一种带有筛选标记桉树遗传转化方法
阅读说明：本技术 一种带有筛选标记桉树遗传转化方法 (Genetic transformation method for eucalyptus with screening marker ) 是由 欧阳乐军 王泽琛 李莉梅 陈凯钊 刘智超 潘景音 梁楚炎 吴宇朋 于 2020-06-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种带有筛选标记桉树遗传转化方法,以尾巨桉无菌苗茎段为外植体诱导愈伤组织,经带有荧光标记基因mCherry的农杆菌转化、不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽,得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株；本发明特点是以带有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌对尾巨桉无性系幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养的转化,再经不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽,可以得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。采用本发明的方法可得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株,结果稳定,转化率良好,能应用于观察目的基因是否成功导入,也为桉树基因育种奠定了基础。(The invention discloses a genetic transformation method for eucalyptus with a screening marker, which comprises the steps of taking stem segments of aseptic seedlings of eucalyptus urophylla as explants to induce callus, and obtaining regeneration plants with a visual fluorescent marker gene mCherry through agrobacterium transformation, adventitious bud induction, bud multiplication, adventitious bud elongation, rooting and transplantation of the fluorescence marker gene mCherry; the invention is characterized in that agrobacterium with a visible fluorescence labeling gene mCherry transforms hypocotyl of clonal seedling of Eucalyptus urophydis by callus culture, and then the regenerated plant of the visible fluorescence labeling gene mCherry can be obtained by adventitious bud induction, adventitious bud elongation, bud multiplication, rooting culture and transplantation. The method can obtain the regeneration plant of the visible fluorescence labeling gene mCherry, has stable result and good transformation rate, can be used for observing whether the target gene is successfully introduced, and lays a foundation for eucalyptus gene breeding.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体是一种带有筛选标记桉树遗传转化方法。
背景技术
农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中。因此，农杆菌是一种天然的植物遗传转化体系。人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。
本方案通过带有mCherry基因的农杆菌转化对植物进行转化，以求的实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选，从而成为可视化筛选标记。
发明内容
本发明的目的在于提供一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，以解决上述背景技术中提出的问题。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，具体包括以下步骤：
S1、获得尾巨桉无菌瓶苗；
S2、无菌苗茎段切成0.5～1cm长的小段，接种在愈伤诱导培养基上，暗培养一周，培养温度25 ± 2℃。然后转入光照12 h·d-1，光照强度为2000～500 lx，温度25 ± 2℃条件培养2-3周；
S3、经愈伤诱导培养基上培养的愈伤组织转入浸染培养基，超声波30s后加入含有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌，避光28℃，200r摇床摇3h；
S4、将浸染后的愈伤组织转入不定芽诱导培养基上，在25±2℃、暗培养1周后，再转到光照强度2000～500 lx条件下培养2～3周；
S5、经不定芽诱导培养基培养上的愈伤组织转入芽增殖培养基上，并切下芽在荧光微镜下观察是否有红色荧光，然后在25±2℃、光照强度2000～2500 lx条件下培养2～3周；
S6、经芽增殖培养基培养的愈伤组织转入不定芽伸长培养基上，在25±2℃、光照强度2000～2500 lx条件下培养，促进芽伸长；
S7、当芽伸长到3～4 cm时，将不定芽转入生根培养基上培养，以促其生根；
S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
进一步的，所述愈伤诱导培养基为：MS + LC 1.0mL/mL+ IAA 0.5mg/mL + Vc 1mg/mL+ 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。
进一步的，所述浸染培养基为：MS+蔗糖30g/L。
进一步的，所述不定芽诱导培养基为：MS +6-BA 0.5mg/mL + 萘乙酸（NAA）0.5mg/mL+ 腐胺 500 mmol/L + 亚精胺 100mmol/L +维生素C（ Vc） 1 mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。
进一步的，所述芽增殖培养基为：1/2 MS + 6-BA 0.5mg/mL +萘乙酸（NAA）0.5mg/mL + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9 。
进一步的，所述生根培养基为：1/2 MS + 吲哚丁酸（IBA）1mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂7 g/L，pH 5.8～6.0 。
进一步的，所述1/2 MS(Murashige and Skoog)培养基为：大量元素为MS的一半，其余不变，蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH为5.8～5.9。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过带有mCherry基因的农杆菌转化对植物进行转化，可实现在植物转化后对阳性转化植物的形态学标记筛选，从而成为可视化筛选标记的转化方法。
本发明特点是以带有可视化荧光标记基因mCherry的农杆菌对尾巨桉无性系幼苗下胚轴为外植体经愈伤组织培养的转化，再经不定芽诱导、不定芽伸长、芽增殖以及生根培养、移栽，可以得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。采用本发明的方法可得到可视化荧光标记基因mCherry的再生植株，结果稳定，转化率良好，能应用于观察目的基因是否成功导入，也为桉树基因育种奠定了基础。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。
一种带有筛选标记桉树遗传转化方法，本发明以尾巨桉无菌苗茎段为外植体诱导愈伤组织，经带有荧光标记基因mCherry的农杆菌转化、不定芽诱导、芽增殖、不定芽伸长、生根及移栽，得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
具体包括以下步骤：
S1、获得尾巨桉无菌苗，本实施例中的尾巨桉无菌苗为由国家林业局桉树研究开发中心提供的尾巨桉无菌瓶苗；
S2、将步骤S1中的尾巨桉无菌苗去掉顶芽与根部，将下胚轴切成0.5～1cm长的小段，将此接种于愈伤诱导培养基（MS + LC 1mg/mL + IAA 0.5mg/mL + Vc 1 mg/mL+ 蔗糖30 g/L+ 琼脂 7 g/L，pH 5.8 ～5.9），暗培养一周，培养温度25 ± 2℃。然后转入光照12 h·d-1，光照强度为2000～500 lx，温度25 ± 2℃条件培养2-3周；
S3、愈伤培养后，将步骤S2得到愈伤组织置于浸染培养基（MS+蔗糖30 g/L）,超声波30S后加入带有荧光标记基因mCherry的农杆菌，避光于28℃、200r的摇床中摇3h，得到外植体；
S4、浸染后，将外植体转移到不定芽诱导培养基（MS+ 6-BA 0.5ml/mL + NAA 0.5mg/mL+ 腐胺 500mmol/L + 亚精胺 100mmol/L + Vc 1 mg/L + 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH5.8～5.9）上，在25±2℃，暗培养1周后，然后在照强度2000～2500 lx条件下，培养2～3周；
S5、不定芽诱导培养2～3周后，观察愈伤组织外围是否长菌，并将愈伤组织转移到芽增殖培养基（MS + 6-BA 0.5mg/mL + NAA 0.5mg/mL + cef 200mg/ml+ 蔗糖30 g/L + 琼脂7 g/L，pH 5.8～5.9）上，在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000～2500 lx条件下，培养2～3周；
S6、将芽增殖培养得到的芽丛切成单株，并在荧光显微镜下观察，芽丛是否带有红色荧光。然后将芽丛转移到芽伸长培养基（1/2 MS + NAA 0.5mg/mL + LC 1mg/mL + Vc 1mg/mL+ 蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9）上，在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000～2500 lx条件下，培养2～3周；
S7、将3～5 cm高的无菌苗转入生根培养基（1/2 MS + IBA 1mg/mL + 蔗糖30 g/L +琼脂 7 g/L，pH 5.8～5.9）上，在25±2℃、光照12 h·d-1、光照强度2000～2500 lx条件下，培养2～3周；
S8、将生根良好的幼苗从恒温光照培养箱移至室外自然环境中炼苗7d，揭开封瓶膜在练苗2d，移栽到灭菌的黄心土中生长，得到带有可视化荧光标记基因mCherry的再生植株。
本实施例中的MS为MS培养基，1/2 MS培养基为：大量元素为MS的一半，其余不变，蔗糖30 g/L + 琼脂 7 g/L，pH为5.8～5.9。
上面对本专利的较佳实施方式作了详细说明，但是本专利并不限于上述实施方式，在本领域的普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本专利宗旨的前提下做出各种变化。