具体实施方式

以下通过特定的具体实施例说明本发明的实施方式，该领域技术人员可由本说明书所描述的内容轻易地了解本发明的优点及功效。本发明亦可借由其它不同的实施方式加以施行或应用，本说明书中的各项细节亦可基于不同观点与应用，在不悖离本发明所描述的精神下赋予不同的修饰与变更。此外，本文所有范围和数值都是包含及可合并的。落在本文中所述的范围内的任何数值或点，例如任何整数，都可以作为最小值或最大值以导出下位的范围等。

除非文中另有说明，否则说明书及所附权利要求书中所使用的单数形式“一”及“该”包括复数个体。

除非文中另有说明，否则说明书及所附权利要求书中所使用的术语“或”包括“及/或”的含义。

本发明提供一种表达载体，其包括编码赖氨酸脱羧酶CadA的核苷酸序列以及控制该赖氨酸脱羧酶的核酸分子表达的组成型启动子序列。本发明亦提供一种包含该表达载体的重组微生物及利用该微生物生产1,5-戊二胺的方法。

如本文所使用，术语“赖氨酸脱羧酶”是指参与生物体生成1,5-戊二胺反应的酶，包括两种赖氨酸脱羧酶，即赖氨酸脱羧酶1(lysine decarboxylase 1，CadA)及赖氨酸脱羧酶2(lysine decarboxylase 2，LdcC)，其中CadA为诱导型酶，由缺氧、过多赖氨酸供给及pH改变所诱导，而LdcC则为组成型酶，不受外在pH改变所影响[6]。

根据本发明的具体实施例，该编码赖氨酸脱羧酶CadA的核苷酸序列为具有与SEQID NO：1至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％)相似度且与SEQ ID NO：1具有相同活性的序列，例如可表达出具有赖氨酸脱羧酶活性的蛋白质。于另一具体实施例中，该赖氨酸脱羧酶CadA具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2具有保守性变异的氨基酸序列。

如本文所使用，术语“序列相似度百分比”是指候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基与参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸残基完全相同的百分比。于进行上述比对时，可将所述的候选蛋白质或核酸片段与所述的蛋白质或核酸片段并排，并于必要时引入间隙，以使二序列形成最高的序列相似度。在计算相似度时，保守性变异的氨基酸残基视为不同的残基；简并密码子的核苷酸残基也视为不同的残基，例如同样编码天冬酰氨的密码子AAU和AAC之间，视为有一个不同的残基U或C。

应理解，相较于本发明中作为参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列，序列中的至少一部分经修饰(如删除、取代或添加)的候选蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸序列亦在本发明的范围内，只要所得的候选蛋白质或核酸片段实质上具有与参考蛋白质或核酸片段的氨基酸或核苷酸相同的生物活性，这归因于密码子简并性(codondegeneracy)。举例而言，在本发明所编码CadA的核苷酸序列中，可在编码区中产生各种修饰，限制条件在于其不改变自该编码区表达的多肽的活性。因此，本发明所编码CadA的核苷酸序列可为具有SEQ ID NO：1的核苷酸序列或与SEQ ID NO：1至少有80％序列相似度的任何核苷酸序列，只要该核苷酸序列所编码的蛋白能够呈现CadA的活性。同理，本发明的CadA可为具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列或与SEQ ID NO：2同源的任何蛋白质，只要该蛋白质实质上能够呈现CadA的活性。

如本文所使用，术语“组成型启动子”是指在多数或全部组织中保持持续活性的启动子，相对于诱导型启动子必须受到外界信号或诱导物调控，组成型启动子可持续地表达特定基因。

适用于本发明的组成型启动子包括属于J系列组成型启动子中的成员，例如：J23100、J23101、J23102、J23103、J23104、J23105、J23106、J23107、J23108、J23109、J23110、J23111、J23112、J23113、J23114、J23115、J23116、J23117、J23118及J23119。于一个具体实施例中，本发明所使用的组成型启动子可为J23100、J23109或J23114。于另一具体实施例中，该组成型启动子具有SEQ ID NO：3的序列或与SEQ ID NO：3至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％)相似度且与SEQ ID NO：3具有相同活性的序列，例如同样可作为组成型启动子的序列。

根据本发明的具体实施例，本发明的表达载体进一步包括选自下列所组成组的至少一者：标记基因序列、报告基因序列、抗生素抗性基因序列、限制酶切割位置序列、聚腺苷酸化(polyadenylation)位置序列、增强子序列、终端子序列以及调节子序列。于另一具体实施例中，该表达载体具有SEQ ID NO：4的序列或与SEQ ID NO：4至少有80％(例如：至少82％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或至少100％)相似度且与SEQ ID NO：4具有相同活性的序列。

如本文所使用，术语“重组”是指以人工方式组合两个彼此分离的序列片段。一般而言，术语“重组”是指核酸、蛋白质或微生物含有源自于多个不同来源的遗传物质，或由源自于多个不同来源的遗传物质编码，诸如源自于两种或更多种不同品系或物种的生物。

如本文所使用，术语“微生物”属于微观生物体，包括细菌、古细菌、病毒或真菌等。如于本文中所使用，“微生物”的引述应理解为涵盖“细菌”。

适用于作为本发明的表达载体的微生物宿主包括，但不限于，属于埃希氏杆菌属(Escherichia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、普罗维登斯菌属(Providencia)、棒状杆菌属(Corynebacterium)或短杆菌属(Brevibacterium)的微生物。于一个具体实施例中，本发明所使用的微生物宿主能够于体内表达赖氨酸脱羧酶CadA。于另一具体实施例中，本发明所使用的微生物宿主除了能够于体内表达赖氨酸脱羧酶CadA外，对于戊二胺也具有耐受性。

根据本发明的具体实施例，本发明用于生产1,5-戊二胺的方法包括在培养基中以足以产生赖氨酸脱羧酶CadA的条件培养上述微生物宿主。于一个具体实施例中，该培养基可为LB培养基。于另一具体实施例中，该方法包括以高密度发酵法培养该微生物。

根据本发明的具体实施例，该方法进一步包括调整该经培养的微生物的OD₆₀₀浓度达1至6后，将该微生物与赖氨酸于溶液中混和。

根据本发明的具体实施例，该赖氨酸于该溶液中的浓度为1M至2M。根据本发明的另一具体实施例，该溶液的pH值可为4至8。

根据本发明的具体实施例，该溶液中可进一步含有浓度为0.01mM至0.05mM的辅助因子。

如本文所使用，术语“辅助因子”包含为具有正常酶活性所需的非蛋白质化合物。该等化合物可为有机物或无机物，例如，适用于本发明的辅助因子包括，但不限于，磷酸吡哆醛(pyridoxal-5'-phosphate，PLP)。

以下通过特定的具体实施例进一步说明本发明的特点及功效，但非用于限制本发明的范围。

实施例

化学制剂：

氯化钠购自Sigma Aldrich Co.(美国)。酵母提取物购自Oxoid(中国台湾)。胰蛋白购自Cyrusbioscience(中国台湾)。琼脂(agar)购自BD Difco脱水培养基(法国)。琼脂糖(agarose)购自GeneDireX(中国台湾)。磷酸吡哆醛(PLP)、乙氧基亚甲基丙二酸二乙酯(diethyl ethoxymethylenemalonate，DEEMM)和醋酸钠购自Sigma Aldrich Co.(美国)。L-赖氨酸盐酸盐购自Cyrusbioscience(中国台湾)。D(+)-葡萄糖购自Comieco(义大利)。磷酸二氢钾和磷酸氢二钾购自Showa Chemical Industry Co.(日本)。用于HPLC分析的乙腈购自Spectrum Chemical Manufacturing Corp.(美国)。PCR试剂Ex-Tag购自Takara BioInc.(美国)。限制酶购自New England Biolabs(美国)。T4 DNA连接酶购自Leadgene Co.,Ltd.(韩国)。引物由Integrated DNA Technologies(美国)合成。

实施例1：重组表达载体的构建

以大肠杆菌K-12MG1655的基因组作为模板，设计引物HindIII-CadA-F(5’-GCAAGC TTA TGA ACG TTA TTG CAATAT TGA ATC AC-3’(SEQ ID NO：5))及BglII-CadA-R(5’-GCA GAT CTT CAT TTT TTG CTT TCT TCT TTC AAT ACC TTA ACG GTA TAG CGG CC-3’(SEQID NO：6))，并进行聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)。

PCR反应用于扩增特定DNA序列片段，所需要的材料包含DNA模板、5’端引物、3’端引物、去氧核苷酸三磷酸(dNTP)、10x聚合酶缓冲液、聚合酶，其中在本实施例中所使用的聚合酶包括Ex-Taq。PCR产物以DNA电泳分析并割胶回收，得到扩增的赖氨酸脱羧酶CadA片段。

将扩增的CadA片段以HindIII及BglII进行酶切反应，接着将CadA片段插入pSU-J23100载体内，构建成pSU-J23100-CadA质体。如图1A所示，该质体包含组成型启动子J23100(Accession:LP934757)、核糖体结合位点B0034RBS(Biobrick No.BBa B0034)、以及由该启动子J23100所控制表达的CadA基因。

进行转化时，取一管市售DH5a胜任细胞，加入pSU-J23100-CadA质体约10μL，先于冰上放置30分钟，再置于42℃水浴加热1.5分钟，之后置于冰上5至10分钟，接着加入400μL的LB液态培养基或SOC(super optimal broth with catabolites repression)培养基，置于37℃培养箱中震荡培养约60至90分钟，再以4000rpm离心3分钟，去除300μL的上清液，将含有重组DNA的胜任细胞全数涂布于含抗生素的固态培养基，并置于37℃环境下培养过夜。

由此固态培养基上所生成的菌落，选取数颗接种于含抗生素的液态试管培养基中，于37℃培养箱中培养过夜。次日，自前培养液中取2mL菌液进行质体抽取，并以限制酶切割进行验证。pSU-J23100-CadA质体的全长为4267bp，与图1B的DNA电泳结果一致(即箭头所示的片段)，验证CadA基因成功构建于pSU载体。

实施例2：表达宿主测试

为选择对于戊二胺具有较佳耐受性的微生物作为表达宿主，选择常见的三种大肠杆菌菌株：BL21、K-12W3110及MG1655。

首先，将该三种菌株个别培养2小时，再将0.2M的戊二胺加入三菌株的培养液内。如图2所示，在不加入戊二胺的情况下，W3110及MG1655较BL21生长更为快速；而在加入戊二胺后，三菌株的生长速率皆有延迟，且菌量皆下降，但W3110于4至12小时期间的生长速率最快且下降的幅度最小，因此可认为具有较高的戊二胺耐受性，故后续选择以大肠杆菌K-12W3110菌株作为表达宿主。

实施例3：重组微生物的制备

将实施例1所制得并保存于选染宿主E.coli DH5a中的pSU-J23100-CadA质体进行质体抽取，并转染入大肠杆菌K-12 W3110菌株，培养12小时后分析其蛋白质表达量，并以野生型W3110作为对照。

如图3的结果显示，转染株JCadA(本文中亦称之为JcadA/W3110或W3110-JCadA)相较于野生型W3110具有较高的CadA表达量(即箭头所示的片段)。

大肠杆菌转染株W3110-JCadA已于2020年7月15日根据布达佩斯条约保藏于德国微生物及细胞培养收集中心(德国，不伦瑞克市，D-38124，因霍芬大街7B(Inhoffenstr.7B,D-38124 Braunschweig，Germany))，并已取得由国际保存机构DSMZ的登录号DSM 33576。此生物性材料已进行并通过存活性试验。

实施例4：重组微生物的活性测试

将实施例3的转染株JcadA/W3110经培养后，以10,000rpm离心10分钟，再使细胞沉淀物(pellet)悬浮于去离子水，并调整该菌液于600nm波长处的吸光值(OD₆₀₀)达到6(OD₆₀₀＝6)，再将其加入含有作为底物的1M赖氨酸，以及作为辅助因子的0.05mM磷酸吡哆醛(PLP)的溶液中，并置于培养箱中震荡反应(35℃、200rpm)。反应期间确认溶液中剩余的赖氨酸含量及所生成的戊二胺含量。

如图4所示，以转染株JcadA/W3110作为全细胞催化剂时，随催化反应时间增加，赖氨酸的含量减少，且戊二胺的含量增加，其显示转染株JcadA/W3110可将赖氨酸催化成戊二胺；反观野生型W3110，赖氨酸残留量仅些微降低，而完全无戊二胺生成。由此可见，利用组成型表达系统作为全细胞催化剂，相较于野生型W3110确实更具CadA的活性，而可通过invitro的方式快速催化生产1,5-戊二胺。

实施例5：诱导型与组成型微生物系统的产量与活性比较

为比较组成型表达系统的菌株与诱导型表达系统的菌株的CadA活性，将JcadA/W3110(组成型菌株)与T7cadA/BL21(DE3)(诱导型菌株)LB培养基的相同条件下以5L发酵槽(FB-6S,FIRSTEK,中国台湾)分别进行培养，并记录培养33小时内的菌生长数及活性状态。发酵槽条件为：溶氧(dissolved oxygen，DO)10至30％、空气流率1.5vvm、pH＝6.8、32℃、100rpm，且T7cadA/BL21(DE3)的培养基中另添加有IPTG诱导剂(添加浓度为0.00167g/L)。菌数以分光光度计波长600nm进行OD值量测，而赖氨酸脱羧酶CadA的活性则以BP测定法进行测量。

BP测定法的流程简述如下：

首先将菌块定量为OD₆₀₀＝5，再进行高压破菌得到含有赖氨酸脱羧酶的可溶性蛋白样品。经由赖氨酸脱羧酶催化反应产生戊二胺量增加。BP呈色剂在波长595nm下可被检测。使用下表1所列的反应条件测量赖氨酸脱羧酶活性，借由波长595nm差(△OD₅₉₅)与经HPLC定量的戊二胺的检量线图作转换，可计算出酶活性。

表1.赖氨酸脱羧酶活性测定方法的反应条件

如图5所示，JcadA/W3110于培养时不须加入诱导剂生产CadA，因此其生物量较同时间的诱导型菌株高，且经BP测定法测量CadA的活性，结果显示JcadA/W3110于发酵30小时后，仍能保有150g_DAP/g_DCW/h以上的CadA活性(即活性比度(specific activity))，甚至较诱导型菌株高出2倍。

实施例6：质体稳定性测试

为测试质体稳定性，将转染株JcadA/W3110进行继代培养，继代方式为由-80℃菌库接种于培养液中培养，培养12小时后，稀释涂布于平板培养基进行活化，并以此作为第0代；接着，再从此经活化的平板培养基中选取单一菌落接种于培养液中培养，培养至12小时后，稀释涂布于平板培养基上，并以此作为第1代；之后，每隔7天皆从第0代的平板培养基中选取单一菌落接种于培养液中培养，持续1个月。

将培养12小时的细胞以灭菌水清洗两次，再浓缩至一定量的OD数值，再于100℃水浴槽下加热10分钟使细胞溶解，接着再以最高转速离心10分钟，以分离细胞沈淀物与细胞内所溶解出的物质。利用qPCR(quantitative PCR)进行质体拷贝数测定。

图6A显示活化2周的菌落可达最大拷贝数；于2周后，拷贝数呈现下降趋势；于活化1个月后，其拷贝数仍维持略高于最初的拷贝数。此外，图6B及下表2显示，活化2周后的蛋白质表达量皆有下降趋势，由此等结果可知，此质体的拷贝数虽有下降，但仍可维持稳定的表达。

表2.蛋白质表达定量分析

此外，将转染株JcadA/W3110培养于添加有抗生素的培养基中，并测试在不同的抗性浓度下，此质体能否维持其稳定性。抗性培养的方式为：由-80℃菌库接种于培养液中培养，以此作为前培养，再接种1％的前培养菌液至4mL的养菌管中，依序添加不同浓度(0、5、10、25ppm)的氯霉素(chloramphenicol)，并于37℃培养箱中培养12小时后，收取1至2mL的菌液进行分析。

如图6C及6D及以下表3所显示，在不同氯霉素浓度下生长的菌株，其质体拷贝数皆维持一定值，且蛋白质表达量仍皆一致，甚至能在不加抗性的环境下维持蛋白质的表达，此说明质体可稳定存在于JcadA/W3110菌株内。

表3.蛋白质表达定量分析

实施例7：放大生产的产量比较：

于本实施例中，以锥形瓶、发酵槽及高密度发酵槽三种培养策略条件生产全细胞催化剂JcadA/W3110，并测试其菌量及活性状态。菌数以分光光度计波长600nm进行OD值量测，赖氨酸脱羧酶活性则以BP测定法进行测量。培养基的组成及培养条件分别如下表4及表5所示：

表4.测试培养基的组成

表5.培养条件

图7显示三种培养方式所生产的全细胞催化剂的产量及活性状态，其量化数据另显示于下表6。由此等结果显示可知，相较于锥形瓶及发酵槽，利用高密度发酵槽的培养不但能够提高菌量，还能够提升单位菌量的活性。更具体地，利用高密度发酵法可大幅提升菌量，并生成30克/升且活性达170U/mg/小时的赖氨酸脱羧酶，可用于制备具有高赖氨酸脱羧酶活性的1,5-戊二胺全细胞催化剂。

表6.不同培养方式所生产的全细胞催化剂产量

实施例8：冷冻保存活性降解率测试

将发酵槽所生产的全细胞催化剂JcadA/W3110于-80℃冷冻保存，并在保存第20天及第130天时分别取出进行培养，并测试其活性状态。解冻时将菌块进行OD值定量破菌，并以BP测定法测量其活性。

图8显示冷冻保存20天后，JcadA/W3110仍具有与未经冷冻时相同的CadA活性，且在冷冻保存130天后，仍具有约一半的酶活性，其剩余活性仍存有诱导型菌株的95％活性。由此可见，利用非诱导型表达系统于W3110所表达的赖氨酸脱羧酶确实具有蛋白质表达量高、酶活性高且降解率慢等效果。

上述实施例仅为例示性说明，而非用于限制本发明。任何该领域技术人员均可在不违背本发明的精神及范围下，对上述实施例进行修饰与改变。因此，本发明的权利保护范围由所附的权利要求书所定义，只要不影响本发明的效果及实施目的，应涵盖于此公开技术内容中。

参考文献

[1]Z.G.Qian,X.X.Xia,S.Y.Lee(2011)Metabolic engineering of Escherichiacoli for the production of cadaverine:a five carbon diamine.Biotechnology andBioengineering,108(1),93-103.

[2]D.H.Kwak,H.G.Lim,J.Yang,S.W.Seo,G.Y.Jung(2017)Synthetic redesignof Escherichia coli for cadaverine production from galactose.Biotechnologyfor Biofuels,10(1),20.

[3]J.Wang,X.Lu,H.Ying,W.Ma,S.Xu,X.Wang,K.Chen,P.Ouyang(2018)A novelprocess for cadaverine bio-production using a consortium of two engineeredEscherichia coli.Frontiers in Microbiology,9,1312.

[4]W.C.Ma,W.J.Cao,H.Zhang,K.Q.Chen,Y.Li,P.K.Ouyang(2015)Enhancedcadaverine production from L-lysine using recombinant Escherichia coli co-overexpressing CadA and CadB.Biotechnol.Lett.,37,799-806.

[5]H.J.Kim,Y.H.Kim,J.H.Shin,S.K.Bhatia,G.Sathiyanarayanan,H.M.Seo,K.Y.Choi,Y.H.Yang,K.Park(2015)Optimization of direct lysine decarboxylasebiotransformation for cadaverine production with whole-cell biocatalysts athigh lysine concentration,J.Microbiol.Biotechnol.,25,1108-1113.

[6]W.C.Ma,K.Q.Chen,Y.Li,N.Hao,X.Wang,P.K.Ouyang(2017)Advances incadaverine bacterial production and its applications,Engineering,3,308-317.

序列表

<110> 中国石油化学工业开发股份有限公司

<120> 用于生产1,5-戊二胺的重组微生物及方法

<130> 115196

<160> 6

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1932

<212> DNA

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 1

atgaacgaga acctgccgtt gtacgcgttc gctaatacgt attccactct cgatgtaagc 60

ctgaatgacc tgcgtttaca gattagcttc tttgaatatg cgctgggtgc tgctgaagat 120

attgctaata agatcaagca gaccactgac gaatatatca acactattct gcctccgctg 180

actaaagcac tgtttaaata tgttcgtgaa ggtaaatata ctttctgtac tcctggtcac 240

atgggcggta ctgcattcca gaaaagcccg gtaggtagcc tgttctatga tttctttggt 300

ccgaatacca tgaaatctga tatttccatt tcagtatctg aactgggttc tctgctggat 360

cacagtggtc cacacaaaga agcagaacag tatatcgctc gcgtctttaa cgcagaccgc 420

agctacatgg tgaccaacgg tacttccact gcgaacaaaa ttgttggtat gtactctgct 480

ccagcaggcg gcaccattct gattgaccgt aactgccaca aatcgctgac ccacctgatg 540

atgatgagcg atgttacgcc aatctatttc cgcccgaccc gtaacgctta cggtattctt 600

ggtggtatcc cacagagtga attccagcac gctaccattg ctaagcgcgt gaaagaaaca 660

ccaaacgcaa cctggccggt acatgctgta attaccaact ctacctatga tggtctgctg 720

tacaacaccg acttcatcaa gaaaacactg gatgtgaaat ccatccactt tgactccgcg 780

tgggtgcctt acaccaactt ctcaccgatt tacgaaggta aatgcggtat gagcggtggc 840

cgtgtagaag ggaaagtgat ttacgaaacc cagtccactc acaaactgct ggcggcgttc 900

tctcaggctt ccatgatcca cgttaaaggt gacgtaaacg aagaaacctt taacgaagcc 960

tacatgatgc acaccaccac ttctccgcac tacggtatcg tggcgtccac tgaaaccgct 1020

gcggcgatga tgaaaggcaa tgcaggtaag cgtctgatta acggttctat tgaacgtgcg 1080

atcaaattcc gtaaagagat caaacgtctg agaacggaat ctgatggctg gttctttgat 1140

gtatggcagc cggatcatat cgatacgact gaatgctggc cgctgcgtcc tgacagcacc 1200

tggcacggct tcaaaaacat cgataacgag cacatgtatc ttgacccgat caaagtcacc 1260

ctgctgactc cggggatgga aaaagacggc accatgagcg actttggtat tccggccagc 1320

atcgtggcga aatacctcga cgaacatggc atcgttgttg agaaaaccgg tccgtataac 1380

ctgctgttcc tgttcagcat cggtatcgat aagaccaaag cactgagcct gctgcgtgct 1440

ctgactgact ttaaacgtgc gttcgacctg aacctgcgtg tgaaaaacat gctgccgtct 1500

ctgtatcgtg aagatcctga attctatgaa aacatgcgta ttcaggaact ggctcagaat 1560

atccacaaac tgattgttca ccacaatctg ccggatctga tgtatcgcgc atttgaagtg 1620

ctgccgacga tggtaatgac tccgtatgct gcattccaga aagagctgca cggtatgacc 1680

ggagaagttt acctcgacga aatggtaggt cgtattaacg ccaatatgat ccttccgtac 1740

ccgccgggag ttcctctggt aatgccgggt gaaatgatca ccgaagaaag ccgtccggtt 1800

ctggagttcc tgcagatgct gtgtgaaatc ggcgctcact atccgggctt tgaaaccgat 1860

attcacggtg cataccgtca ggctgatggc cgctataccg ttaaggtatt gaaagaagaa 1920

agcaaaaaat ga 1932

<210> 2

<211> 715

<212> PRT

<213> 大肠杆菌(Escherichia coli)

<400> 2

Met Asn Val Ile Ala Ile Leu Asn His Met Gly Val Tyr Phe Lys Glu

1 5 10 15

Glu Pro Ile Arg Glu Leu His Arg Ala Leu Glu Arg Leu Asn Phe Gln

20 25 30

Ile Val Tyr Pro Asn Asp Arg Asp Asp Leu Leu Lys Leu Ile Glu Asn

35 40 45

Asn Ala Arg Leu Cys Gly Val Ile Phe Asp Trp Asp Lys Tyr Asn Leu

50 55 60

Glu Leu Cys Glu Glu Ile Ser Lys Met Asn Glu Asn Leu Pro Leu Tyr

65 70 75 80

Ala Phe Ala Asn Thr Tyr Ser Thr Leu Asp Val Ser Leu Asn Asp Leu

85 90 95

Arg Leu Gln Ile Ser Phe Phe Glu Tyr Ala Leu Gly Ala Ala Glu Asp

100 105 110

Ile Ala Asn Lys Ile Lys Gln Thr Thr Asp Glu Tyr Ile Asn Thr Ile

115 120 125

Leu Pro Pro Leu Thr Lys Ala Leu Phe Lys Tyr Val Arg Glu Gly Lys

130 135 140

Tyr Thr Phe Cys Thr Pro Gly His Met Gly Gly Thr Ala Phe Gln Lys

145 150 155 160

Ser Pro Val Gly Ser Leu Phe Tyr Asp Phe Phe Gly Pro Asn Thr Met

165 170 175

Lys Ser Asp Ile Ser Ile Ser Val Ser Glu Leu Gly Ser Leu Leu Asp

180 185 190

His Ser Gly Pro His Lys Glu Ala Glu Gln Tyr Ile Ala Arg Val Phe

195 200 205

Asn Ala Asp Arg Ser Tyr Met Val Thr Asn Gly Thr Ser Thr Ala Asn

210 215 220

Lys Ile Val Gly Met Tyr Ser Ala Pro Ala Gly Ser Thr Ile Leu Ile

225 230 235 240

Asp Arg Asn Cys His Lys Ser Leu Thr His Leu Met Met Met Ser Asp

245 250 255

Val Thr Pro Ile Tyr Phe Arg Pro Thr Arg Asn Ala Tyr Gly Ile Leu

260 265 270

Gly Gly Ile Pro Gln Ser Glu Phe Gln His Ala Thr Ile Ala Lys Arg

275 280 285

Val Lys Glu Thr Pro Asn Ala Thr Trp Pro Val His Ala Val Ile Thr

290 295 300

Asn Ser Thr Tyr Asp Gly Leu Leu Tyr Asn Thr Asp Phe Ile Lys Lys

305 310 315 320

Thr Leu Asp Val Lys Ser Ile His Phe Asp Ser Ala Trp Val Pro Tyr

325 330 335

Thr Asn Phe Ser Pro Ile Tyr Glu Gly Lys Cys Gly Met Ser Gly Gly

340 345 350

Arg Val Glu Gly Lys Val Ile Tyr Glu Thr Gln Ser Thr His Lys Leu

355 360 365

Leu Ala Ala Phe Ser Gln Ala Ser Met Ile His Val Lys Gly Asp Val

370 375 380

Asn Glu Glu Thr Phe Asn Glu Ala Tyr Met Met His Thr Thr Thr Ser

385 390 395 400

Pro His Tyr Gly Ile Val Ala Ser Thr Glu Thr Ala Ala Ala Met Met

405 410 415

Lys Gly Asn Ala Gly Lys Arg Leu Ile Asn Gly Ser Ile Glu Arg Ala

420 425 430

Ile Lys Phe Arg Lys Glu Ile Lys Arg Leu Arg Thr Glu Ser Asp Gly

435 440 445

Trp Phe Phe Asp Val Trp Gln Pro Asp His Ile Asp Thr Thr Glu Cys

450 455 460

Trp Pro Leu Arg Ser Asp Ser Thr Trp His Gly Phe Lys Asn Ile Asp

465 470 475 480

Asn Glu His Met Tyr Leu Asp Pro Ile Lys Val Thr Leu Leu Thr Pro

485 490 495

Gly Met Glu Lys Asp Gly Thr Met Ser Asp Phe Gly Ile Pro Ala Ser

500 505 510

Ile Val Ala Lys Tyr Leu Asp Glu His Gly Ile Val Val Glu Lys Thr

515 520 525

Gly Pro Tyr Asn Leu Leu Phe Leu Phe Ser Ile Gly Ile Asp Lys Thr

530 535 540

Lys Ala Leu Ser Leu Leu Arg Ala Leu Thr Asp Phe Lys Arg Ala Phe

545 550 555 560

Asp Leu Asn Leu Arg Val Lys Asn Met Leu Pro Ser Leu Tyr Arg Glu

565 570 575

Asp Pro Glu Phe Tyr Glu Asn Met Arg Ile Gln Glu Leu Ala Gln Asn

580 585 590

Ile His Lys Leu Ile Val His His Asn Leu Pro Asp Leu Met Tyr Arg

595 600 605

Ala Phe Glu Val Leu Pro Thr Met Val Met Thr Pro Tyr Ala Ala Phe

610 615 620

Gln Lys Glu Leu His Gly Met Thr Glu Glu Val Tyr Leu Asp Glu Met

625 630 635 640

Val Gly Arg Ile Asn Ala Asn Met Ile Leu Pro Tyr Pro Pro Gly Val

645 650 655

Pro Leu Val Met Pro Gly Glu Met Ile Thr Glu Glu Ser Arg Pro Val

660 665 670

Leu Glu Phe Leu Gln Met Leu Cys Glu Ile Gly Ala His Tyr Pro Gly

675 680 685

Phe Glu Thr Asp Ile His Gly Ala Tyr Arg Gln Ala Asp Gly Arg Tyr

690 695 700

Thr Val Lys Val Leu Lys Glu Glu Ser Lys Lys

705 710 715

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> 启动子J23100

<400> 3

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagc 35

<210> 4

<211> 4239

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> pSU-J23100-CadA

<400> 4

ttgacggcta gctcagtcct aggtacagtg ctagcggatc caaagaggag aaaaagctta 60

tgaacgttat tgcaatattg aatcacatgg gggtttattt taaagaagaa cccatccgtg 120

aacttcatcg cgcgcttgaa cgtctgaact tccagattgt ttacccgaac gaccgtgacg 180

acttattaaa actgatcgaa aacaatgcgc gtctgtgcgg cgttattttt gactgggata 240

aatataatct cgagctgtgc gaagaaatta gcaaaatgaa cgagaacctg ccgttgtacg 300

cgttcgctaa tacgtattcc actctcgatg taagcctgaa tgacctgcgt ttacagatta 360

gcttctttga atatgcgctg ggtgctgctg aagatattgc taataagatc aagcagacca 420

ctgacgaata tatcaacact attctgcctc cgctgactaa agcactgttt aaatatgttc 480

gtgaaggtaa atatactttc tgtactcctg gtcacatggg cggtactgca ttccagaaaa 540

gcccggtagg tagcctgttc tatgatttct ttggtccgaa taccatgaaa tctgatattt 600

ccatttcagt atctgaactg ggttctctgc tggatcacag tggtccacac aaagaagcag 660

aacagtatat cgctcgcgtc tttaacgcag accgcagcta catggtgacc aacggtactt 720

ccactgcgaa caaaattgtt ggtatgtact ctgctccagc aggcggcacc attctgattg 780

accgtaactg ccacaaatcg ctgacccacc tgatgatgat gagcgatgtt acgccaatct 840

atttccgccc gacccgtaac gcttacggta ttcttggtgg tatcccacag agtgaattcc 900

agcacgctac cattgctaag cgcgtgaaag aaacaccaaa cgcaacctgg ccggtacatg 960

ctgtaattac caactctacc tatgatggtc tgctgtacaa caccgacttc atcaagaaaa 1020

cactggatgt gaaatccatc cactttgact ccgcgtgggt gccttacacc aacttctcac 1080

cgatttacga aggtaaatgc ggtatgagcg gtggccgtgt agaagggaaa gtgatttacg 1140

aaacccagtc cactcacaaa ctgctggcgg cgttctctca ggcttccatg atccacgtta 1200

aaggtgacgt aaacgaagaa acctttaacg aagcctacat gatgcacacc accacttctc 1260

cgcactacgg tatcgtggcg tccactgaaa ccgctgcggc gatgatgaaa ggcaatgcag 1320

gtaagcgtct gattaacggt tctattgaac gtgcgatcaa attccgtaaa gagatcaaac 1380

gtctgagaac ggaatctgat ggctggttct ttgatgtatg gcagccggat catatcgata 1440

cgactgaatg ctggccgctg cgtcctgaca gcacctggca cggcttcaaa aacatcgata 1500

acgagcacat gtatcttgac ccgatcaaag tcaccctgct gactccgggg atggaaaaag 1560

acggcaccat gagcgacttt ggtattccgg ccagcatcgt ggcgaaatac ctcgacgaac 1620

atggcatcgt tgttgagaaa accggtccgt ataacctgct gttcctgttc agcatcggta 1680

tcgataagac caaagcactg agcctgctgc gtgctctgac tgactttaaa cgtgcgttcg 1740

acctgaacct gcgtgtgaaa aacatgctgc cgtctctgta tcgtgaagat cctgaattct 1800

atgaaaacat gcgtattcag gaactggctc agaatatcca caaactgatt gttcaccaca 1860

atctgccgga tctgatgtat cgcgcatttg aagtgctgcc gacgatggta atgactccgt 1920

atgctgcatt ccagaaagag ctgcacggta tgaccggaga agtttacctc gacgaaatgg 1980

taggtcgtat taacgccaat atgatccttc cgtacccgcc gggagttcct ctggtaatgc 2040

cgggtgaaat gatcaccgaa gaaagccgtc cggttctgga gttcctgcag atgctgtgtg 2100

aaatcggcgc tcactatccg ggctttgaaa ccgatattca cggtgcatac cgtcaggctg 2160

atggccgcta taccgttaag gtattgaaag aagaaagcaa aaaatgaaga tctcattaat 2220

gaatcggcca acgcgcgggg agaggcggtt tgcgtattgg gcgctcttcc gcttcctcgc 2280

tcactgactc gctgcgctcg gtcgttcggc tgcggcgagc ggtatcagct cactcaaagg 2340

cggtaatacg gttatccaca gaatcagggg ataacgcagg aaagaacatg tgagcaaaag 2400

gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 2460

gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 2520

gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 2580

ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 2640

atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 2700

tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 2760

ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 2820

gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 2880

ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaaaaagag 2940

ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 3000

agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 3060

ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 3120

aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 3180

tatatgagta aacttggtct gacagttacc aatgcttaat cagtgaggca cctatctcag 3240

cgatctgtct atttcgttca tccatagttg cctgactccc cgtcgtgtag ataactacga 3300

tacgggaggg cttaccatct gtcgacaaat tacgccccgc cctgccactc atcgcagtac 3360

tgttgtaatt cattaagcat tctgccgaca tggaagccat cacaaacggc atgatgaacc 3420

tgaatcgcca gcggcatcag caccttgtcg ccttgcgtat aatatttgcc catggtgaaa 3480

acgggggcga agaagttgtc catattggcc acgtttaaat caaaactggt gaaactcacc 3540

cagggattgg ctgagacgaa aaacatattc tcaataaacc ctttagggaa ataggccagg 3600

ttttcaccgt aacacgccac atcttgcgaa tatatgtgta gaaactgccg gaaatcgtcg 3660

tggtattcac tccagagcga tgaaaacgtt tcagtttgct catggaaaac ggtgtaacaa 3720

gggtgaacac tatcccatat caccagctca ccgtctttca ttgccatacg aaattccgga 3780

tgagcattca tcaggcgggc aagaatgtga ataaaggccg gataaaactt gtgcttattt 3840

ttctttacgg tctttaaaaa ggccgtaata tccagctgaa cggtctggtt ataggtacat 3900

tgagcaactg actgaaatgc ctcaaaatgt tctttacgat gccattggga tatatcaacg 3960

gtggtatatc cagtgatttt tttctccatt ttagcttcct tagctcctga aaatctcgat 4020

aactcaaaaa atacgcccgg tagtgatctt atttcattat ggtgaaagtt ggaacctctt 4080

acgtgcccga tcaactcgag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 4140

aacctataaa aataggcgta tcacgaggca gaatttcaga taaaaaaaat ccttagcttt 4200

cgctaaggat gatttctgga attcgcggcc gcttctaga 4239

<210> 5

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> HindIII-CadA-F

<400> 5

gcaagcttat gaacgttatt gcaatattga atcac 35

<210> 6

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<220>

<223> BglII-CadA-R

<400> 6

gcagatcttc attttttgct ttcttctttc aataccttaa cggtatagcg gcc 53