具体实施方式

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1菌株的筛选及鉴定

(1)菌株的离体抑菌试验

从山东省肥城市中央桃行采集的桃果实、桃叶、土壤、果柄等8份样品中分离菌株，称取1g样品接入100mL无菌水中，37℃恒温箱中震荡摇匀，对样液进行梯度稀释，稀释液涂布在含有NA固体培养基的平板内，37℃培养过夜。从长出菌落的平板上分离菌株并纯化，转接NA斜面培养基保存。

从样品中分离出100株可以形成孢子的细菌。以从腐败桃果实中分离纯化出的三株致腐菌(互隔交链孢菌、桃褐腐病病菌、枝孢样枝孢霉)为测试对象，使用打孔法，研究分离纯化出的菌株发酵液的抑菌活性，选择明显抑菌作用的菌株。根据抑菌圈直径初步筛选得到几株有不同程度抑菌致病菌扩展的菌株。分离纯化菌株的抑菌活性见表1：

表1菌株的抗真菌活性

(2)果实活体抑菌试验

将有明显抑菌作用的菌落30℃条件下200r/min，在LB液体培养基中摇培24h后进行桃果实体内实验。桃果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL拮抗菌悬浮液(1×10⁸CFU/ml)，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×10⁵CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个桃果实，平行3次，实验重复2次。

发病率计算公式为：发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。

根据果实的发病率和有伤接种后病斑的扩展情况，将具有拮抗作用的菌株挑选出来。

在本实施例中，筛选得到2株浓度为1×10⁹CFU/ml以上可完全抑制桃褐腐病菌的菌株，其中，NBL-B12005菌株防治效果最佳。根据其特征对其进行种属鉴定。

(3)菌种的鉴定

显微镜下观察纯化后的B8菌株特征，如图2所示：细菌形状的革兰氏阳性，杆菌，大小为0.6×1.0-1.4微米，单个、成对或短链排列，形成内生孢子。孢子是椭圆形的，具有中心或亚顶部定位。孢子囊没有肿胀。

菌落特征，如图1所示：LB平板固体培养基37℃培养24h后形成浅米色的圆形菌落，边缘较规则，直径2-4mm，无光泽，中心略有同心圆褶皱突起，质地粘稠。

挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37℃，180rpm震荡培养24h，取1-5ml菌液利用细菌基因组DNA提取试剂盒提取菌株基因组DNA。16S rRNA通用引物27f(5'-agagtttgatcctggctcag-3')和1492r(5'-ggttaccttgttacgactt-3')对该菌株基因组DNA扩增并送至上海铂尚生物工程股份有限公司测序。BLAST软件比对分析该菌株与以下菌株的同一性可达99.50％以上：Bacillus subtilis strain 168(99.65％)，Bacillus subtilisstrain DSM 10(99.50％)，Bacillus subtilis strain JCM 1465(99.50％)。

通过基质辅助激光解吸电离飞行时间MALDI-TOF MS质谱分析，本发明菌株与Bacillus subtilis准确率达2.201。

综合形态特征、16S rDNA基因序列结果和MALDI-TOF MS质谱分析确定，本发明菌株属于枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，命名为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005；并提供了该枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的基因序列，长度为1413bp。

实施例2植物毒性及促生长试验

细菌的植物毒性检测是以萝卜种子为模型测试对象进行，研究了本发明菌种对植物生长和发育的影响，评估了本发明菌种的植物毒性。将种子在2％浓度的单一菌液、5％浓度的单一菌液以及蒸馏水(控制组)中浸泡10min。然后用蒸馏水冲洗，均匀放置于铺好湿滤纸的培养皿中，放入恒温培养箱，温度设置为24℃。3-4天后记录种子发芽率，7天后分别记录实验组和对照组的幼苗长度。通过观察种子发芽率和幼苗的生长情况，判断植物毒性。结果如表2所示。

表2所筛细菌菌液对萝卜种子的发芽率及幼苗生长的影响

由表2可知，用2％和5％细菌菌液处理的萝卜种子与用水处理的对照组种子的发芽率没有显着差异。7天的幼苗的长度超出对照组8-16％。根据获得的数据，可以得出结论，所研究的细菌不仅不具有植物毒性，而且还对萝卜幼苗有一定的促生长作用，

同时进行了兽医毒理学研究，结果表明，枯草芽孢杆菌NBL-B12005无致病性，无毒，可用于微生物生产。

实施例3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的抗真菌活性谱

在实验室研究基础上选用改良后的Maynell以3％的甘蔗糖蜜和2％的豆粕分别作为碳源和氮源的条件下，30℃摇培2d，活菌数和孢子数分别达到3.3×10⁹CFU/ml和2.9×10⁹孢子/ml。

采用平板打孔拮抗法测定枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)对引起水果作物引起病害的多种植物致病真菌和细菌的抑制作用。下层培养基为2％PDA培养基，凝固后取1ml病原菌与5ml1.2％PDA培养基充分混匀作上层培养基，凝固后打孔器打孔(9cm)，加入100微升菌液，于冰箱内静置2h，30℃正置培养4d。通过测量抑菌圈直径，检测待测菌的抑菌谱，结果见表3和表4。

表3枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的抗真菌活性谱1

表4枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005的抗菌活性谱2

结果表明，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)NBL-B12005对引起水果作物各种病害的多种致病菌(互隔交链格孢霉Alternaria sp.、桃褐腐病菌3-4Moniliniafructicola、枝孢样枝孢霉Cladosporium sp.、桃吉尔霉Gilbertella persicaria、桃褐腐病菌2Monilinia fructicola、枯萎镰刀菌Fusarium avenaceum、链孢霉Alternariaalternata、枝孢霉Cladosporium cladosporioides、扩展青霉Penicillum expansum、链孢霉Alternaria alternata)均有良好的抑制作用，不仅形成了抑菌圈直径为20.8-29.0mm的病原体生长抑制区，在菌液的作用下，致病真菌的菌丝体上还出现了肿瘤样肿胀气泡，并且其发育停止了。

实施例4枯草芽孢杆菌NBL-B12005不同处理液对病原菌生长的影响

实验方法：将枯草芽孢杆菌菌种接种于LB培养基中，于30℃200r/min条件下恒温振荡培养12-24h，即得到芽孢杆菌发酵液；取芽孢杆菌发酵液在12000r/min下，4℃离心10min，用0.22μm滤膜将上清液过滤，即得芽孢杆菌发酵上清液；菌体用相同体积无菌生理盐水悬浮获得菌体悬浮液。采用体外平板打孔法测定枯草芽孢杆菌不同处理液对桃果实致病菌的的抑菌效果。结果如表5所示。

表5不同处理液对桃致腐菌的抑菌效果

结果表明，上述三种不同处理液对桃果实致病菌均有一定的抑制效果，发酵液和发酵上清液的抑菌效果显著。发酵液的抑菌效果更强。这说明本发明菌株的拮抗作用是菌体和其代谢产物的共同作用；本发明菌株的拮抗机理可能是营养与生存空间竞争和分泌活性抗菌物质。

实施例5培养基及培养条件优化

在实验室内使用三角瓶在振荡器中研究了不同碳源和氮源培养基对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005活菌数和抑菌活性的影响。

具体方法：取培养好的斜面，在LB平板上划线分离，培养20-24h后在无菌条件下，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，在30℃下培养180rpm震荡培养18-24h获得种子液，按照2％(v/v)的接种量，将种子液接种于不同培养基中，在温度30℃条件下，180rpm震荡培养48h，检测活菌数和抑菌活性。结果如表6所示。

表6不同碳源和氮源培养基对枯草芽孢杆菌NBL-B12005活菌数和抑菌活性的影响

注:*在所有的培养基中都使用了糖蜜及不同种类碳和氮来源的添加剂：1-甜菜糖蜜(1％)，2-甜菜糖蜜(2％)，3-甜菜糖蜜(3％)，4-甜菜糖蜜(3％)+酵母浸膏(0.25％)，5-甜菜糖蜜(3％)+玉米膏(0.25％)，6-甘蔗糖蜜(1％)，7-甘蔗糖蜜(3％)，8-甘蔗糖蜜(5％)。

结果表明，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的活菌数和抑菌活性在3号培养基中达到最佳效果。培养基中补充的有机氮源(酵母浸膏和玉米膏)在一定程度上降低了菌株的生物量积累水平和抑菌活性。根据活菌数和抑菌活性综合分析，最终获得枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的发酵培养基如下：甜菜糖蜜3.0％，K₂HPO₄×3H₂0 0.7％，(NH₄)₂SO₄ 0.15％,磷酸二氢钠0.8％，碳酸钙0.2％，MgSO₄×7H₂0 0.03％，硫酸锰0.03％；рН7.0-7.2。使用上述优化培养基在实验室环境下进行培养温度和接种量优化实验。结果如表7和表8所示。

表7温度对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005菌株活菌数及抑菌活性的影响

表8接种量对枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005菌株活菌数的影响

根据表7和表8实验数据可知，枯草芽孢杆菌(B.subtilis)NBL-B12005的最适宜温度为30°С；为达到最高活菌数，应使用3％-5％的接种量。

实施例7果实体内防腐效果试验

为考察本发明菌株对采后果实的防腐效果，本实施例中，分别以桃和梨为果实的代表，选取大小一致、健康无损伤的果实，进行果实体内实验。

(1)试验方法：果实用浓度为2％的次氯酸钠溶液浸泡杀菌2-3min，然后用无菌生理盐水冲洗掉残余的次氯酸钠后，置于无菌操作台中自然晾干，备用。用无菌打孔器在果实的赤道上人为打一个直径5mm，深3mm左右大小一致的孔。每一孔内用移液枪加入20μL液体菌剂，无菌工作台中静止2h后，至果粒伤口内及周围无流动菌悬液。然后用移液枪伤口处加入20μL病原菌孢子悬浮液(1×10⁵CFU/ml)，室温下放置2h，待果实伤口及周围无流动菌悬液后后用保鲜膜密封，放于塑料盆中，置于28℃/93％RH的培养箱中进行恒温保湿培养，5d后观察并记录果实的腐烂情况，测量伤口病斑直径，并统计发病率，对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。每个处理选用10个果实，平行3次，实验重复2次。

计算公式如下：

发病率(％)＝处理组果实发病数/处理组果实个数×100。

对致病菌扩展的抑制程度(％)＝(对照组1的病斑直径-处理组的病斑直径)/对照组1的病斑直径]×100

(2)不同处理液对桃褐腐病的抑制效果

在本实施例中，根据实施例4中方法获得菌悬液、发酵液、发酵上清液。结果如表9所示。

表9不同处理液对桃褐腐病的抑制效果

结果表明，菌悬液、发酵液及其上清液对桃褐腐病(M.fructicola 3-4)都有一定抑制作用，其中发酵液的效果最好，其次为上清夜和菌悬液。本实施例再次证明，本发明菌株是菌体及其代谢产物的共同作用来控制果实采后腐烂的发展。

(3)不同浓度发酵液在桃果实体内防腐效果

在本实施例中，分别配制浓度为1×10⁶、1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹CFU/ml的枯草芽孢杆菌NBL-B12005发酵液，分别为T4、T3、T2、T1组，结果如表10所示。

表10不同浓度的菌液在桃果实上的防腐效果

结果表明，4个处理组在桃上对桃褐腐病M.fructicola 3-4和互隔交链孢菌Alternaria sp.的防腐效果均可达60％以上，其中浓度为1×10⁹CFU/ml发酵液可完全抑制桃采后病原菌的生长，降低采后微生物病害的发生，具有显著的拮抗作用。其次1×10⁸CFU/ml发酵液组腐败率仅为10％，对两种果实病害的抑制率分别为86.0％、77.1％。

(4)皇冠梨体内防腐效果

在本实施例中，配制浓度为1×10⁸CFU/ml和1×10⁷CFU/ml的NBL-B12005发酵液与发明专利201410190713.9中优选的枯草芽孢杆菌AFB041和AFB096的菌悬液(1×10⁷CFU/ml)对桃吉尔霉在皇冠梨体内的防腐效果进行比较。对照组加入无菌水(对照2)和对应的病原菌孢子悬浮液(对照1)。如表11所示。

表11在皇冠梨果实上的防腐效果

结果表明，浓度为1×10⁸CFU/ml的枯草处理组发病率为0，相同浓度(1×10⁷CFU/ml)下，本发明菌株处理组的发病率仅为15％，发病率和病斑直径均明显低于发明专利201410190713.9中优选的枯草芽孢杆菌AFB041和AFB096菌悬液。因此，本发明菌株发酵液在果实体内的防腐效果极为显著。不仅可以减少果实腐败的发生，而且还可以抑制腐败菌的扩展。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 山东碧蓝生物科技有限公司

<120> 一种具有促生长及防腐作用的枯草芽孢杆菌及其应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1413

<212> DNA

<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum

<400> 1

ggcggctggc tcctaaaggt tacctcaccg acttcgggtg ttacaaactc tcgtggtgtg 60

acgggcggtg tgtacaaggc ccgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac 120

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