一种厌氧微生物菌群降解γ-六六六的方法
阅读说明：本技术 一种厌氧微生物菌群降解γ-六六六的方法 (Method for degrading gamma-hexachloro cyclohexane by anaerobic microbial flora ) 是由 邹德勋 郑富文 仝婧婧 于 2021-05-18 设计创作，主要内容包括：一种厌氧微生物混合菌群降解γ-六六六的方法属于环境生物化学修复技术应用技术领域。该混合菌群从长期受六六六农药污染土壤中采用基础培养基多次传代富集驯化获得。该混合菌群由细菌和古菌组成,细菌包括Clostridium-sensu-stricto-7,Sedimentibacter,Lysinibacillus,Georgenia muralis,Anaerocolumna aminovalerica等菌株。古菌包括norank-d-Archaea,norank-o-Group-1.1c,Thermoplasmata,Bathyarchaeia,Methanothermobacter等菌株。本发明的微生物菌群能够以葡萄糖、乳酸、乙酸作为电子供体,有效地降解γ-六六六。微该混合菌群能够在添加乳酸的淹水条件下对实际的污染土壤起到良好的修复效果,γ-六六六的降解率可达近95％。(A method for degrading gamma-hexachloro cyclohexane by anaerobic microorganism mixed flora belongs to the technical field of application of environmental biochemical remediation technology. The mixed flora is obtained by multiple passage enrichment domestication of basic culture medium in soil polluted by hexachloro cyclohexane pesticide for a long time. The mixed flora is composed of bacteria and archaea, and the bacteria comprise strains of Clostridium _ sensu _ stricoto _7, Sementibacter, Lysinibacillus, Georgia muralis, Anaerocolmnavarias, and the like. The Archaea includes strains such as norank _ d _ Archaea, norank _ o _ Group _1.1c, thermoplasta, Bathyarcaeia, Methanotherobacter, etc. The microbial flora can effectively degrade gamma-hexachloro-cyclohexane by taking glucose, lactic acid and acetic acid as electron donors. The mixed flora can play a good role in repairing the actual polluted soil under the flooding condition of adding lactic acid, and the degradation rate of gamma-hexachloro cyclohexane can reach nearly 95%.)
技术领域
本发明涉及一种难降解有机氯农药γ-六六六的去除方法，特别是利用微生物菌群降解环境中γ-六六六的方法，其中包括水环境和土壤环境，属于环境生物化学修复技术应用技术领域。
背景技术
γ-六六六(γ-HCH)是一种广谱杀虫剂有机氯农药，在过去的70年得到广泛应用，在土壤和水环境中的残留量不断增加，由于其在环境中持久难降解性且具有脂肪蓄积性及潜在的致癌性并作为环境内分泌干扰物，于2009年被列入斯德哥尔摩公约持久性有机污染物POPs名单中。目前，研究工作者已经筛选到了许多可厌氧降解γ-HCH的微生物纯培物，主要分布在Clostridium、Bacillaceae、Enterobacteriaceae、Desulfovibrio等多个属。但单一的纯培养物在实际场地修复中往往受到土著微生物的强烈竞争导致效率降低(Tomeiand Daugulis,2012)。微生物混合菌群往往比纯培养物具有更好的性能表现。混合菌群作为一种多菌体共存的生物群体，在其生长过程中能分解有机物的同时依靠各种微生物之间相互共生增殖及协同代谢作用降解环境中的有机物，并能激活其他具有净化功能的微生物，从而形成复杂而稳定的微生态系统(毛等.,2010)。与微生物纯培物相比，从自然环境富集而来的微生物混合菌群的基因更具多样性、代谢途径更加丰富，可以增强代谢功能交叉喂食(Zhang et al.,2020)，建立的稳定的生存关系和拥有降解性能，故在有机污染物降解方面更具潜力。
发明内容
本发明针对γ-六六六污染场地的治理和一般的微生物纯培物往往在环境中定殖能力弱的问题，提供了一种菌群稳定、降解性能好的微生物混合菌群，更加适用于修复污染场地。
所述的微生物混合菌群，包括细菌和古菌。
所述的细菌包括OTUs丰度百分数为60-70％的Clostridium_sensu_stricto_7，8-15％的Sedimentibacter，5-10％的Lysinibacillus，5-10％的Georgenia muralis，2-5％的Anaerocolumna aminovalerica。
所述的古菌包括OTUs丰度百分数为65-75％的norank_d_Archaea，5-10％的norank_o_Group_1.1c，3-8％的Thermoplasmata，3-8％的Bathyarchaeia，3-8％的Methanothermobacter。
所述的细菌包括OTUs丰度百分数为66％的Clostridium_sensu_stricto_7，12％的Sedimentibacter，9％的Lysinibacillus，8％的Georgenia muralis，4％的Anaerocolumna aminovalerica。
所述的古菌包括OTUs丰度百分数为72％的norank_d_Archaea，9％的norank_o_Group_1.1c，6％的Thermoplasmata，6％的Bathyarchaeia、5％的Methanothermobacter。
本发明所述的微生物混合菌群可以以葡萄糖、乳酸和乙酸作为电子供体，γ-六六六作为电子受体有效降解中20mg/Lγ-六六六。进一步地，乳酸作为电子供体混合菌群具有更好的降解效果，乳酸浓度为2-10mM。实验室的土壤修复试验表明该混合菌群能够在35天内高效降解土壤中20mg/kg的γ-六六六，对污染土壤具有良好的修复效果，具有应用于修复γ-六六六污染水体和土壤的潜力。
附图说明
图1实施例1混合菌群的高通量测序结果细菌属水平组成。
图2实施例1混合菌群的高通量测序结果古菌属水平组成。
图3混合菌群在不同电子供体条件下对20mg/Lγ-六六六的降解效果。
图4混合菌群在不同乳酸浓度下对20mg/Lγ-六六六的降解效果。
图5混合菌群降解γ-六六六产物的色谱图。
图6混合菌群在土壤中对20mg/kgγ-六六六的降解效果。
具体实施方式
实施例1
一种厌氧微生物混合菌群的富集方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)建立无沉积物培养(sediment-free cultures)：微生物来自于受到六六六污染的土壤。取5g六六六污染土壤，接种于50mL厌氧无机盐基础培养基中，加入γ-HCH(溶解在丙酮中)使得其最终浓度为10mg/L，加入50mg/L乳酸作为电子供体。置换气体使得顶空为N2，于30℃，150r/min培养箱中培养7天。之后取10％(v/v)土壤悬液重新转接于新鲜的50mL厌氧无机盐基础培养基，加入γ-六六六(溶解在丙酮中)使得其最终浓度为10mg/L，相同条件下培养。
(2)富集驯化：定期用气相色谱(GC-MS)定量检测培养基中的γ-六六六浓度，待其浓度明显降低之后，重新转接至新鲜的无机盐培养基，并添加乳酸和γ-六六六。如此连续富集驯化并逐渐加高γ-六六六浓度至50mg/L，维持该污染物浓度继续多次驯化获得最终的厌氧微生物富集液。每转接一次的同时取相同体积培养液涂布于无机盐固体培养基中，比对每次平板上菌落特征和菌种的数量。
上述无机盐培养基按下述比例配制：NaCl 1.00g/L，MgCl2·6H2O 0.50g/L，KH2PO40.20g/L，NH4Cl 0.30g/L，KCl 0.30g/L，CaCl2·2H2O 15mg/L，FeCl2·4H2O 15mg/L，CoCl2·6H2O 0.19mg/L，MnCl2·4H2O 0.1mg/L，ZnCl2 0.070mg/L，H3BO3 0.006mg/L，Na2MoO4·2H2O0.036 mg/L，NiCl2·6H2O 0.024mg/L，CuCl2·2H2O 0.002mg/L，Na2WO4·2H2O 0.008mg/L，pH 7.2，121℃高温灭菌20min，再添加经过0.22μm滤膜滤菌的维生素溶液。无机盐固体培养基通过额外添加1.5-2.0％的琼脂制成。
采用上述方法获得微生物混合菌群，该混合菌群包括细菌和古菌，高通量测序结果属水平分类分别如图1、2所示。所述的细菌包括OTUs丰度百分数为66％的Clostridium_sensu_stricto_7，12％的Sedimentibacter，9％的Lysinibacillus，8％的Georgeniamuralis，4％的Anaerocolumna aminovalerica。
所述的古菌包括OTUs丰度百分数为72％的norank_d_Archaea，9％的norank_o_Group_1.1c，6％的Thermoplasmata，6％的Bathyarchaeia、5％的Methanothermobacter。
实施例2
以10％(v/v)接种量将混合菌群接入含20mg/Lγ-六六六的无菌的无机盐培养基中，分别以6mM葡萄糖、乳酸、乙酸作为电子供体，在30℃，150r/min培养箱中培养35天，定期取样测定培养基中六六六的浓度，考察混合菌群对γ-六六六的降解效果，结果如图3所示。混合菌群能够有效地降解培养基中的γ-六六六，葡萄糖、乳酸、乙酸组别最终的降解率分别为70.11％、88.00％、86.92％，乳酸作为电子供体具有更高的降解率。
实施例3
在上述三种电子供体中，考察乳酸浓度对混合菌群降解性能影响，设置乳酸浓度分别为2、4、6、8、10mM，以10％(v/v)接种量将混合菌群接入含20mg/Lγ-六六六的无菌的无机盐培养基中，在30℃，150r/min培养箱中培养35天，定期取样测定培养基中六六六的浓度，结果如图4所示。混合菌群在乳酸浓度为6-10mM范围内具有较好的降解效果，其中6mM是最佳浓度。在降解过程中有四氯环己烯(3,4,5,6-TeCCH)中间产物生成。图5为混合菌群在含有γ-六六六的无机盐培养基中培养7天取样的质谱图。
实施例4
设置土水质量体积比为1:2.5(g:mL)，投加10％(v/v)的混合菌液，乳酸在液体的浓度为6mM，考察混合菌液对γ-六六六浓度为22.83mg/kg实际污染土壤的修复效果(M+Lac)，未添加乳酸(M)和只添加去离子水(CK)的土壤作为对照组，在30℃，150r/min培养箱中培养，结果如图6所示。经63天的淹水修复，M+Lac、M和CK组的降解率分别能够达到95.0％、94.5％、2.0％。只添加去离子水的组别对γ-六六六降解率极低，投加混合菌液能够有效地降解γ-六六六，而添加乳酸可以在修复初期中提高降解率。
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