一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用
阅读说明：本技术 一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用 (Phaffia yeast sugar supplement culture medium, and high-density culture method and application thereof ) 是由 陈克杰 孙新强 杨一恭 陈迎迎 周旭燕 邵东 徐作武 王小平 于 2020-04-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用,所述补糖培养基含有利于细胞增殖和虾青素合成的碳源组合,能弥补单一碳源产量低的缺点。所述高密度培养方法用在线活细胞传感仪检测活细胞浓度,通过采用指数补料结合溶氧反馈脉冲补料(DO-STAT补料)的两阶段补糖策略,达到解除克勒勃屈利效应(Crabtree效应)和降低副产物乙醇生成的目的,从而实现法夫酵母细胞的大量增殖和虾青素产量的提高。本发明提供的补糖培养基及高密度培养方法,可大幅提高法夫酵母虾青素产量水平,在100m～(3)发酵罐上虾青素产量为570.0mg/L,适用于商业化生产。(The invention provides a Phaffia rhodozyma saccharide-supplementing culture medium, a high-density culture method and application thereof, wherein the saccharide-supplementing culture medium contains a carbon source combination beneficial to cell proliferation and astaxanthin synthesis, and can make up for the defect of low yield of a single carbon source. The high-density culture method uses an online living cell sensor to detect the concentration of living cells, and achieves the aims of relieving the Crabtree effect and reducing the generation of a byproduct ethanol by adopting a two-stage sugar supplement strategy of combining index supplement with dissolved oxygen feedback pulse supplement (DO-STAT supplement), thereby realizing the mass proliferation of the Phaffia rhodozyma cells and the improvement of the yield of astaxanthin. The sugar supplement culture medium and the high-density culture method provided by the invention can greatly improve the yield level of phaffia rhodozyma astaxanthin at 100m 3 The astaxanthin yield on the fermenter was 570.0mg/L, is suitable for commercial production.)
技术领域
本发明涉及微生物发酵技术领域，具体地说是一种法夫酵母补糖培养基及其进行高密度培养的方法和应用。
背景技术
虾青素(Astaxanthin)是一种含氧类胡萝卜素，化学名为3,3′-二羟基-β,β′-胡萝卜素-4,4′-二酮，分子结构中紫罗酮环的3和3′位置各含一个手性(或不对称)中心，故可形成3S-3′S、3R-3′S、3R-3′R(也称为左旋、内消旋、右旋)3种对映异构体。虾青素具有强烈的抗氧化性能，其抗氧化能力是β-胡萝卜素的10倍，比维生素E强百倍以上，被誉为“超级维生素E”，在延缓衰老、提高免疫，防治肿瘤、心血管疾病和糖尿病等方面显示作用。
法夫酵母(Phaffia rhodozyma)作为最具有商业化生产潜能的生产菌株，其抽提物被证明具有安全性，美国食品药品监督管理局(FDA)于2010年增补其用作动物饲料添加剂，亦于2013年进入中国农业部《饲料添加剂品种目录》。随着下游水产养殖规模的扩大，市场对法夫酵母源虾青素的需求日益增长。但法夫酵母生产虾青素存在诸多问题，焦点在于以生产强度、产量水平和原料成本等为主要经济技术指标的参数离商业化生产差距较大。因此，法夫酵母实现工业化生产的关键在于利用基因重组技术对细胞代谢途径进行修饰、改造来改变细胞特性，并整合细胞基因调控、代谢调控及生化工程策略，进一步提升虾青素的生产强度。国内外对法夫酵母发酵相关的技术研究已相当广泛。公布号为CN 108913746A的专利公开了在发酵培养基中添加番茄粉，通过柠檬酸和NaOH控制pH值4.0～6.0，维持葡萄糖浓度15～35g/L，生物量达到65.9g/L，虾青素含量达到81.76mg/L。肖安风等研究了乙醇、乙酸钠、乳酸钠、柠檬酸和甘油这5种糖代谢产物对法夫酵母产虾青素的影响，认为乙酸钠、乳酸钠和柠檬酸对产虾青素有一定的促进作用，当乳酸添加量为1g/L时虾青素浓度最大达到1.54mg/L。YU-ICHI YAMANE等研究了氧含量和葡萄糖供应对法夫酵母初级代谢和虾青素生产的影响，认为呼吸速率与虾青素生产速率正相关，与乙醇生产速率负相关，并得出高C/N比提高虾青素的产量，过高葡萄糖浓度将抑制细胞增殖的结果，在此基础上提出细胞生长期控制低C/N比，虾青素生产期控制高C/N比的两阶段补糖方式。倪辉等报道，自动流加调控pH值比间歇调控pH值更有利于法夫酵母细胞的生长及虾青素合成，1m3发酵罐中试生产生物量及虾青素产量分别达到85.11g/L和279.96mg/L。上述相关研究和技术虽然对产量提高起到一定的作用，但存在以下问题：1)未充分考虑Crabtree效应对菌体生长的深刻影响；2)仅从单一因素的碳源、促进剂或环境因子等进行调控，缺乏生理过程和营养需求的动态、多尺度和全局性分析；3)未充分设计符合菌株生理特性的补料配方，并进行精细而有效的补料控制；
指数补料是希望以指数生长的方式收获菌体的前馈控制式流加方式，流加速率与操作时间呈指数形式变化，但在指数补料后期溶氧难以维持，易出现碳溢流生成乙醇。DO-STAT法以溶氧的急剧上升作为碳源流加的信号，可以将基质(碳源)浓度控制在接近于0的低水平，从而有效地抑制众多代谢副产物的生成，但较长的培养周期影响生产强度。由于虾青素是胞内产物，其产量与生物量和干菌体虾青素含量有关，因此在最佳的培养基成分及含量中保证适宜的温度、pH值、溶氧、电导率等环境条件，通过综合指数补料与DO-STAT补料的特点建立合理的流加培养工艺，降低Crabtree效应以限制或减少有害代谢产物(乙醇)的生成，可以达到高密度培养的目的，进而大幅提高虾青素的生产强度。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，针对目前法夫酵母发酵生产虾青素产量和菌体干重低的缺陷，提供一种法夫酵母补糖培养基及高密度培养方法，所述的补糖培养基及培养方法可以显著提高菌体干重进而提高虾青素产量，实现虾青素高产量、高产率和高生产强度的统一，有利于商业化生产。
本发明人采用补糖培养基及高密度培养方法，以在线活细胞传感仪检测活细胞含量，采用指数补料和DO-STAT补料相结合的补糖策略解除Crabtree效应，降低碳溢流生成的乙醇含量，从而实现法夫酵母细胞的大量增殖和虾青素产量的提高。
根据本发明的一方面，本发明提供了一种法夫酵母补糖培养基，所述补糖培养基为有利于细胞增殖的碳源和有利于虾青素合成的碳源组成的混合碳源。
在本发明的法夫酵母补糖培养基的优选技术方案中，优选地，所述有利于细胞增殖的碳源的浓度与所述有利于虾青素合成的碳源的浓度的比例为1：3～3：1。
在本发明的法夫酵母补糖培养基的优选技术方案中，优选地，所述补糖培养基的浓度为320～800(g/L)。
在本发明的法夫酵母补糖培养基的优选技术方案中，优选地，所述有利于细胞增殖的碳源包括糖蜜、和选自葡萄糖、麦芽糖和蔗糖中的一种或多种；更优选地，所述有利于细胞增殖的碳源为糖蜜和葡萄糖的组合碳源。所述有利于虾青素合成的碳源包括选自麦芽糊精、淀粉水解液、甘油和可溶性淀粉中的一种或多种，更优选地，所述有利于虾青素合成的碳源为麦芽糊精。
在本发明的法夫酵母补糖培养基的优选技术方案中，优选地，所述糖蜜浓度为20～100(g/L)。
根据本发明的另一方面，本发明提供了一种利用法夫酵母补糖培养基进行高密度培养的方法，所述高密度培养方法包括如下步骤：
a)固体培养：将法夫酵母冷冻甘油保藏液平板划线培养，以获得单菌落；
b)种子瓶培养：在固体平板上挑取单菌落，进行一级(试管)和二级种子瓶培养；
c)种子罐培养：将种子瓶培养液接种种子罐，进行一级或二级种子罐培养；
d)发酵罐培养：将种子罐培养液移种发酵罐，通入压缩空气，采用两阶段补糖工艺补加碳源，并控制相关环境和生理等工艺参数，获得高产量虾青素法夫酵母培养液。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，固体培养包括：取-80℃冰箱保藏的法夫酵母冷冻甘油保藏液，融化后用接种环蘸取解冻液，进行平板划线，培养温度17～24℃，培养4～8天长出较大单菌落。
这里，固体培养是现有技术，包括：a)平板划线及冷冻甘油保藏为微生物领域常规方法；b)固体培养基配方为报道配方(参见文献[1])；c)培养温度范围为文献通常报道温度(参见文献[1]：朱明军,浦跃武,吴海珍,等.不同碳源及其浓度对红发夫酵母培养的影响[J].华南理工大学学报(自然科学版)，2002,30(04):77-80)。其中，固体培养基配方(g/L)：葡萄糖10、酵母膏3、蛋白胨5、麦芽汁3、琼脂20，pH值5.0。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，种子瓶培养包括：一级种子瓶培养时，用接种环蘸取3～5个颜色较红、菌落较大的单菌落，接种种子培养基(10mL/50mL试管)。二级种子瓶培养时，按5～20％接种比例取上述一级种子瓶培养液二次接种种子培养基(22.5mL/250mL三角瓶)。在一级种子瓶培养、二级种子瓶培养中，培养温度17～24℃，摇床转速150～250rpm，一级种子瓶培养时间为36～72h，二级种子瓶培养时间为24～48h。种子培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖20、麦芽浸粉6、蛋白胨10、酵母浸粉6、CaCl20.1、KH2PO41、MgSO4·7H2O 0.5、泡敌0.2。所述种子培养基的消前pH值为5.0～6.5。
这里，种子瓶培养中的操作及培养条件是现有技术，包括：a)蘸取3～5个单菌落，接种种子培养基为微生物常规操作；b)种子瓶培养采用二级培养为报道方法(参见文献[2]：YANANE Y,HIGASHIDA K,HAKASHIMADA Y,et al.Influence of oxygen and glucoseon primary metabolism and astaxanthin production by Phaffia rhodozyma inbatch and fed-Batch cultures:kinetic and stoichiometric analysis[J].ApplEnviron Microbiol,1997,63(11):4471-4478)。
但是，本发明的种子培养基是对现有技术的改进。
文献[3](肖安风,倪辉,李利君,等.法夫酵母产虾青素的反复分批及反复分批补料发酵[J].生物工程学报，2011,27(04):598-605)公开了种子培养基配方(g/L)：葡萄糖20、(NH4)2SO4 5、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、CaCl2 0.1、酵母膏3。
本发明将氮源5g/L(NH4)2SO4和3g/L酵母膏改进为6g/L麦芽浸粉、10g/L蛋白胨和6g/L酵母浸粉，泡敌起消泡作用，为发酵行业常规成份。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，种子罐培养包括：种子瓶培养液按照0.25～1.5％接种比例接一级种子罐，一级种子罐培养液按照5～20％移种比例移二级种子罐。种子罐培养温度为17～24℃，培养时间为16～64h。所述种子罐培养在小试种子罐中进行，较佳的为30L，搅拌转速150～600rpm，通气比0.3～3.0：1vvm。所述一级种子罐培养在商业化生产一级种子罐中进行，较佳的为1m3，搅拌转速50～300rpm，通气比0.25～2.5：1vvm。所述二级种子罐培养在商业化生产二级种子罐中进行，较佳的为10m3，搅拌转速50～250rpm，通气比0.1～2.5：1vvm。各规模种子罐培养罐压均为0.02～0.1MPa。种子罐培养基同步骤b)种子培养基。
关于种子罐培养未见相关文献具体报道：a)报道的法夫酵母发酵罐培养规模相对较小，主要以5L玻璃罐作为主发酵罐，相应的种子培养物由三角瓶提供(如专利US 7432076B2和文献[2])。b)有关中试规模种子罐培养的报道中，US 5356810种子罐培养时将1L种子培养物接100L发酵罐(装30L YM培养基)，20～22℃培养，直到细胞干重为1g/L。
文献[4](倪辉,洪清林,肖安风,等.一株法夫酵母虾青素高产菌株的生产性能[J].生物工程学报，2011,27(07):1065-1075)种子罐培养：接种量2％、温度22℃、pH值6.0、溶氧30～50％、培养时间72h。
综合上述，本发明中试规模种子罐培养与现有技术的差异在于：a)本发明描述的种子罐接种比例0.25～1.5％，与现有技术报道不同；b)本发明描述的种子罐培养时间16～64h，与现有技术报道不同；c)本发明描述的种子罐通气量、搅拌转速，未见现有技术报道；d)本发明描述采用二级种子罐培养，未见报道；e)本发明描述罐压控制，未见报道。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，在步骤d)中，发酵罐移种比例5～20％，培养温度17～24℃，全程用氨水控制pH值为4.5～6.0，溶氧控制20～60％，罐压均为0.02～0.1MPa，并在36～60h和84～108h各补加3～10g/L乳酸，发酵时间120～240h。
关于发酵罐移种比例、发酵温度、pH值、溶氧、罐压和补乳酸工艺与现有技术比较，a)本发明描述的pH值、发酵温度和溶氧，与US 7432076 B2公开的法夫酵母培养pH值控制方式为NH4OH溶液和/或NaOH溶液控制pH值为4.5～7.0，发酵温度15～24℃，溶氧(DO)10～90％的工艺比较，为现有技术；b)本发明描述的发酵罐移种比例与文献[2]、US 7432076 B2公开的单一移种比例10％比较，与现有技术报道不同；c)本发明描述的发酵罐罐压控制，未见现有技术报道；d)本发明描述的乳酸补加工艺，与文献[5](林舒乐,倪辉,肖安风,等.乳酸钠对法夫酵母产虾青素的影响[J].食品与发酵工业，2010,36(8):106-111)及文献[6](沈宁燕,肖安风,蔡慧农,等.乳酸钠促进法夫酵母虾青素合成代谢流作用分析[J].微生物学通报，2015,42(4):634-645)报道的乳酸提高虾青素产量、72h和96h加入乳酸钠降低虾青素体积产率以及葡萄糖与乳酸钠混合补加的结论或工艺比较，为对现有技术的改进。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，在步骤d)中，所述小试发酵罐培养，较佳的为70L，搅拌转速100～700rpm，通气比0.3～3.0：1vvm；所述中试发酵罐培养，较佳的为10m3，搅拌转速50～250rpm，通气比0.2～2.5：1vvm；所述商业化发酵罐培养，较佳的为100m3，搅拌转速15～200rpm，通气比0.1～1.5：1vvm。
关于通气及搅拌工艺，本发明描述的溶氧控制是通过控制通气比、搅拌转速及罐压三者共同作用而达到溶氧水平的维持，与US 2003/0049241 A1公开的固定搅拌和固定通气相比，与现有技术报道不同。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，在步骤d)中，所述两阶段补糖工艺包括如下步骤：
I)分批培养：发酵起始到基础料碳源消耗完毕，溶氧上升到60～80％以上期间，不补料；
II)指数补料：溶氧上升到60～80％以上之后，按指数补料补加补糖培养基，控制比生长速率μ为0.02～0.10h-1，每0.5～2.0h改变补料速率，补料速率按以下公式计算：
F＝μV0ρc0eμt/[YX/S(ρSF-ρS)]，其中：
F为补料速率(L/h)；
μ为所设定的酵母比生长速率(h-1)；
V0为补料开始罐内培养基体积(L)；
ρc0为开始补料时罐内菌体质量浓度(g/L)；
YX/S为菌体得率(％)；
ρSF为补料培养基的总糖质量浓度(g/L)；
ρS为开始补料时罐内总糖质量浓度(g/L)；
t为指数补料时间(h)；
III)DO-STAT补料：指数补料至指数补料后期，发酵液中检测到1～10g/L乙醇时，将补料方式改为DO-STAT补料，DO-STAT补料溶氧关联值为20～60％，当溶氧低于设定值时停止补糖，当溶氧高于设定值时开始补糖。
关于补糖工艺，a)专利US 7432076 B2、文献[6](蒋兴龙,洪清林,蔡慧农,等.补料工艺对两株法夫酵母菌株产虾青素的影响[J].微生物学通报，2013,40(11):1996-2004)仅单独比较分批补料、指数补料、DO-STAT补料和pH-STAT补料对法夫酵母发酵的影响；b)文献[2]报道了基于碳氮化学计算组成分析的两阶段补糖策略，文献[7](鲁明波,纪磊,刘永胜,等.基于动力学模型的法夫酵母发酵生产虾青素的补料策略优化[J].生物工程学报，2008,24(11):1937-1942)报道了控制不同阶段糖浓两阶段补糖策略。
综合上述，本发明公开的指数补料-DO-STAT补料两阶段补糖工艺可解除乙醇生成，提高菌体量和产物产量，具有显著技术优势，与现有技术报道不同。
在本发明的方法的优选技术方案中，优选地，发酵培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖15～35、糖蜜3～7、(NH4)2SO4 1.8～4.2、酵母浸粉3～7、大豆蛋白胨3～7、KH2PO4 0.64～1.47、Na2HPO4·12H2O 1.35～3.15、乳酸3～7、CaCl2 0.06～0.14、MgSO4·7H2O 1.35～3.15、泡敌0.1～0.4、微量金属溶液0.5～1.5、维生素溶液0.5～1.5。所述微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 2.67、CuSO4·5H2O 1.6、KI 0.27、MnCl2 2.7、Na2MoO4·2H2O 1.07、ZnSO4·7H2O 24、CoCl2 0.8、柠檬酸铁24。所述维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙5.2、生物素0.13、肌醇66.67、尼克酸5.2、对氨基苯甲酸0.53、VB6 2.67、VB1 2.67、核黄素5.2。所述发酵培养基的消前pH值为5.0～6.5。最佳地，发酵培养基含有如下成份(g/L)：葡萄糖25、糖蜜5、(NH4)2SO4 3、酵母浸粉5、大豆蛋白胨5、KH2PO4 1.05、Na2HPO4·12H2O 2.25、乳酸5、CaCl20.1、MgSO4·7H2O 2.25、泡敌0.2、微量金属溶液1、维生素溶液1。金属元素、维生素及pH值如上所述。
关于发酵培养基，文献[7](CANNIZZARO C,RHIEL M,MARISON I,et al.On-linemonitoring of Phaffia rhodozyma fed-batch process with in situ dispersiveRaman spectroscopy[J].Biotechnol Bioeng,2003,83(6):668-680)报道了分批发酵培养基的组成及维生素成份，本发明公开的微量金属溶液与维生素溶液成份为对现有技术的改进。
根据本发明的再一方面，本发明提供了根据法夫酵母补糖培养基进行高密度培养的方法在法夫酵母虾青素生产中的应用。适用于本发明方法的法夫酵母菌株，没有特别限制，可以是自然筛选菌株也可以是传统化学、物理诱变的突变株或应用基因工程方法改造的工程菌。
本发明的效果和益处在于：优化得到的补糖培养基有利于菌体生长和效价提高，原料价格低廉且适合法夫酵母高密度培养，具有商业化应用的成本竞争优势。本发明所述的采用指数补料和DO-STAT补料相结合的补糖策略能降低Crabtree效应，发酵副产物乙醇含量降低，有利于细胞增殖和虾青素产量的提高。在100m3发酵罐上实现了菌体高密度培养和虾青素产量的提高，在100m3发酵罐上虾青素产量为570.0mg/L，有利于虾青素的产业化生产。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下面实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照说明书选择。除非特殊说明，所有的百分比和份数按照重量计算。
下述实施例，所使用的主要仪器设备：BIOTECH-30JS，上海保兴生物设备工程有限公司；LiFlus SP-70L发酵罐，韩国百特伦(Biotron)公司；1m3种子罐、10m3种子罐，江苏远方迪威尔设备科技有限公司；100m3发酵罐，无锡东盛石化装备有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪(High Performance Liquid Chromatography，HPLC)，美国安捷伦科技有限公司；Biomass System型在线活细胞监测仪，瑞士哈美顿博纳图斯(Hamilton)股份公司。
下述实施例中，采用高效液相法(HPLC)测定虾青素产量，具体方法为：
A)细胞破碎及丙酮抽提：取1mL发酵液样品，12000rpm离心3min，去上清，用蒸馏水洗涤沉淀，菌体加入2mL预热至75℃的DMSO，立即剧烈振荡，50℃破壁5min，加入丙酮抽提，振荡摇匀，12000rpm离心3min，多次抽提，直至菌丝至白色，合并抽提液，定容到一定体积；
B)虾青素高效液相检测：色谱柱Dikma DiamonsilTM-C18，250×4.6mm i.d.，5μm；柱温25℃；流动相：甲醇，流速1mL/min；检测波长：478nm；进样量：10μL；
下述实施例，菌体浓度检测：对发酵液进行适当稀释，测定波长600nm处吸光度，根据光密度与细胞干重(g/L)的比值为2.50±0.10确定细胞干重；
下述实施例，总糖/还原糖检测：按照菲林试剂法测定。
实施例1
固体培养：取-80℃冰箱保藏的法夫酵母冷冻甘油保藏液，融化后用接种环蘸取解冻液，进行平板划线，于温度20.5℃条件下培养4～8天，长出较大单菌落。平板培养基为YM培养基(g/L)：葡萄糖10、蛋白胨5、麦芽浸粉3、酵母浸粉3、琼脂20，消前pH值5.0。
种子瓶培养：用接种环蘸取3～5个颜色较红、菌落较大的单菌落，接种种子培养基(10mL/50mL试管)，于20.5℃、200rpm条件下振荡培养36～72h。将上述成熟一级种子瓶培养液按10％接种二级种子培养基(22.5mL/250mL三角瓶)，于20.5℃、200rpm条件下振荡培养24～48h获得成熟种子瓶培养液。种子培养基为(g/L)：葡萄糖20、麦芽浸粉6、蛋白胨10、酵母浸粉6、CaCl2 0.1、KH2PO4 1、MgSO4·7H2O 0.5、泡敌0.2，消前调pH值5.0～6.5。
30L种子罐培养：取二级成熟种子瓶培养液，按照1.0％接种比例接同种子瓶的种子培养基(20L/30L种子罐)，于20.5℃、搅拌转速350rpm、通气量比2：1vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h。
70L发酵罐培养：按照12％移种比例移发酵罐(30L/70L发酵罐)，培养温度20.5℃、通气比为0.3～3.0：1vvm、罐压0.06MPa，全程用25％～28％氨水控制pH值为5.0，搅拌转速与溶氧联动，控制点为40％，并在48、96h各补加8g/L乳酸(按发酵液体积计算，调pH值4.5～6.0)。在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.06h-1。当活细胞检测仪指示进入指数补料后期且检测到乙醇含量为1～10g/L时，设置补糖泵与溶氧值联锁，关联值为40％，进行DO-STAT模式补糖。其中，发酵基础培养基(g/L)：葡萄糖25、糖蜜5、(NH4)2SO4 3、酵母浸粉5、大豆蛋白胨5、KH2PO41.05、Na2HPO4·12H2O 2.25、乳酸5、CaCl2 0.1、MgSO4·7H2O 2.25、泡敌0.2、微量金属溶液1、维生素溶液1，消前pH值5.0～6.5。微量金属溶液成份为(g/L)：H3BO3 2.67、CuSO4·5H2O1.6、KI 0.27、MnCl2 2.7、Na2MoO4·2H2O 1.07、ZnSO4·7H2O 24、CoCl2 0.8、柠檬酸铁24；维生素溶液成份为(g/L)：泛酸钙5.2、生物素0.13、肌醇66.67、尼克酸5.2、对氨基苯甲酸0.53、VB6 2.67、VB1 2.67、核黄素5.2；补糖培养基(g/L)：葡萄糖175、麦芽糊精175、糖蜜50。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到100.8g/L，虾青素产量达到561.4mg/L。
实施例2
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.06h-1。补糖培养基(g/L)：麦芽糖130、糖蜜20、可溶性淀粉150。DO-STAT模式补糖阶段设置补糖泵与溶氧值联锁，关联值为40％。发酵培养基及其它工艺控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到101.6g/L，虾青素产量达到550.2mg/L。
实施例3
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.02h-1。补糖培养基(g/L)：蔗糖100、糖蜜100、淀粉水解液300、甘油300。DO-STAT模式补糖阶段设置补糖泵与溶氧值联锁，关联值为60％。发酵培养基及其它工艺控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养240h，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到98.5g/L，虾青素产量达到546.1mg/L。
实施例4
固体培养、种子瓶培养、种子罐培养：同实施例1。
70L发酵罐培养：在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.1h-1。补糖培养基(g/L)：葡萄糖250、麦芽糖250、糖蜜100、麦芽糊精200。DO-STAT模式补糖阶段设置补糖泵与溶氧值联锁，关联值为20％。发酵培养基及其它工艺控制条件同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养180h，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到97.9g/L，虾青素产量达到557.8mg/L。
对比实施例1
对比实施例1与实施例1的区别在于，在70L发酵罐培养中，全程采用还原糖-总糖检测结果反馈调节补糖速率的传统补糖工艺，维持总糖浓度在5～15g/L，其它工艺条件完全相同。培养时间180h时，发酵过程中检测到明显的乙醇积累(含量1.25％)，菌体干重达到85.7g/L，虾青素产量达到357.2mg/L。
对比实施例2
对比实施例2与实施例1的区别在于，在70L发酵罐培养中，对数生长期采用指数补料到检测出1～10g/L乙醇后，采用还原糖-总糖检测结果反馈调节补糖速率的传统补糖工艺，维持总糖浓度在5～15g/L，其它工艺条件完全相同。培养时间180h时，发酵过程中检测到明显的乙醇积累(含量1.02％)，菌体干重达到94.4g/L，虾青素产量达到489.1mg/L。
对比实施例3
对比实施例3与实施例1的区别在于，在70L发酵罐培养中，基础料碳源消耗完毕溶氧回升到60～80％开始补加碳源时，采用DO-STAT补糖模式，补糖泵与溶氧值关联，设置当溶氧低于30％时停止补糖，当溶氧高于30％时开始补糖，其它工艺条件完全相同。培养时间240h时，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到71.6g/L，虾青素产量达到339.0mg/L。
实施例5：
固体培养、种子瓶培养：同实施例1。
种子罐培养：取二级成熟种子瓶培养液，按照1.0％接种比例接同种子瓶的种子培养基(0.5m3/1m3种子罐)，于20.5±0.2℃、搅拌转速200rpm、通气比2.0：1vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h；一级成熟种子罐培养液按照9.09％移种比例移二级种子罐(5m3/10m3种子罐)，于20.5±0.2℃、搅拌转速200rpm、通气比2.0：1vvm、罐压0.06MPa条件下培养16～64h。
100m3发酵罐培养：将二级种子罐按照13.5％移种比例移发酵罐(35m3/100m3发酵罐)，培养温度20.5±0.2℃、通气比为0.1～1.5：1vvm、罐压0.06MPa，全程用25％～28％氨水控制pH值为5.0。起始搅拌转速40rpm，当溶氧低于20％时上调搅拌转速10～30rpm，直至发酵罐最大功率，控制溶氧为20～60％范围，并在48、96h各补加8g/L乳酸(调pH值4.5～6.0)。在基础料碳源耗尽溶氧开始回升到60～80％时，开始流加补糖培养基(每1h改变补料速率)，将比生长速率设置为0.06h-1。当活细胞检测仪指示进入指数补料后期且检测到乙醇含量1～10g/L时，并设置补糖速率与溶氧联锁，关联值为40％，进行DO-STAT模式补糖。其中，发酵基础培养基、微量金属溶液、维生素溶液、补糖培养基和补料培养基成份同实施例1。
发酵过程中同时进行总糖、还原糖、氨基氮、菌体吸光度、虾青素含量、乙醇含量等检测，培养185h，发酵过程中未发生明显的Crabtree效应，未检测到显著的乙醇积累，菌体干重达到101.4g/L，虾青素产量达到570.0mg/L。
需要声明的是，上述发明内容及具体实施方式意在证明本发明所提供技术方案的实际应用，不应解释为对本发明保护范围的限定。本领域技术人员在本发明的精神和原理内，当可作各种修改、等同替换、或改进。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：一种扁平云假丝酵母及其分离培养方法和应用