阅读说明：本技术 一种脱水酸枣仁皂苷及其制备方法和应用 (Dehydrated spina date seed saponin and preparation method and application thereof ) 是由 肖伟 商晶 陈夏霖 陈超 常秀娟 吴云 王永香 杨彪 于 2019-02-20 设计创作，主要内容包括：本发明提出了一种脱水酸枣仁皂苷(JuA-H<Sub>2</Sub>O)以及脱水酸枣仁皂苷或酸枣仁皂苷脱水混合物,通过实验表明,酸枣仁皂苷一定程度下的脱水产物活性强,具有更好地镇静催眠的活性。(The invention provides dehydrated jujuboside (JuA-H) 2 O) and dehydrated jujuboside or dehydrated mixtures of jujuboside, experiments show that the dehydrated products of jujuboside have strong activity to a certain extent, and have better sedative and hypnotic activities.)

一种脱水酸枣仁皂苷及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及中草药应用领域，特别涉及一种脱水酸枣仁皂苷及其制备方法和应用。

背景技术

酸枣仁为鼠李科植物酸枣Ziziphus jujuba Mill.var.spinosa(Bunge)Hu exH.F.Chou的干燥成熟种子，味甘、酸，性平，归肝、胆、心经，具有养心补肝，宁心安神，敛汗，生津的功效，主要用于治疗虚烦不眠，惊悸多梦，体虚多汗，津伤口渴等症。现在研究表明酸枣仁含有皂苷类、黄酮类、生物碱类、三萜类和脂肪酸类等多种类型的化学成分，具有镇静催眠、抗焦虑、抗抑郁、抗心律失常和抗炎等药理作用，其中酸枣仁皂苷A(JuA)为其主要的皂苷类成分，结构如图1所示。

发明内容

本发明的目的在于提供一种脱水酸枣仁皂苷、酸枣仁皂苷脱水混合物，及其制备方法和应用。

本发明是通过下述方案实现的：

一种脱水酸枣仁皂苷(JuA-H₂O)，其具有如下结构：

具体地，根据双键位置的差别，JuA-H₂O包括三种不同取向的脱水产物，JuA-H₂O可以选自任一种取向脱水产物或其任一两种或三种脱水产物的组合。

进一步地，所述脱水酸枣仁皂苷由酸枣仁皂苷制得。

具体地，所述酸枣仁皂苷是从中药酸枣仁中分离鉴定得到的单体化合物或混合物，例如，酸枣仁皂苷A、酸枣仁皂苷A1等等，或者上述化合物组成的混合物以及含有上述化合物的酸枣仁提取物。

优选地，所述脱水酸枣仁皂苷由酸枣仁皂苷A通过2％～9％的质子酸或路易斯酸脱水后分离制得。

进一步地，所述质子酸为乙酸。

本发明还提出一种酸枣仁皂苷脱水混合物的制备方法，其特征在于，该方法包括：

将酸枣仁皂苷溶解于溶剂中，加入0.2％～50％体积比的酸，在0～150℃的加热条件下反应0～150h。

具体地，所述溶剂选自甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、DMSO、乙腈、DMF、THF、水、甲苯、DME或其任意混合。

进一步地，所述酸为质子酸或路易斯酸。

具体地，所述质子酸为乙酸、柠檬酸、抗坏血酸、山梨酸、盐酸、硝酸、硫酸、磷酸、草酸、酒石酸、苹果酸、丁酸、三氟乙酸或对甲苯磺酸，所述路易斯酸为无水氯化锌、无水三氯化铝、三氯化铁、四氯化钛或氯化锡。

优选地，当所述酸选自乙酸时，所述乙酸的比例为2％～9％；

进一步地，所述加热的反应温度为50～100℃，反应时间为5～120h。

本发明其中一优选地实施方案，取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为5％-9％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，即得。

本发明还提出了前述任一制备方法制得的酸枣仁皂苷脱水混合物。

本发明还提出了前述脱水酸枣仁皂苷或前述酸枣仁皂苷脱水混合物在制备镇静催眠药物中的应用。

本发明还提出了一种镇静催眠药物，由前述脱水酸枣仁皂苷或前述酸枣仁皂苷脱水混合物与药学上可接受的载体制成。

进一步地，所述镇静催眠药物还包括戊巴比妥钠。可选地，前述脱水酸枣仁皂苷或前述酸枣仁皂苷脱水混合物和所述戊巴比妥钠重量比为20:25-40。

具体地，所述镇静催眠药物的剂型为口服给药剂型、注射给药剂型或外用给药制剂。

进一步地，该药物可以是药剂学上所说的任何一种剂型，包括片剂、胶囊剂、软胶囊、凝胶剂、口服剂、混悬剂、冲剂、贴剂、软膏、丸剂、散剂、注射剂、输液剂、冻干注射剂、静脉乳剂、脂质体注射剂、栓剂、缓释制剂或控释制剂。

在前期研究中，发现酸枣仁与醋五味子合煎时，JuA的含量明显下降，进一步研究发现JuA含量下降是由于醋五味子中的有机酸类成分溶解于水中，使JuA苷元上的羟基先发生脱水反应，再不断地丢失糖基，生成一系列的脱水产物，其反应过程如图2所示，而且，本案通过实验表明，酸枣仁皂苷一定程度下的脱水产物活性强，具有更好地药效活性，其能作为酸枣仁的物质基础。

附图说明

图1为本发明酸枣仁皂苷A的结构式；

图2为本发明酸枣仁皂苷A(JuA)在酸性条件下生成脱水物的反应产物的反应过程；

图3为本发明中JuA以15％乙酸反应后的液质图谱：A：TIC图B:JuA-H₂O的EIC图，C:JuA-H₂O-Xyl的EIC图，D:JuA-H₂O-Rha的EIC图；

图4为本发明JuA-H₂O的MS/MS图；

图5为本发明JuA-H₂O-Xyl的MS/MS图；

图6为本发明化合物JuA-H₂O-Rha的MS/MS图。

图7为本发明中JuA以12％乙酸反应后的液质图谱：A：TIC图；B:JuA-H₂O的EIC图；C:JuA-H₂O-Xyl的EIC图；D:JuA-H₂O-Rha的EIC图；

图8为本发明中JuA以9％乙酸反应后的液质图谱：A：TIC图；B:JuA-H₂O的EIC图；C:JuA-H₂O-Xyl的EIC图；D:JuA-H₂O-Rha的EIC图；

图9为本发明中JuA以5％乙酸反应后的液质图谱：A：TIC图；B:JuA-H₂O的EIC图；C:JuA-H₂O-Xyl的EIC图；D:JuA-H₂O-Rha的EIC图；

图10为本发明中JuA以2％乙酸反应后的液质图谱：A：总离子流图；B：JuA-H₂O的BPC图。

具体实施方式

以下结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本发明的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本发明的限制。

特别需要指出的是，针对本发明所做出的类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

其次，需要注意的是，本发明所涉及的未注明的浓度均为体积百分含量(v/v)。其它除非另外说明，否则所有的百分数、比率、比例或份数按重量计。另，本发明如未注明具体条件者，均按照常规条件或制造商建议的条件进行，所用原料药或辅料，以及所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

1、样品制备

取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为15％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，放冷后，取样，以甲醇稀释5倍后，进行UPLC-TOF/MS分析。

2、液质分析条件

液相条件：Agilent ZorBax Exlipse C18色谱柱(2.1×100mm,1.8μm)，柱温30℃；流动相A为乙腈，B为0.1％甲酸水溶液，线性梯度洗脱：0～25min，30％～60％A；体积流量0.3mL/min；进样量为2μL。

质谱条件：电喷雾离子源(ESI)，负离子模型，扫描范围m/z 100～3000，加热毛细管温度325℃，干燥气体积流量8L/min，喷雾器压力310kPa，毛细管电压4000V(负离子模式)，碎裂电压135V，锥孔电压65V。

3、数据分析

如图3A所示，t_R＝9.77min的峰对应酸枣仁皂苷A，在14.5～18.5min之间出现了3个峰，为酸枣仁皂苷A在此条件下的主要反应产物。进一步的通过碎片离子，确定这3个峰为酸枣仁皂苷A脱去苷元上的羟基，并根据双键位置的不同取向生成的三个脱水产物(图4)。另外，在酸性条件下，其糖基上的单糖可能进一步发生水解反应，生成相应的脱水与脱糖产物。因此，我们以其可能的脱水与脱糖产物的M+HCOO-提取其相应的EIC图，发现在此反应条件下，酸枣仁皂苷A糖链上的木糖(Xyl)和鼠李糖(Rha)可能发生水解反应而丢失(图3B、3C和3D)，并且通过MS/MS对其结构进行了确证(图5和图6)。

实施例2

1、样品制备

取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为12％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，放冷后，取样，以甲醇稀释5倍后，进行UPLC-TOF/MS分析。

2、液质分析条件

参照实施例1。

3、数据分析

质谱数据分析参照实施例1，在此条件下，JuA的反应产物表现出了与实施例1相似的TIC图，进一步提取EIC图，其反应产物主要为JuA-H₂O，也能生成少量的JuA-H₂O-Xyl和JuA-H₂O-Rha(图7)。

实施例3

1、样品制备

取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为9％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，放冷后，取样，以甲醇稀释5倍后，进行UPLC-TOF/MS分析。

2、液质分析条件

参照实施例1。

3、数据分析

质谱数据分析参照实施例1，在此条件下，JuA的反应产物的TIC图比实施例1和实施例2更加的平滑，表明9％的乙酸反应条件更加温和，其反应产物也主要为JuA-H₂O，但以其中的2种产物为主，另外，也能生成少量的JuA-H₂O-Xyl和JuA-H₂O-Rha(图8)。

实施例4

1、样品制备

取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为5％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，放冷后，取样，以甲醇稀释5倍后，进行UPLC-TOF/MS分析。

2、液质分析条件

参照实施例1。

3、数据分析

质谱数据分析参照实施例1，在此条件下，JuA的反应产物的TIC图与实施例3相似，其反应产物也主要为JuA-H₂O，但以其中的1种产物为主，另外，也生成少量的JuA-H₂O-Xyl和JuA-H₂O-Rha(图9)。

实施例5

1、样品制备

取8mg的酸枣仁皂苷A溶解于1mL的乙醇溶液，加入一定量的乙酸使其浓度为2％，并加入搅拌子，控制其转速为700rpm/min，80℃加热，密闭反应10h，放冷后，取样，以甲醇稀释5倍后，进行UPLC-TOF/MS分析。

2、液质分析条件

参照实施例1。

3、数据分析

质谱数据分析参照实施例1，在此条件下，JuA仅少量发生脱水反应，并且双键的位置也只有一种取向，糖链也未发生水解反应(图10)。

实施例6

1、实验材料

受试样品名称：按照实施例1、2、3、4、5的方法制备的化合物1、化合物2、化合物3、化合物4与化合物5，临用前以生理盐水配制，腹腔注射，给药剂量为20mg/kg；戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)，临用前以生理盐水配成45mg/kg的浓度，给药体积为0.1ml/10g体重；地西泮注射液(天津金耀氨基酸有限公司)，给药剂量为2mg/kg，给药体积为0.1ml/10g体重。雄性ICR小鼠，清洁级，18-22g，由北京维通利华实验动物中心提供，生产许可证号：SCXK(京)2016-0011。

2、实验方法

将雄性ICR小鼠按体重随机分组，分别为空白组、化合物1组、化合物2组、化合物3组、化合物4、化合物5、安定组。小鼠按剂量给药，40min后腹腔注射阈上剂量的40mg/kg的戊巴比妥钠(0.1ml/10g)。观察注射后小鼠翻正反射消失和恢复情况。从给药后开始记录，1分钟之内翻正反射出现小于3次或翻正反射消失时间超过5min即为睡眠，同时记录入睡时间和觉醒时间。所有小鼠在实验中均只使用一次。采用双盲实验法，观察者未知实验前每组动物所给药物。

入睡潜伏期(min)＝翻正反射消失时间-腹腔注射戊巴比妥钠的时间

睡眠持续时间(min)＝觉醒时间-翻正反射消失时间。

3、实验结果

3.1单次给药与阈上剂量戊巴比妥钠(40mg/kg,i.p.)的协同催眠效应(mean±SD)。

组别	N	潜伏期(min)	睡眠时间(min)
				空白组	6	4.94±0.16	45.92±3.22
安定2mg/kg	6	3.00±0.00**	90.00±0.00**
				化合物5组20mg/kg	9	3.93±0.47**	61.61±6.70**
化合物4组20mg/kg	9	3.82±0.31**	75.31±4.54**
				化合物3组20mg/kg	9	3.63±0.37**	74.22±5.95**
化合物2组20mg/kg	9	4.33±0.28*	56.81±6.60*
				化合物1组20mg/kg	9	4.57±0.26	55.88±7.03*

**P<0.01，*P<0.05，与空白组比较。

3.2连续3天给药与阈上剂量戊巴比妥钠(40mg/kg,i.p.)的协同催眠效应(mean±SD)。

^*P<0.05，**P<0.01与空白组比较

3.3连续3天给药与阈下剂量戊巴比妥钠(25mg/kg,i.p.)的协同催眠效应。

组别	N	翻正反射消失数	翻正反射消失比例(％)
				空白组	10	1	10.0
安定2mg/kg	11	11	100.0
				化合物5组20mg/kg	9	6	66.6
化合物4组20mg/kg	9	7	77.8
				化合物3组20mg/kg	9	5	55.5
化合物2组20mg/kg	9	3	33.3
				化合物1组20mg/kg	9	2	22.2

^*P<0.05，**P<0.01与空白组比较

各给药组单次腹腔注射给药和连续给药均可缩短小鼠阈上剂量戊巴比妥钠睡眠的入睡潜伏期，增加小鼠阈上剂量戊巴比妥钠睡眠的睡眠时间，其中化合物3、4、5组与空白组相比有显著性差异(P<0.01)，表现出了较好的镇静催眠作用。并且随着乙酸浓度的增加，药效表现出先增加后减少的趋势，因此，为了获得较好的镇静催眠作用，拟将酸枣仁皂苷A的反应条件中乙酸的浓度控制在2％～9％，优选为5％～9％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。