酶标仪在412nm处检测波长，计算抑制率公式如下：

结果表明(表1)所有测试的胡椒碱及四种构型的4,5-二羟基胡椒碱均无显著的抑制乙酰胆碱酯酶的作用。

表1：乙酰胆碱酯酶抑制活性测试

实施例6

以实施例1-4制备得到的4R,5R-二羟基胡椒碱、4S,5S-二羟基胡椒碱、4R,5S-二羟基胡椒碱、4S,5R-二羟基胡椒碱及胡椒碱作为待测物进行抗丁酰胆碱酯酶活性测试：

取NaH₂PO₄·2H₂O 3.121g加水溶解，定溶至100mL得到0.2mol/L的NaH₂PO₄；Na₂HPO₄·12H₂O 71.64g加水溶解，定溶至1000mL得到0.2mol/L的Na₂HPO₄。取上述配制的26.5mL NaH₂PO₄和473.5mL Na₂HPO₄充分混合后，得到0.2mol/L pH＝8.0的PBS，再将此溶液稀释1倍得到0.1mol/L pH＝8.0的PBS；b.取上述配制的39mL NaH₂PO₄和61mL Na₂HPO₄充分混合后，得到0.2mol/L pH＝7.0的PBS，再将此溶液稀释1倍，得到0.1mol/L pH＝7.0PBS。

先用pH＝8.0的PBS配制成1000U/mL丁酰胆碱酯酶(BchE)的母液，再稀释成4U/mL的储备液-80℃保存，实验时再将储备液稀释成0.4U/mL的丁酰胆碱酯酶液。准确称取2.5mgBTCI(碘化硫代丁酰胆碱)，溶于去离子水中，定溶至50mL，4℃放置(现配现用)；将丁酰胆碱酯酶(BChE)粉末用pH＝8.0的PBS充分溶解，配制成500U/mL母液，再稀释成8U/mL储备液-80℃保存，实验时再将储备液稀释成0.8U/mL的丁酰胆碱酯酶液；DTNB配置方法同上。阳性药他克林用色谱级甲醇配成10μM的初始浓度，实验时稀释5个梯度，每个浓度做3组平行实验。分别分为如下几个组测试：实验组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL待测物，10μL 0.4U/mL的BchE溶液，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min,然后再加20μL 0.6mmol/LATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。实验控制组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL待测物，10μL PBS(pH＝8.0),20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。空白组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL甲醇，10μL 0.4U/mL的BchE溶液，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL 0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。空白对照组：40μL PBS(pH＝8.0)，10μL甲醇，PBS(pH＝8.0)，20μL 0.6mmol/L DTNB依次加入96孔板中，37℃预孵10min，然后再加20μL0.6mmol/L ATCI于37℃恒温反应30min，然后再加50μL无水乙醇终止反应。

用酶标仪在412nm处检测波长，计算抑制率公式如下：

结果表明(表2)所有测试的胡椒碱及四种构型的4,5-二羟基胡椒碱均无显著的抑制丁酰胆碱酯酶的作用。

表2：丁酰胆碱酯酶抑制活性测试

实施例7

以实施例1-4制备得到的4R,5R-二羟基胡椒碱、4S,5S-二羟基胡椒碱、4R,5S-二羟基胡椒碱、4S,5R-二羟基胡椒碱及胡椒碱作为待测物进行体内抗老年痴呆症活性测试：

1)实验动物

实验用的斑马鱼幼鱼为斑马鱼所产胚胎自然孵育而成。养鱼用水水质：每1L反渗透水中加入200mg速溶海盐，电导率为480～510μS/cm；pH为6.9～7.2；硬度为53.7～71.6mg/L CaCO₃。实验完成后，用0.25mg/mL的三卡因甲磺酸对各个发育阶段的斑马鱼进行麻醉处死。麻醉处死的操作步骤符合美国兽医协会(AVMA)对动物麻醉处死的规范要求。

2)实验设计

本研究共设置5组实验，每组实验包括1个空白对照组、1个溶剂对照组、1个老年痴呆模型组、1个阳性对照组(多奈哌齐)、1个胡椒碱及4个4,5-二羟基胡椒碱。胡椒碱及4个4,5-二羟基胡椒碱的初筛浓度为30μM，若出现死亡或畸形，则选取3μM，进行实验。三氯化铝处理的斑马鱼为老年痴呆模型组；三氯化铝与DPZ共同处理的斑马鱼为阳性对照组；三氯化铝与待测化合物共同处理的斑马鱼为待测化合物组；0.1％的DMSO处理的斑马鱼为阴性对照组(溶剂对照组)；未处理的斑马鱼为空白对照组，每个实验组均处理30尾斑马鱼。利用行为分析仪记录60min内斑马鱼的运动轨迹，通过光暗周期性变化，黑暗10min，光照10min，60min分为三个光暗周期，然后对斑马鱼的运动速度(运动功能障碍)、明暗周期速度变化(反应能力)进行统计学分析。

活性测试结果符合质量控制标准：①整个实验过程中所有实验组均未出现斑马鱼死亡或畸形；②模型组和溶剂对照组比较具有统计学差异(p<0.001)；③所有实验中空白对照组与溶剂对照组相比无统计学差异(p>0.05)；④阳性对照组(多奈哌齐，DPZ)与模型组比较具有统计学差异(p<0.05)。

3)对老年痴呆症斑马鱼运动功能障碍的恢复作用

所有实验老年痴呆模型组斑马鱼运动速度显著下降，与溶剂对照组比较均有统计学意义(p<0.001)；阳性药(DPZ)组斑马鱼运动速度显著回升，与模型组比较具有统计学意义(p<0.01或p<0.001)。斑马鱼在60min明暗周期内，其运动速度具有规律性、周期性和稳定性。以实施例4制备得到的4R,5S-二羟基胡椒碱处理后的AD斑马鱼的运动速度与模型组相比显著提高(p<0.05,p<0.01或p<0.001)，显著恢复老年痴呆症斑马鱼的运动速度(表3和图1)。

表3：老年痴呆症斑马鱼运动速度的治疗效率

化合物名称	浓度(μg/mL)	治疗效率％	p值
				阳性对照组(多奈哌齐)	3.79	22.20	3.98E-02
胡椒碱	2.85	14.73	2.13E-01
				4R,5R-二羟基胡椒碱	3.19	3.20	7.00E-01
4S,5S-二羟基胡椒碱	3.19	12.75	3.14E-01
				4R,5S-二羟基胡椒碱	3.19	84.41	9.34E-08
4S,5R-二羟基胡椒碱	3.19	23.60	1.68E-02

4)对老年痴呆症斑马鱼反应能力的影响

所有实验中，老年痴呆模型组斑马鱼反应能力下降(明暗周期速度差值显著下降)，与溶剂对照组比较均有统计学意义(p<0.001)；阳性药(DPZ)组斑马鱼反应能力部分恢复(明暗周期速度差值显著回升)，与模型组比较具有统计学意义(p<0.05或p<0.001)。以实施例4制备得到的4R,5S-二羟基胡椒碱处理后可以不同程度的恢复AD斑马鱼的反应能力(明暗周期速度差值显著回升)，与模型组相比，统计学差异显著或极显著(p<0.05,p<0.01或p<0.001)(表4和图2)。

表4：老年痴呆症斑马鱼反应能力的治疗效率

化合物名称	浓度(μg/mL)	治疗效率％	p值
				阳性对照组(多奈哌齐)	3.79	17.53	3.98E-02
胡椒碱	2.85	9.62	2.13E-01
				4R,5R-二羟基胡椒碱	3.19	2.60	7.00E-01
4S,5S-二羟基胡椒碱	3.19	7.52	3.14E-01
				4R,5S-二羟基胡椒碱	3.19	84.93	9.34E-08
4S,5R-二羟基胡椒碱	3.19	19.02	1.68E-02

实施例8

基于药物化学生物电子等排体的概念，即如果用具有相似的物理及化学性质的基团或取代基代替实施例1-4中4,5位的羟基，将产生大致相似或相关的生物活性。因此，可以推测将4,5位羟基替换为生物电子等排体二巯基，二氨基等，合成一系列含有不同4,5位二取代基胡椒碱衍生物，也将具有和4R,5S二羟基胡椒碱相关或相似的抗老年痴呆的生物活性，作为老年痴呆症的药物。

上述实施例用来解释说明本发明，而不是对本发明进行限制，在本发明的精神和权利要求的保护范围内，对本发明做出的任何修改和改变，都落入本发明的保护范围。