阅读说明：本技术 一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因vigs沉默体系及其构建方法与应用 (Rubber tree phytoene dehydrogenase gene VIGS silencing system and construction method and application thereof ) 是由 李辉亮 彭世清 郭冬 王颖 朱家红 于 2020-05-07 设计创作，主要内容包括：本发明实施例公开了一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用,属于生物技术领域。所述橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。本发明操作简单,建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系,有效避免了传统遗传转化需要繁重的劳动和效率低下的缺点。该体系可有效降低橡胶树中HbPDS基因的表达水平,可以获得病毒诱导的基因沉默性状,进而解决有效验证橡胶树基因功能的问题,为挖掘具有重要农艺性状的橡胶树基因,为培育优良的橡胶树品种奠定基础。(The embodiment of the invention discloses a rubber tree phytoene dehydrogenase gene VIGS silencing system and a construction method and application thereof, belonging to the technical field of biology. The rubber tree phytoene dehydrogenase gene VIGS silencing system has a nucleotide sequence shown as SEQ ID NO. 1. The method is simple to operate, a set of rapid and effective virus-induced silencing system is established, and the defects that the traditional genetic transformation needs heavy labor and is low in efficiency are effectively overcome. The system can effectively reduce the expression level of HbPDS gene in the rubber tree, can obtain virus-induced gene silencing property, further solve the problem of effectively verifying the function of the rubber tree gene, and lay a foundation for mining the rubber tree gene with important agronomic property and cultivating excellent rubber tree varieties.)

一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建 方法与应用

技术领域

本发明实施例涉及生物技术领域，具体涉及一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用。

背景技术

巴西橡胶树为大戟科科橡胶树属植物，原产于亚马逊森林。中国植胶区主要分布于海南、广东、广西、云南等地区，其中海南为主要植胶区。橡胶树为落叶乔木，树皮中的乳管生产乳状汁液的胶乳，胶乳是巴西橡胶树的主要次生代谢物质，也是天然橡胶的主要来源。橡胶树的经济寿命约30年，生长寿命约60年。通过常规杂交育种手段，培育一个橡胶树新品种需要20～30年。遗传转化体系的建立是有效验证橡胶树基因功能、缩短橡胶树育种周期、加快新品种培育的必经途径。

目前对橡胶树的相关基因的研究才开始起步，经过基因组测序后，科研工作者获得了很多基因序列，并克隆了很多基因，却无法进一步深入研究，其中主要的原因是其遗传转化体系不成熟，遗传转化的检测手段也比较少。目前用于橡胶树农杆菌遗传转化的受体主要是胚性愈伤组织，利用其它材料作为受体还没有报道。胚性愈伤组织作为转化受体存在如下缺陷：1.取材受季节限制，剥离雄蕊费工费时，花药再生能力差，很难获得胚性愈伤组织，因此无法满足一年四季的转化要求；2.组织再生能力差，很难获得转基因植株，难以满足日益增长的科研和生产需求；3.愈伤组织作为转化受体，遗传转化效率低。VIGS(virus-induced gene silencing)技术是一种高效的遗传转化体系，已应用于多种植物进行基因功能验证，但该体系目前在橡胶树上尚无应用。

发明内容

为此，本发明实施例提供一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用。

本发明利用VIGS系统在植物体内可移动的特点，以橡胶树幼苗的根、茎和叶为受体，通过侵染受体植株部位的不同条件进行的病毒诱导基因沉默体系，系统建立一种高效的不同于已报道的橡胶树遗传转化方法。本发明操作简单、快速、有效，避免传统遗传转化需要繁重的劳动和效率低下的缺点。该体系可有效降低橡胶树中HbPDS基因的表达水平，可以获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证橡胶树基因功能的问题，为挖掘具有重要农艺性状的橡胶树基因，为培育优良的橡胶树品种奠定基础。

为了实现上述目的，本发明实施例提供如下技术方案：

根据本发明实施例的第一方面，本发明实施例提供了一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系，具有如SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。

根据本发明实施例的第二方面，本发明实施例提供了上述橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系的构建方法，包括以下步骤：

S1、根据橡胶树八氢番茄红素脱氢酶HbPDS基因序列信息并结合pTRV2载体的序列信息设计特异引物：

HbPDS1F：GAATTCGGCGCTTAACTTTATTAACCCTG，

HbPDS1R：CTCGAGCTTTAGTTTCCTGTCGAACCATATG；

S2、特异引物以橡胶树cDNA为模板进行PCR扩增反应，获得大小为409bp的HbPDS目的基因片段；

S3、将步骤S2得到的HbPDS目的基因片段连接到PMD-18T载体上；

S3、将连接到PMD-18T载体上的HbPDS目的基因片段用酶切后连接到采用同样酶切后的pTRV2载体上，得到pTRV2-HbPDS重组质粒；

S4、将pTRV2-HbPDS重组质粒转化到农杆菌中，即得到VIGS沉默体系。

根据本发明实施例的第三方面，本发明实施例提供了上述橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系的应用，对两蓬叶期的橡胶树幼苗的根、茎和叶在室温下进行侵染，或者抽真空进行侵染；将侵染后的橡胶树幼苗先放在28℃下暗培养12h，然后将橡胶树幼苗放在温室苗圃中培养。

进一步地，侵染使用10mM MgCl₂+10mM MES+150μMAS的混合溶液。

进一步地，抽真空进行侵染时，真空度为0.08MPa，侵染时间为1小时。在此条件下，可增加侵染效率。

本发明实施例具有如下优点：

本发明的转化受体与以往报道均不同，橡胶树幼苗作为转化受体具有明显优势：既可以用种子苗也可以用组培苗，一年四季均有材料，可满足随时转化需要。根据橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)的编码基因序列设计特异引物，通过PCR扩增在橡胶树中获得409bp的cDNA片段。将获得的HbPDS cDNA片段构建到pTRV2载体上，获得pTRV2-HbPDS重组质粒，通过农杆菌介导的侵染受体植株根、茎和叶部位的病毒诱导基因沉默体系。本发明操作简单，建立了一套快速、有效的病毒诱导沉默体系，有效避免了传统遗传转化需要繁重的劳动和效率低下的缺点。该体系能够有效降低橡胶树中HbPDS基因的表达水平，获得病毒诱导的基因沉默性状，进而解决有效验证橡胶树基因功能的问题，为挖掘具有重要农艺性状的橡胶树基因，为培育优良的橡胶树品种奠定基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是示例性的，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1为病毒诱导的橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)基因高效沉默体系的流程图。

图2为HbPDS cDNA片段扩增电泳图和pTRV2-HbPDS重组质粒鉴定；其中：1：DNAMarker；2：pTRV2-HbPDS重组质粒；3：pTRV2-HbPDS重组质粒双酶切；4：pTRV2-HbPDS重组质粒PCR产物；5：DNA Marker。

图3为对照处理和转橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)基因处理橡胶树后出现的叶片白化的表型。

图4为qRT-PCR检测对照植株叶片和转基因植株叶片的HbPDS基因相对表达量。

具体实施方式

以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式，熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例中使用的试剂和方法，如无特殊说明，均采用常规试剂和使用常规方法。

实施例1

HbPDS目的基因片段的克隆与表达载体的构建

S1、橡胶树叶片来自中国热带农业科学院试验农场正常割胶的热研7-33-97橡胶树。总RNA按照[李辉亮.橡胶树自根幼态无性系与其供体(老态无性系)差异的分子基础研究[D].海口:海南大学，2010]中记载的方法进行提取。cDNA第一链的合成按照宝生物公司PrimeScript RTreagent Kit说明书进行。

S2、根据橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)的编码基因序列信息，我们利用生物信息工具软件pss-RNAit(https://plant grn.noble.org/pssRN Ait/)预测橡胶树八氢番茄红素脱氢酶(HbPDS)的编码基因中的siRNAs，选取了大小为409bp的一段序列。并结合pTRV2载体的多克隆位点序列信息给选取的HbPDS片段序列两端分别加上ECORⅠ和XhoI酶切位点作为PCR扩增的特异引物，分别为：

HbPDS1F：GAATTCGGCGCTTAACTTTATTAACCCTG；

HbPDS1R：CTCGAGCTTTAGTTTCCTGTCGAACCATATG，下划线部分为酶切位点序列。

S3、以步骤S1合成的cDNA为模板，用上述特异引物进行PCR扩增，在0.2ml的Eppendorf管中顺次加入以下成分：

混匀后，在DNAThermo Cycler T1上进行PCR反应，反应参数：预变性95℃3min；变性95℃10s；退火58℃30s；延伸72℃30s；35个循环；延伸72℃5min。PCR产物经回收获得409bp大小的HbPDS目的基因片段。

S4、将回收的HbPDS目的基因片段连接到PMD-18T载体上，转入大肠杆菌DH5a，挑取平板上的菌落放入液体培养基中培养。进行阳性克隆的PCR鉴定，挑选3个阳性克隆测序(如SEQ ID NO:1所示)并提取质粒。在0.2ml的Eppendorf管中顺次加入以下成分：

混匀后，在DNA Thermo Cycler T1上进行PCR反应，反应如下：预变性95℃3min；变性95℃10s；退火58℃30s；延伸72℃30s；35个循环；延伸72℃5min。

S5、将pTRV2载体和连接到PMD-18T载体上的HbPDS目的基因片段用相同酶切。在一灭菌后的0.2ml的Eppendorf管中顺次加入下列各成分：

混匀后，稍稍离心，37℃温育3h，进行琼脂糖电泳，观察酶切结果，确保酶切完全后，取酶切反应液PMD-18T载体上的HbPDS目的基因片段和同样酶切后的pTRV2载体上进行连接。反应体系如下：

混匀后稍稍离心，将管壁上的液滴收集到管底，4℃过夜。

S6、将pTRV2-HbPDS转入大肠杆菌DH5a，进行阳性克隆的PCR鉴定，提取pTRV2-HbPDS重组质粒(图2)。反应体系和反应程序同S4所述。

实施例2

重组载体的农杆菌转化及其遗传转化

S1、取实施例1得到的pTRV2-HbPDS重组质粒加入到GV3101感受态细胞中，冰上静置10min，经液氮速冻5min、37℃水浴锅中温浴5min，置于冰上静置2min后。将不加抗生素的LB液体培养基，置于28℃、150rpm条件下的摇床中进行复苏培养1.5h，然后取200μl菌液将其涂布在含抗生素(50mg/l Kan+50mg/l Rif)的LB固体培养基上。48h后从平板上挑取单克隆至300μl含抗生素(50mg/l Kan+50mg/l Rif)的LB液体培养基中培养过夜，然后进行阳性克隆的PCR鉴定，获得带pTRV2-HbPDS重组质粒的GV3101农杆菌。

S2、将筛选到的阳性克隆与含抗生素(50mg/l Kan+50mg/l Rif)的LB液体培养基以1:100的比例至于28℃、200rpm条件下的摇床中进行过夜培养，当OD₆₀₀为1.0左右，经5,000rpm 5min离心收集菌体，弃上清，用侵染Buffer(10mM MgCl₂+10mM MES+150μMAS)悬浮菌体，并调浓度至OD＝2；与用同样方法培养的含pTRV1质粒的GV3101农杆菌按1：1等体积混匀，室温静置3h。

S3、对两蓬叶时期橡胶树幼苗的根、茎和叶受体在室温下进行侵染。首先我们用无菌的石英砂轻轻的磨破橡胶树幼苗的根、茎和叶受体，让其形成伤口，然后用干净无菌的毛刷将备用的菌液涂刷在伤口上进行侵染，或者进一步抽真空(0.08MPa)进行侵染，侵染1小时，可增加侵染效率。

S4、将侵染后的橡胶树幼苗先放在26℃下暗培养12h，然后将橡胶树幼苗放在温室苗圃中培养。

S5、对照VIGS-GFP完全按照VIGS-HbPDS的方法进行，mock即为无处理的野生型。

实施例3

VIGS沉默系统效率在橡胶树的测定

S1、如图3所示，在侵染2个月后，新叶逐渐出现叶片漂白现象，随后漂白程度加深。

S2、对照植株和转基因植株总RNA的提取和cDNA合成：橡胶树叶片总RNA的提取按照文献的方法进行。cDNA第一链的合成按照宝生物公司PrimeScript RTreagent Kit说明书进行。

S3、HbPDS基因在不同材料的的荧光定量PCR分析：荧光定量采用SYBR Premix ExTaqⅡ，以肌动蛋白基因HbACT基因为内参。选择靶向沉默区域外的序列设计用于测定橡胶树中HbPDS基因。用于定量PCR的引物为：

HbPDS1F：ATGACTTTGCACGGGAGTGTTTC，

HbPDS1R：GCATGGCCCATCGATTCACTTAC；

HbACTF：CACCACCAGAGAGAAAGTACAG；

HbACTF R：GATGGACCAGACTCATCGTATTC。

反应条件为：95℃预变性60s，95℃变性7s，58℃退火20s，72℃延伸20s，40个循环。基因的相对表达量按荧光定量仪使用说明进行分析。将阴性对照中HbPDS基因的表达水平设定为任意值(1.0)以计算其他样品的相对表达水平，每个样品做3个重复。

S4、通过qRT-PCR检测了阴性对照和转基因植株不同部位叶片中HbPDS基因的相对表达量，发现转基因植株HbPDS基因表达量比对照低，最新叶中HbPDS基因表达量下调最大，请参见图4，说明VIGS系统具有很好的稳定性且可用于鉴定巴西橡胶树中基因的功能。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施例对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国热带农业科学院热带生物技术研究所

<120> 一种橡胶树八氢番茄红素脱氢酶基因VIGS沉默体系及其构建方法与应用

<130> 2020

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 409

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

ggcgcttaac tttattaacc ctgatgaact ttcaatgcag tgtatattga tagcattgaa 60

ccgatttctt caggagaaac atggttcaaa gatggctttc ttagatggga atcccccaga 120

gagactttgc atgccaattg ttgatcatat tcagtctctg ggtggtgaag tccggctaaa 180

ttcacgaata aagaaaattg agctaaataa tgatggaaca gttaaaagct ttttactaaa 240

tactggggag atcattgaag gagatgctta tgtgtttgcc actccagttg acatcctgaa 300

gcttcttttg cctgataact ggaaagagat tccttacttc aagaaattgg agaaattagt 360

tggtgttcct gttattaatg ttcacatatg gttcgacagg aaactaaag 409