一种具有免疫检查点ctla-4抑制活性的多肽及其应用

文档序号：1282360 发布日期：2020-08-28 浏览：10次 >En<

阅读说明：本技术 一种具有免疫检查点ctla-4抑制活性的多肽及其应用 (Polypeptide with immune checkpoint CTLA-4 inhibitory activity and application thereof ) 是由徐寒梅王瑶瑶胡加亮刘晨于 2020-05-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种具有免疫检查点CTLA-4抑制活性的多肽及其应用,属于生物医药领域。本发明系列多肽应具有氨基酸序列KXaVLTXbMSGD(其中Xa、Xb可被删除或替换)或其药学上可以接受的盐,更进一步地,所述的多肽序列在上述的序列基础上,一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有靶向CTLA-4作用的多肽,或该多肽药学上可以接受的盐。多肽具体可以特异性识别激活的T细胞表面的CTLA-4,解除CTLA-4/B7信号通路导致的免疫抑制,从而达到杀伤肿瘤细胞的目的。(The invention discloses a polypeptide with immune checkpoint CTLA-4 inhibitory activity and application thereof, belonging to the field of biological medicine. The polypeptide of the invention has an amino acid sequence KX a VLTX b MSGD (wherein X a 、X b May be deleted or substituted) or pharmaceutically acceptable salt thereof, and further, the polypeptide sequence has the function of targeting CTLA-4 after one or more amino acids are deleted, substituted or added on the basis of the sequence, or pharmaceutically acceptable salt of the polypeptide. The polypeptide can specifically recognize CTLA-4 on the surface of activated T cells and relieve immunosuppression caused by CTLA-4/B7 signal pathways, thereby achieving the purpose of killing tumor cells.)

一种具有免疫检查点CTLA-4抑制活性的多肽及其应用

技术领域

本发明属于生物药物领域，涉及一种具有免疫检查点抑制活性的多肽及其应用。

背景技术

免疫检查点是一系列免疫抑制类分子，包括细胞毒T淋巴细胞相关抗原 -4(Cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4，CTLA-4)在内的多种分子。在正常的生理状态下，免疫检查点可以调节免疫应答、防止自身组织损伤，以及对于维持免疫耐受具有重要的意义，同时免疫检查点与很多自身免疫疾病相关，例如狼疮样自身免疫综合征和自身免疫性扩张性心肌病。但是在肿瘤发生发展过程中，免疫检查点分子的活化和高表达会抑制免疫细胞的功能，减弱免疫细胞细胞对肿瘤细胞的杀伤能力从而介导肿瘤免疫逃逸。免疫检查点阻滞剂就是通过抑制负调节信号，调节免疫细胞活性来提高抗肿瘤免疫反应的治疗方法。

整个免疫应答过程中，T细胞激活需要双信号通路介导。首先通过T细胞表面的T细胞受体TCR特异性识别抗原递呈细胞APC或肿瘤细胞表面的MHC分子抗原肽复合体；其次APC或肿瘤细胞上的共刺激分子与T细胞上的共刺激受体结合，激活或者抑制T淋巴细胞。T细胞上的共刺激分子主要包括共激活分子4-1BB，CD27，CD28，OX40，ICOS，以及共抑制分子CTLA4，PD-1。

其中，CTLA-4又名CD152，是一种白细胞分化抗原,是由活化的效应T细胞表达的跨膜蛋白，在T细胞增殖过程中起抑制作用，同时对相关细胞周期进程和细胞因子如白介素-2(IL-2)，干扰素γ(IFN-γ)的分泌也有不同程度的抑制。 CTLA-4通过多种机制发挥其抑制功能，包括与共刺激信号CD28竞争性结合抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APC)上共有的配体B7(CD80/CD86)。目前，靶向CTLA-4的抗体被用来治疗多种人恶性肿瘤，目的是阻断CTLA-4在T 细胞活化过程中的抑制作用。

随着对CTLA-4研究得越来越深入，发现其在肿瘤微环境中的调节性T细胞(Tregs)上也能发挥作用。肿瘤微环境中的调节性T细胞(Tregs)上高表达 CTLA-4，靶向CTLA-4的抗体可能通过介导巨噬细胞的抗体依赖性细胞吞噬作用(Antibody dependentphagocytosis，ADCP)或自然杀伤细胞的抗体依赖性细胞毒性(antibody-dependentcytotoxic cell，ADCC)来消除肿瘤微环境内的Treg 细胞，从而达到抗肿瘤作用，这一机制研究也为局部给药提供了用力地证据。

已上市的Ipilimumab是抗CTLA-4免疫调节的的单克隆抗体(monoclonalantibody，mAb)，单独成药适应症为黑色素瘤，随着联合用药的兴起，靶向于 CTLA-4的药物参与治疗的肿瘤谱在不断扩大，例如，其与PD-1抗体联用已在黑色素瘤，肺癌，肾癌中取得显著成效。除此之外，在Chimeric Antigen Receptor T,CAT-T疗法中加入CTLA-4靶点的联合使用也是免疫疗法研究的一大热点。

发明内容

1.要解决的问题

本发明提供一种具有免疫检查点抑制活性的多肽及其应用，本发明的多肽作用于CTLA-4，来抑制CTLA-4/B7通路，通过多种实验模型验证该序列具有良好的抑瘤效果极具开发前景。

2.技术方案

为了解决上述问题，本发明所采用的技术方案如下：

一种具有免疫检查点CTLA-4抑制活性的多肽，其特征在于：具有 KXaVLTXbMSGD或其药学上可以接受的盐，其中Xa、Xb可被删除或替换的氨基酸。

所述的多肽，其特征在于：所述的多肽序列在权利要求1的序列基础上，一个或多个氨基酸被删除、置换或添加后仍具有靶向CTLA-4作用的多肽，或该多肽药学上可以接受的盐。

所述的多肽，其特征在于所述的多肽序列为KMVLTMMSGD。

所述的多肽在制备预防与治疗肿瘤药物中的应用。

具体来说：

1.固相合成的方法合成具有KX_aVLTX_bMSGD(其中X_a、X_b可被删除或替换)序列的多肽，使用HPLC和质谱检测多肽纯度与分子量，以序列 KMVLTMMSGD为例，详细过程见实施例1；

2.将多肽链接FITC，使其带有荧光标记，随后使用流式细胞仪检测荧光标记多肽在不同浓度与T细胞的结合情况，以序列KMVLTMMSGD为例，详细过程见实施例2～3；

3.CTLA-4的负调节功能会抑制T细胞激活，加入序列为KX_aVLTX_bMSGD (其中X_a、X_b可被删除或替换)的CTLA-4拮抗肽后会增强免疫系统的激活程度，提高IL-2的分泌量，以序列KMVLTMMSGD为例，详细过程见实施例4；

4.检测多肽的体外活性，将免疫细胞与肿瘤细胞共孵育后，加入CTLA-4 拮抗肽KX_aVLTX_bMSGD(其中X_a、X_b可被删除或替换)，会增强免疫系统的对肿瘤细胞的杀伤能力，分别检测了对黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌及结肠癌的杀伤能力，以序列KMVLTMMSGD 为例，详细过程见实施例5；

5.检测多肽的体内抗肿瘤活性，建立皮下移植瘤模型，在实验过程中给与 CTLA-4拮抗肽KX_aVLTX_bMSGD(其中X_a、X_b可被删除或替换)，会抑制肿瘤生长，分别检测多肽对不同肿瘤包括黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌及结肠癌的抑瘤率来评价多肽体内药效，以序列 KMVLTMMSGD为例，详细过程见实施例6；

6.检测多肽的安全性，使用秀丽线虫为载体，通过过评价多肽对线虫幼虫致死率和头部摆动次数的影响，以序列KMVLTMMSGD为例，评价多肽的安全性，详细过程见实施例7～8。

3.有益效果

相比于现有技术，本发明的有益效果为：

(1)本发明的多肽结构简单，容易合成、分离和纯化，有效抑制CTLA-4/B7 通路，消除免疫抑制的作用；

(2)本发明的多肽不良反应和毒副性反应弱；

(3)本发明涉及的多肽消除免疫抑制效果在体内外模型中表现良好，具体效果为显著提高T细胞的活性，加强对肿瘤细胞的杀伤作用进而产生抑瘤效果。

附图说明

图1多肽HPLC纯度分析图。

图2多肽MS检测图。

图3流式细胞仪检测T细胞与FITC-抗CTLA-4多肽的结合。A：T细胞与 1μM多肽结合率；B：T细胞与5μM多肽结合率；C：T细胞与10μM多肽结合率。

图4激光共聚焦显微镜观察T细胞与FITC-抗CTLA-4多肽的结合。A：DiI- 细胞膜B：FITC-抗CTLA-4多肽C：Merge图。

图5多肽对SEB刺激PBMC实验上清中IL-2的影响。注：各给药组与对照组(SEBalone组)相比，并与Ipilimumab组相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，ns表示P>0.05。

图6多肽对SEB刺激PBMC实验上清中IFN-γ的影响。注：各给药组与对照组(SEBalone组)相比，并与Ipilimumab组相比，*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001，ns表示P>0.05。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进一步进行描述。以下所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员均可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修饰或等同变化，均落在本发明的保护范围内，以下实施方式中以序列KMVLTMMSGD为例：

实施例1

靶向CTLA-4多肽的制备

通过本领域公知的方法，例如多肽固相合成法，或者通过多肽合成仪可以制备抗CTLA-4多肽。本发明采用Fomc固相多肽合成法合成抗CTLA-4多肽，具体合成步骤如下：

(1)溶胀树脂、加第一个氨基酸；

(2)加第二个氨基酸及后续肽链延伸；

(3)多肽切割；

(4)HPLC分析多肽和纯化多肽；

(5)质谱鉴定。

多肽采用那个标准Fmoc方案合成多肽，具体表现为将待合成肽C端的第一个Fmoc-氨基酸羧基与树脂以共价形式连接，再以该氨基酸的N段作为该条多肽合成的起点，通过与下一个氨基酸的羧基端发生脱水缩合反应而次年改成肽键。将N端的Fmoc-氨基酸的保护进行脱保护后，将第二个氨基酸的N端和后面氨基酸的羧端进行反应，如此不断重复直至多肽合成完毕。在这一过程中，通过树脂与目的多肽的第一个带保护基的氨基酸进行缩合后，脱掉保护剂后加入第二个氨基酸进行缩合，通过重复以上步骤，指导加入最后一个氨基酸，待脱掉其保护剂后，利用切割试剂把多肽从树脂上切下后，经过乙醚沉淀，洗涤后收获此肽。将合成的多肽经过质谱分析、纯化，其纯度大于95％，即得到本发明的CTLA-4 合成肽。ESI-MS质谱分析并确定合成肽的分子量与理论分子量相符合后，-20℃冻存备用。HPLC图见图1，分子量检测图见图2。

实施例2

多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的检测实验。

流式细胞分析是一种通过激光束激发单个单向流动的粒子，对粒子的散射光和其所携带荧光标志物进行检测，从而完成快速检测分析单个粒子的多个物理特性和细胞分选的技术。普遍应用于科学研究及临床医学检验，是当代最先进的细胞定量分析技术。本发明涉及的一种具有预防癌症和/或抑瘤活性的多肽的主要靶点为CTLA-4，本研究将设计的抗CTLA-4的多肽连接FITC荧光标记物，以细胞与FITC-抗CTLA-4多肽溶液的结合率反映多肽在细胞水平上与细胞表面C TLA-4的结合能力。

1实验材料

T细胞，通过提取纯化获得，BSA封闭液，Ficoll试剂，分选磁珠等。

2实验仪器

CO₂细胞培养箱、流式细胞仪、磁珠分选架、磁珠分选柱、水平离心机、液氮罐、超净台、小型离心机、电子天平、全自动高压蒸汽灭菌锅、烘箱。

3实验方法：

将含有1640培养液的T细胞收集，冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含 1％的BSA溶液，固定于旋转混合仪上，4℃混合30min。避光条件下加入10μ l 1mg/ml的FITC-抗CTLA-4多肽溶液溶液，固定于旋转混合仪上，黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后，800rpm，5min离心后弃上清。用冰预冷的PBS 洗涤一次。用PBS调节细胞浓度，将样品浓度调至1×106cells/ml。每个细胞做3个平行，每个样品准备0.5ml。

使用流式细胞仪检测多肽与CTLA-4的结合，从左到右依次打开稳压电源、变压器、流式细胞仪主机、电脑及打印机。打开液流抽屉，向鞘液桶中加入纯净水，直至到达2/3处。将废液倒掉，加入200ml含10％有效氯浓度的次氯酸钠溶液。将液压阀调到pressurize的位置，排除液流管路与过滤器之间的气泡。取下样品管，执行PRIME功能两次，1ml PBS，HINGRUN 2min。开始测量并分析样品。测量完成后，将样品支持架左移，真空抽取1ml FACSClean。再将样品支持架回正，HING RUN 5min。将FACS Clean换成纯净水，样品支持架左移，真空抽取1ml，样品架回正，HING RUN 10min。按Standby，取下样品管，执行PRIME功能两次。最后留取1ml纯净水于流式试管中。按Stan dby，使其工作20min，是风扇冷却雷射后，关闭流式细胞仪。退出程序，关闭计算机。

4实验结果

T细胞与FITC偶联的抗CTLA-4多肽的结合如图3所示，图中，A、B、C 为T细胞与1μM，5μM，10μM的FITC偶联的抗PD-1多肽的结合率。分别是14.8％，29.6％和49.9％，证明多肽可以与表达CTLA-4的T细胞结合。

实施例3

多肽在细胞水平上与靶点的特异性结合的定性检测实验-荧光成像实验

1实验材料

T细胞，通过提取纯化获得。培养条件：采用含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液，于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至对数生长期。

2实验仪器

CO₂细胞培养箱、单通道移液器、荧光显微镜、倒置显微镜、液氮罐、超净台、小型离心机、电子天平。

3实验方法

将T细胞浓度调至1×10⁵cells/ml铺在激光共聚焦皿上。用冰预冷的PBS洗涤两次。加入1ml含1％的BSA溶液，4℃混合30min。避光条件下加入10μL 1mg/ml的FITC-抗CTLA-4多肽溶液，黑暗处4℃混合1h。孵育药物完成后，用冰预冷的PBS洗涤一次。加入DiI染料，用冰预冷的PBS洗涤两次。

使用激光共聚焦显微镜检侧检测多肽与CTLA-4的结合，固定参数，分别在合适的通道拍摄，叠加不同通道的荧光图像，判断多肽与CTLA-4的结合。

4实验结果

结果如图4所示，图片Merge后有明显变黄，再次验证了抗CTLA-4的多肽能与T细胞结合，并且结合在细胞膜表面。

实施例4

检测抗CTLA-4多肽对SEB刺激PBMC体系中细胞因子的影响。

SEB(Staphylococcalen terotoxins)，葡萄球菌肠毒素B，是一类超抗原，也是一种非常有效的T细胞激活剂，可以在极低浓度下激活免疫细胞，SEB可以和CD28，MHC Ⅱ类分子以及TCR三者相互作用，从而在抗原呈递细胞与T细胞之间形成稳定的突触结构，有效的激活T细胞。在此过程中加入CTLA-4拮抗肽可以有效加强T细胞的激活，通过检测上清中细胞因子IL-2与IFN-γ含量来评价T细胞的激活情况。

1实验材料

健康志愿者人体外周血、葡萄球菌肠毒素B(SEB)、人IL-2细胞因子、人 IL-2检测试剂盒、人IFN-γ检测试剂盒。

2实验仪器

水平离心机、细胞计数仪、电子天平(d＝0.01mg)、酶标仪、超净台。

3实验方法

用浓度为2.5ng/mL的SEB⁺1640培养基将PBMC浓度调整到10⁶个/mL，按照100μL/孔加入到96孔板不同区域，做好标记，每孔10⁵个PBMC。因为药物与细胞要1:1加入，所以用浓度为2.5ng/mL的SEB⁺1640培养基分别将多肽和CT-3稀释至40μM，再梯度稀释为20μM、10μM、5μM、2.5μM、1.25μM 过滤除菌备用。给药后在37℃，CO₂培养箱培养72h，取出96孔板，在水平离心机中300×g，升速3，降速3，离心10min，取上清，-20℃保存待检。取上清室温融化，按照人细胞因子IL-2和IFN-γ试剂盒中的步骤制作标曲并对样品进行检测，每组均做三个复孔。根据各细胞因子标准曲线计算每组细胞因子水平，统计学分析使用Graph PadPrism8.0.2软件，每个实验数值均测定三遍后进行比较，用T检验进行组间比较，多组间采用单因素ANOVA分析。当P<0.05时认为差异具有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)。

4实验结果

由图5可以看出CTLA-4拮抗肽可以显著提高上清中IL-2含量，给药组与对照组相比具有显著性差异，证明多肽能够显著加强体系中T细胞的激活程度。由图6可以看出CTLA-4拮抗肽可以显著提高上清中IFN-γ含量，给药组与对照组相比具有显著性差异，证明多肽能够显著加强体系中T细胞的激活程度。

实施例5

检测多肽的体外抗肿瘤活性，将免疫细胞与肿瘤细胞共孵育后，加入CTLA-4 拮抗肽会增强免疫系统的对肿瘤细胞的杀伤能力，分别检测了加入多肽后对黑色素瘤、非小细胞肺癌、肾细胞癌、卵巢癌、头颈癌、前列腺癌、乳腺癌及结肠癌的杀伤能力，以序列KMVLTMMSGD为例，选取的细胞系为：人黑色素瘤细胞 (ME)，人非小细胞肺癌细胞(A549)，人肾细胞癌细胞(769-P)，卵巢癌细胞 (A2780)，头颈鳞癌中的口腔鳞状细胞癌(SCC-4)、前列腺癌(DU-145)、乳腺癌(BT474)、人结肠癌细胞(HT-29)。

乳酸脱氢酶(LDH)在胞质内含量丰富，当细胞状态正常时，其不能通过细胞膜，但当细胞受到损伤或死亡时LDH便可释放到细胞外，此时上清中LDH 的含量与细胞的死亡数目呈正比，所以我们通过检测共孵育体系上清中LDH含量来确定给药后T细胞对肿瘤细胞的杀伤能力。

1实验材料

上述所选的八种人源肿瘤细胞系、LDH检测试剂盒、人外周血淋巴细胞分离液、IL-2细胞因子。

2实验仪器

水平离心机、单通道移液器、酶标仪、小型离心机、电子天平、pH计、细胞计数仪、细胞培养箱。

3实验方法

将选取的八种肿瘤细胞株采用含10％胎牛血清(FBS)、青霉素(100kU/L)、链霉素(100mg/L)的1640培养液，于37℃、含5％CO₂的培养箱中培养至对数生长期。将细胞浓度调整为所需浓度，接种于96孔板中。于37℃、含5％CO₂的培养箱培养24h。随后利用共孵育反应来证明阻断CTLA-4途径对肿瘤细胞产生的影响。从血液中提取外周血单核细胞(PBMC)，同时培养肿瘤细胞，随后按照一定比例将两种细胞共孵育，设置多肽浓度为1μM、5μM、10μM三个浓度，给药后，37℃细胞培养箱静止培养2天。2天后，取上清，使用试剂盒检测LDH的分泌情况。采用SPSS 19.0(SPSS Inc.Chicago，IL，USA)软件进行统计分析。结果以mean±SD表示。用T检验进行组间比较，多组间采用单因素 ANOVA分析。当P<0.05时认为差异具有统计学意义(*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001)。

4实验结果

多肽加入共孵育体系后，T细胞对八种肿瘤细胞的杀伤情况如表1～8。

表1多肽对共孵育体系中的ME细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	9.21±0.38
多肽低剂量组	1.25	12.22±0.21*
			多肽中剂量组	5	17.48±0.31*
多肽高剂量组	10	19.72±0.42*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中ME细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进T 细胞对肿瘤细胞ME的杀伤作用。

表2多肽对共孵育体系中的A549细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	10.37±0.42
多肽低剂量组	1.25	13.16±0.27*
			多肽中剂量组	5	18.66±0.37*
多肽高剂量组	10	19.94±0.22*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中A549细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞A549的杀伤作用。

表3多肽对共孵育体系中的769-P细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	9.85±0.29
多肽低剂量组	1.25	12.66±0.47*
			多肽中剂量组	5	16.94±0.17*
多肽高剂量组	10	18.12±0.35*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中769-P细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞769-P的杀伤作用。

表4多肽对共孵育体系中的A2780细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	10.51±0.14
多肽低剂量组	1.25	12.26±0.27*
			多肽中剂量组	5	18.75±0.36*
多肽高剂量组	10	21.47±0.18*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中A2780细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞A2780的杀伤作用。

表5多肽对共孵育体系中的SCC-4细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	9.21±0.19
多肽低剂量组	1.25	12.27±0.16*
			多肽中剂量组	5	15.39±0.15*
多肽高剂量组	10	18.72±0.37*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中SCC-4细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞SCC-4的杀伤作用。

表6多肽对共孵育体系中的DU-145细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	10.15±0.14
多肽低剂量组	1.25	16.78±0.36*
			多肽中剂量组	5	18.24±0.16*
多肽高剂量组	10	19.62±0.25*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中DU-145细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进T细胞对肿瘤细胞DU-145的杀伤作用。

表7多肽对共孵育体系中的BT474细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	12.32±0.19
多肽低剂量组	1.25	14.63±0.25*
			多肽中剂量组	5	18.92±0.16*
多肽高剂量组	10	22.56±0.21*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中BT474细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞BT474的杀伤作用。

表8多肽对共孵育体系中的HT-29细胞杀伤情况

组别	多肽剂量(μΜ)	细胞毒性(％)
			对照组	/	9.25±0.14
多肽低剂量组	1.25	13.62±0.13*
			多肽中剂量组	5	15.36±0.13*
多肽高剂量组	10	18.23±0.26*

注：与对照组比，*P<0.05。

共孵育体系中LDH的变化反应多肽对共孵育体系中HT-29细胞的影响。给药组与对照组相比较有显著性差异说明多肽能够增强免疫系统的激活程度，促进 T细胞对肿瘤细胞HT-29的杀伤作用。

实施例6

检测抗CTLA-4多肽体内抗肿瘤活性，通过建立皮下移植瘤模型，根据多肽对人黑色素瘤细胞(ME)，人非小细胞肺癌细胞(A549)，人肾细胞癌细胞(76 9-P)，卵巢癌细胞(A2780)，头颈鳞癌中的口腔鳞状细胞癌(SCC-4)、前列腺癌(DU-145)、乳腺癌(BT474)、人结肠癌细胞(HT-29)的抑瘤率来评价多肽体内抗肿瘤活性。

1实验材料

Balb/c裸鼠，抗CTLA-4多肽，淋巴细胞分离液，以上提到的八种肿瘤细胞， IL-2细胞因子，1640培养基，电子游标卡尺。

2实验方法

购买成年雌性Balb/c裸鼠小鼠饲养于中国药科大学药学动物实验中心屏障环境，动物房内恒温恒湿12h昼夜节律交替，小鼠适应性喂养一周后，将裸鼠随机分组，每组5只，分别是PBMC组，5mg/kg组，10mg/kg组，20mg/kg组， Ipilimumab组；随后将肿瘤细胞消化收集，PBS洗涤1次，生理盐水重悬。同时将激活后的PBMC离心收集，PBS洗涤1次，生理盐水重悬后与肿瘤细胞混合，使混合悬液中肿瘤细胞浓度为6×10⁶个/mL，PBMC浓度为3×10⁶个/mL。75％酒精棉擦拭小鼠左侧腋下皮肤消毒，随后用1mL无菌注射器将细胞混合悬液接种于小鼠左腋皮下，每只小鼠100μL，接种结束后小鼠放于笼内分组饲养，其中 PBMC组，5mg/kg组，10mg/kg组，20mg/kg组，Ipilimumab组在接种后的第 14天尾静脉再次注射PBMC，加强小鼠免疫系统的重建。每三天对小鼠进行称重，并用游标卡尺测量皮下肿瘤大小，瘤体积V(mm³)＝a×b²/2(a是皮下肿瘤的长度，b是皮下肿瘤的宽度)。肿瘤细胞接种后按照表9进行给药；

注：Ipilimumab，商标名称为Yervoy，Ipilimumab是一种单克隆抗体，能有效阻滞一种叫做细胞毒性T细胞抗原-4(CTLA-4)的分子，购自Selleckchem公司。

表9多肽CT-2体内抗肿瘤活性给药方案

八种肿瘤细胞均按照以上操作进行实验，28天后，小鼠称重，随后颈椎脱臼法处死小鼠，剖出肿瘤组织称重计算抑瘤率。用T检验进行组间比较，多组间采用单因素ANOVA分析。当P<0.05时认为差异具有统计学意义(*P<0.05， **P<0.01，***P<0.001)。。

3实验结果

多肽对八种肿瘤的抑瘤率详情见表10～17。

表10多肽对黑色素瘤细胞(ME)的抑瘤率

组别	给药剂量	抑瘤率(％)
			PBMC组	/	9.71±0.46
多肽低剂量组	5mg/kg	22.47±2.21
			多肽中剂量组	10mg/kg	32.48±4.31
多肽高剂量组	20mg/kg	40.72±3.42*
			Ipilimumab组	100μg/kg	52.37±4.68**