生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用
阅读说明：本技术 生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用 (Recombinant microorganism for producing beta-nicotinamide ribose and construction method and application thereof ) 是由 李芳� 万丽花 胡志浩 于 2021-06-23 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种生产β-烟酰胺核糖(NR)的重组微生物及其构建方法与应用,属于生物技术领域。本发明首次发现核糖核苷水解酶RihA或RihB在调节β-烟酰胺核糖产量中的应用。基于上述发现,本发明制备了一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物,所述的重组微生物包含以下一个或几个特征：(1)编码核糖核苷水解酶的基因缺失、失活或活力降低,或核糖核苷水解酶的含量或活力降低；(2)过表达水解磷酸基团或者水解核苷的编码基因。采用本发明所述的重组微生物以β-烟酰胺单核苷酸(NMN)为底物生产NR,可有效提高NR的产量,减缓NR的降解,降低反应的副产物,可用于β-烟酰胺核糖的大规模工业化生产。(The invention provides a recombinant microorganism for producing beta-Nicotinamide Riboside (NR) and a construction method and application thereof, belonging to the technical field of biology. The invention discovers the application of the ribonucleoside hydrolase RihA or RihB in regulating the yield of beta-nicotinamide ribose for the first time. Based on the above findings, the present invention provides a recombinant microorganism producing β -nicotinamide riboside, said recombinant microorganism comprising one or more of the following characteristics: (1) a gene encoding a ribonucleoside hydrolase is deleted, inactivated or reduced in activity, or the content or activity of the ribonucleoside hydrolase is reduced; (2) overexpresses a gene encoding a hydrolyzed phosphate group or a hydrolyzed nucleoside. The recombinant microorganism of the invention uses beta-Nicotinamide Mononucleotide (NMN) as a substrate to produce NR, can effectively improve the yield of NR, slow down the degradation of NR and reduce reaction byproducts, and can be used for large-scale industrial production of beta-nicotinamide ribose.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用。
背景技术
β-烟酰胺核糖(NR，Nicotinamide riboside)是维生素B3的一种衍生物，它是合成烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)等的一种前体物质。NR在烟酰胺核苷酸激酶(NRKs)的作用下磷酸化后转化为NMN然后进一步转变为NAD。研究表明，在酵母、哺乳动物以及体外培养的人体细胞中，补充NR能提高NAD水平和活性。NAD在体内一直处于消耗和生成的动态平衡中，NAD作为细胞内重要的信号分子调控着一些依赖于NAD的去乙酰化酶，包括多聚ADP核糖聚合酶(PARPs)和sirtuins长寿蛋白家族sirtl-7(Sir2的同源基因)，广泛参与机体的生长发育、细胞凋亡、炎症、肿瘤、血管生成、神经退行性病变和细胞能量代谢等重要生命活动。另有研究表明，NR可存在于牛奶中作为NAD的重要膳食来源，但尚未在膳食中发现NMN，并且NMN在血清中的存在形式仍存在争议，因此，研究者提出NR可能是NAD前体的重要存在形式，因而能够通过饮食调节NAD的水平。
目前生产NR的方法主要为化学合成法，如利用三氟甲磺酸三甲基硅脂(TMSOTf)实现反应，虽然该方法产率高，但是即使产物构型的选择性高，也难以避免产生无任何用途的α-烟酰胺核糖，同时残留的三氟甲磺酸离子会影响产物作为食品食用，无法高效实现工业化生产；还有用四氯化锡为催化剂替代三氟甲磺酸三甲基硅脂，虽然得率高，操作简单，但是无法实现立体选择性得到β-构型的烟酰胺核糖，最终的产品无法满足相关的品质要求。因此其化学合成法普遍存在工艺反应时间长，检测困难，质量可控性差，产物纯化难度大等问题。
重组微生物发酵法生产NR，主要是利用微生物菌株自身的生物合成途径来生产NR，避免使用化学试剂给后期纯化带来困难，其优势在于以糖质为原料，产品绿色，生产成本低、效益高，特别是目前基因工程育种技术及高产优化控制技术的采用，使发酵法生产成本大大降低；酶催化法生产NR，即利用特定功能的酶，以NMN作为底物，在特定条件下，催化反应生成NR，整个反应条件温和，转化效率高，更有利于提高NR产品的纯度和含量。
目前已有利用重组微生物发酵法生产NR的文章和专利报道，但在这些报道中NR的发酵单位都很低，如CN201680078334.8专利中，通过在不同菌株中(大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、酵母菌)过表达不同来源的NaMN酰胺化酶NadE，利用微生物自身代谢途径生产NR，产量仅在0.1-100mg/L左右。而在这些报道中对微生物中NMN和NR的代谢途径尚未完全解释清楚，仅仅简单的过表达一些催化基因，并没有去除支路降解或者利用基因，这是NR产量低的主要原因。
核苷水解酶(nucleoside hydrolase)，是一种能分解核苷生成含氮碱和戊糖的酶。例如大肠杆菌可合成数种核苷水解酶，如RihA、RihB和RihC(Petersen 2001)，分别由rihA、rihB和rihC三个基因编码得到氨基酸序列为311aa、313aa和301aa的蛋白，研究表明，RhiA、RihB和RihC可以水解各种核苷生成相应的嘌呤或嘧啶与核糖。研究表明，RhiA、RihB和RihC可以水解尿苷和胞苷，但还未有相关研究表明RhiA、RihB和RihC与NR的合成和降解代谢有关。
NR在中性pH、高温条件下很不稳定，加之NR的水溶性极高，因此从发酵液中分离纯化NR的难度非常大。因此，亟需开发一种产量较高，操作简单，可应用于工业化生产的NR生产方法。
发明内容
针对上述不足，本发明提供了一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法，并制定了该重组微生物的发酵过程控制方案，可用于NR的高效工业化生产，或者将该重组微生物作为宿主菌株表达特定酶或酶组合，在体外催化积累NR，达到绿色环保低成本的NR生产。
术语：
1、NR：如无特殊说明，本发明中的英文简称“NR”指β-烟酰胺核糖，其分子式为C11H16N2O5，结构式如下式(1)所示。
2、重组微生物：如无特殊说明，本发明中的中文名称“重组微生物”指经过人为处理后的微生物；所述的人为处理包括但不限于：基因敲除、基因抑制、基因沉默、基因插入、基因突变、外源表达或过表达基因等本领域所有可以实现基因操作的技术手段。
3、宿主菌：如无特殊说明，本发明中的中文名称“宿主菌”指待进行人为处理的微生物。
4、种子液：如无特殊说明，本发明中的中文名称“种子液”指经微生物经试管斜面活化、扁平或摇瓶培养或种子罐逐级扩大培养后，获得的含有一定微生物数量，活力、质量较优的微生物培养液。
5、高产：如无特殊说明，本发明中的“高产”指β-烟酰胺核糖产量高于亲本微生物。
6、低产：如无特殊说明，本发明中的“低产”指β-烟酰胺核糖产量低于亲本微生物。
7、外源表达或过表达：在相对于本发明使用时应被广义地认为包括在相同条件下与亲本微生物的一或多种蛋白质(包括编码一或多种蛋白质的一或多种核酸)表达水平相比所述蛋白质表达(包括核酸表达)的任何增加。不应被认为意指所述蛋白质(或核酸)以任何具体水平表达。
8、亲本微生物：是本发明的微生物所来源于的微生物。本发明的微生物可以通过任何方法例如人工或天然选择、突变或基因重组而产生。亲本微生物可以是天然存在的微生物(即野生型微生物)或先前曾被修饰过但是不生产或不过度生产β-烟酰胺核糖的微生物。
9、载体：应被广义地认为包括适合用作媒介将遗传物质转移到细胞中的任何核酸(包括DNA和RNA)，包括质粒、病毒(包括噬菌体)、粘粒和人工染色体。载体可以包括一或多种调节元件、复制起点、多克隆位点和/或可选择标记物。
10、关于蛋白和基因名称的约定：本发明中涉及的英文蛋白名称均为大写正体；本发明中涉及的英文基因名称均为小写斜体。
为了实现上述发明目的，本发明的技术方案如下：
一方面，本发明提供了核糖核苷水解酶或其编码基因在调节β-烟酰胺核糖的产量中的应用，所述的核糖核苷水解酶为RihA、RihB或RihC中的一种或多种。
具体地，所述核糖核苷水解酶的含量或活性降低，和/或，编码所述核糖核苷水解酶的基因缺失、失活或活力降低，以提高β-烟酰胺核糖的产量；
或：所述核糖核苷水解酶的含量或活性提高，和/或，编码所述核糖核苷水解酶的基因增加、拷贝数或活力提高，以降低β-烟酰胺核糖的产量。
另一方面，本发明提供了核糖核苷水解酶或其编码基因在制备高产或低产β-烟酰胺核糖的微生物中的应用，所述的核糖核苷水解酶为RihA、RihB或RihC中的一种或多种。
又一方面，本发明提供了一种生产β-烟酰胺核糖的重组微生物，所述的重组微生物包括以下特征：
(1)编码核糖核苷水解酶的基因缺失、失活或活力降低，或核糖核苷水解酶的含量或活力降低；
(2)过表达磷酸水解酶或核苷酸酶的编码基因。
具体地，所述的编码核糖核苷水解酶的基因为xapA、deoD、rihA、rihB、rihC、deoA、udP或cdh中的一种或多种。
进一步具体地，所述的编码核糖核苷水解酶的基因为xapA、deoD、rihA、rihC或cdh中的一种或多种。
具体地，所述的磷酸水解酶或核苷酸酶的编码基因为phoA、aphA、nadN或ushA中的一种或多种。
进一步具体地，所述的磷酸水解酶或核苷酸酶的编码基因为ushA，所述的ushA编码的蛋白酶为5'-核苷酸酶。
具体地，所述的微生物包括但不限于大肠杆菌(Escherichia coli)、芽孢杆菌(Bacillus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、沙门氏菌(salmonella)和酵母菌(Yeast)。
又一方面，本发明还提供了上述重组微生物在生产β-烟酰胺核糖中的应用。
又一方面，本发明还提供了一种生产β-烟酰胺核糖的方法，所述的方法包括利用上述重组微生物发酵生产β-烟酰胺核糖或利用上述重组微生物全细胞产物催化底物生产β-烟酰胺核糖；所述的全细胞产物包括但不限于：培养液、细胞裂解液、细胞裂解液的上清部分、细胞裂解液的沉淀部分等。需要说明的是，在未来的技术发展中对于全细胞产物的操作方法及其具体产物类型的新增技术由于未脱离本发明的发明点，也应当在本发明的上述要求保护的范围之内。
具体地，所述的底物为NAM或NMN。
具体地，所述的方法包括：
将上述重组微生物活化后制备种子液；
采用摇瓶发酵：按照8-12％接种量接种到发酵培养基中，37℃摇床250rpm培养3-4h，添加终浓度为1mM的IPTG，同时添加终浓度为300mg/L的底物烟酰胺(NAM)，调节摇床温度至34℃，发酵周期为18-22h。
或采用发酵罐发酵：按照8-12％接种量接种到发酵培养基中，37℃培养，维持pH为6.9，溶氧为30-45％，当溶氧高于40％时，开始偶联补料，培养7-9h，OD600至10-30时，温度维持在37℃，加入终浓度为0.4mmol/L的IPTG进行诱导，以0.3-0.5g/L·h-1的速率流加底物烟酰胺(NAM)，发酵周期为18-20h。
需要说明的是，在未来的技术发展中对于微生物的操作方法的新增技术由于未脱离本发明的发明点，也应当在本发明的上述要求保护的范围之内。
进一步具体地，摇瓶发酵中，
所述的接种量为10％。
所述的发酵培养基成分为：每升培养基中葡萄糖20-40g，5N-5倍的盐溶液180-220mL，TM2溶液0.5-1.5mL，柠檬酸铁8-12mg，七水硫酸镁240-250mg，氯化钙105-115mg，硫胺素0.5-1.5μg，以无菌去离子水定容至1L；其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠75.6g，磷酸二氢钾15g，氯化钠2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为20h。
进一步具体地，所述的发酵培养基成分为：每升培养基中葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM2溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。
进一步具体地，发酵罐发酵中，
所述的接种量为10％。
所述的发酵培养基为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵4-6g，氯化钠1-3g，磷酸二氢钾3-5g，七水硫酸镁1-3g，葡萄糖10-20g，氯化钙0.05-0.15g，氯化锌0.005-0.015g，TM3 0.5-1.5mL，柠檬酸铁90-100mg，玉米浆2-8g，VB1 2-3mg，NA 35-45mg，泡敌0.5-1.5g，以去离子水定容；补料培养基为每升含葡萄糖450-550g，调节pH至6.9；TM3溶液为每升含四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
所述的发酵周期为19h。
进一步具体地，所述的发酵培养基为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵5g，氯化钠2g，磷酸二氢钾4g，七水硫酸镁2g，葡萄糖15g，氯化钙0.105g，氯化锌0.01g，TM3 1mL，柠檬酸铁94mg，玉米浆5g，VB1 2.5mg，NA 40mg，泡敌1g，以去离子水定容；补料培养基为每升含葡萄糖500g，调节pH至6.9。
与现有技术相比，本发明的积极和有益效果在于：
(1)本发明首次发现核糖核苷水解酶RihA、RihB或RihC可作为β-烟酰胺核糖降解代谢过程的关键酶，可用于调节β-烟酰胺核糖的产量。
(2)基于上述发现，采用本发明所述的重组微生物生产β-烟酰胺核糖，产量更高，操作简单，发酵周期短，生产强度高，且有利于后续产品的分离纯化，可用于β-烟酰胺核糖的大规模工业化生产。
(3)本发明所提供的重组微生物的构建方法是一种定向的理性的菌种构建方法，相比传统诱变方法更为高效便捷，可操作性强。
保藏说明
分类命名：大肠埃希氏菌
拉丁名：Escherichia coli
参椐的生物材料：SHQ05C
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所
保藏日期：2021年05月28日
保藏中心登记入册编号：CGMCC No.22633。
附图说明
图1为大肠杆菌NR的代谢路径示意图。
图2为NR及各副产物检测的HPLC图谱。
图3为SHA04K/pHQ07酶液反应进程曲线图。
图4为SHQ01C、SHQ02C、SHA04K宿主中表达UshA酶液反应比较图。
图5为SHQ05C和SHA04K中表达UshA酶液反应NR生成情况图。
图6为SHQ05C和SHA04K中表达UshA酶液反应NAM生成情况图。
图7为SHQ05C/pHF57发酵检测NR和NAM含量图。
其中：NA：烟酸；NR：β-烟酰胺核糖；NMN：β-烟酰胺单核苷酸；NAM：烟酰胺；Asp：天冬氨酸；QA：喹啉酸；NaMN：烟酸单核苷酸；NaAD：烟酸腺嘌呤二核苷酸；NAD：烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；PRPP：磷酸核糖焦磷酸；NadC：喹啉酸磷酸核糖基转移酶；NrdA、NrdB：核苷二磷酸还原酶；NadD：烟酸单核苷酸腺苷酸转移酶；NadE：NAD合成酶；NadR：烟酰胺核苷酸腺苷酸基转移酶；PncA：烟酰胺酶；PncB：烟酸磷酸核糖基转移酶；PncC：NMN脱酰胺酶；DeoD：嘌呤核苷磷酸化酶I；XapA：嘌呤核苷磷酸化酶II；Cdh：CDP-二酰基甘油二磷酸酶；UshA：5'-核苷酸酶；RihA/RihC：核糖核苷水解酶
具体实施方式
下面结合具体实施例，对本发明作进一步详细的阐述，下述实施例不用于限制本发明，仅用于说明本发明。以下实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，下述实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
原理说明：NR代谢路径原理说明
在微生物中，NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)有三种合成途径：补救途径、从头合成途径和P-H途径(又叫烟酸补救途径)。
如图1所示，以大肠杆菌为例，其从头合成途径涉及三个主要的酶：喹啉酸磷酸核糖基转移酶(NadC，EC 2.4.2.19)、烟酸单核苷酸腺嘌呤基转移酶(NadD，EC 2.7.7.18)、NAD+合成酶(NadE，EC 6.3.1.5)，NadC将来自磷酸核糖基焦磷酸的磷酸核糖基部分转移到喹啉酸氮并催化随后的中间体脱羧以产生烟酸单核苷酸(NaMN)，NadD利用三磷酸腺苷(ATP)腺苷酸化NaMN，从而产生烟酸二核苷酸(NaAD)，NadD还能够腺苷酸化NMN，但与使用NaMN作为底物时相比，具有较低的活力，NAD+生物合成的最后一步由NadE催化，NadE利用氨或谷氨酰胺作为氨基供体将NaAD酰胺化为NAD+。
除了从头合成途径外，NAD+还有多种补救途径，如NMN、NR、烟酰胺(NAM)或烟酸(NA)补救途径：NR通过烟酰胺核糖苷激酶(E.coli NadR，EC 2.7.1.22)被磷酸化成NMN或在可逆反应中通过嘌呤核苷磷酸化酶(E.coli DeoD，B.subtilis DeoD，PupG，Pdp，EC2.4.2.1)被降解为NAM和磷酸核糖；NAM可以通过DeoD被磷酸核糖基化为NMN或通过烟酰胺酶(PncA，EC 3.5.1.19)被脱酰胺为NA；NA或NAM通过烟酸磷酸核糖基转移酶(E.coli PncB，B.subtilis YueK EC 6.3.4.21)分别被转变为NaMN或NMN，NAM还可以由外源烟酰胺磷酸核糖基转移酶(Nampt)转化至NMN，胞外NMN通过周质酸性磷酸酶(E.coli UshA，B.subtilisYfkN，EC 3.1.3.5)被去磷酸化为NR，并且胞外NR可以通过NR转运体(E.coli PnuC，B.subtilis NupG)被导入细胞内。
本发明还首次通过实验验证了具有嘧啶特异性的核糖核苷水解酶RihA，非特异性核糖核苷水解酶RihC对NR具有降解作用。
实验方法1：基因敲除方法
本发明采用Datsenko的方法进行微生物基因敲除，大致步骤为基于Red重组系统，用具有36-nt同源延伸的引物通过PCR生成的可选择的抗生素耐药基因替换基因序列，从而达到基因敲除的目的。本发明所采用的具体基因敲除的方法记载于文献：K.A.Datsenko,B.L.Wanner.One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12using PCR products.Proceedings of the National Academy Sciences of the USA,2000,97(12):6640-6645。相应的基因敲除引物记载于文献：Baba T,Ara T,Hasegawa M,etal.2006.Construction of Escherichia coli K-12in-frame,singlegeneknockoutmutants:the Keio collection.Mol Syst Biol[J],2:20060008，具体详见该文献第9页第2段及补充资料表2。
实验方法2：摇瓶发酵验证重组菌株生产NR的能力
1、试剂：
(1)发酵培养基：每升培养基中葡萄糖30g，5N-5倍的盐溶液200mL，TM2溶液1mL，柠檬酸铁10mg，七水硫酸镁246mg，氯化钙111mg，硫胺素1μg，以无菌去离子水定容至1L。
其中5N-5倍的盐溶液为十二水合磷酸氢二钠每升75.6g，磷酸二氢钾每升15g，氯化钠每升2.5g，氯化铵25g，以离子水定容至1L；TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
(2)LB培养基：每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L(著[美]J.莎姆布鲁克.黄培堂译,分子克隆指南2002,1595)。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
2、仪器：恒温摇床培养箱。
3、方法：
摇瓶发酵过程如下：(1)接种重组微生物菌株至含有抗生素的4mL的LB培养基中，置37℃摇床250rpm培养；(2)取培养16h后的种子液200μL转移至2mL含有抗生素的LB液体培养基，于37℃摇床250rpm培养4h；(3)将2mL二级种子液全部转入装有18mL发酵培养基的摇瓶中，置37℃摇床中，250rpm培养3-4h；(4)添加IPTG至终浓度1mM后，同时添加底物烟酰胺(NAM)300mg/L，调节摇床温度至34℃，继续培养20h左右，取样进行HPLC检测，检测方法详见实验方法5。
实验方法3：酶液摇瓶表达及收集
1、试剂：
酶的编码基因在宿主细胞中的转录表达使用LB培养基，每升培养基中含酵母粉5g，氯化钠10g，蛋白胨10g，去离子水定容至1L。
上述溶液进行高压蒸汽灭菌，灭菌温度121℃，时间20-30min。
2、仪器：恒温摇床培养箱。
3、方法：
具体表达过程如下：(1)活化种子，从划线平板挑取单克隆至装有4mL LB的摇管中，37℃过夜培养；(2)以接种量1％接种至装有50mL LB培养基的250mL摇瓶，37℃培养2.5-3h至OD600为0.6-0.8；(3)在摇瓶中加入100μL 200mM的IPTG，使终浓度为0.4mM，调整温度至34℃，250rpm培养20h；(4)次日收集菌体，7800rpm*10min，弃上清，称取菌体沉淀0.1g用2mL 2mM PBS(pH7.0)的缓冲液重悬，40％功率超声6min(超声2s*暂停4s)进行细胞破碎，超声后的破碎液7800rpm*10min离心收集上清，即为粗酶液。
实验方法4：发酵罐中重组菌株发酵生产NR
1、试剂
(1)发酵培养基：为半合成培养基，每升培养基中含硫酸铵5g，氯化钠2g，磷酸二氢钾4g，七水硫酸镁2g，葡萄糖15g，氯化钙0.105g，氯化锌0.01g，TM3 1mL，柠檬酸铁94mg，玉米浆5g，VB1 2.5mg，NA 40mg，泡敌1g，以去离子水定容。
TM3溶液为四水氯化锌2.0g，六水氯化钙2.0g，两水钼酸钠2.0g，五水硫酸铜1.9g，硼酸0.5g，盐酸100mL，去离子水定容至1L。
(2)补料培养基：每升含葡萄糖500g，以氨水调节pH至6.9。
2、仪器
恒温摇床培养箱，发酵罐。
3、方法
发酵过程如下：(1)活化种子，从种子甘油管按接种量0.25％接入装有30mL LB的250mL摇瓶，37℃培养16h至OD600为3-4；(2)以接种量1％接种至装有100mL LB培养基的500mL种子摇瓶，37℃培养4h至OD600为1-2；(3)以接种量10％接种到装有2L半合成培养基的5L发酵罐中，37℃培养，用氨水调节pH为6.9，溶氧转速偶联，维持溶氧在30％，当溶氧高于40％时，开始偶联补料，使溶氧维持在30-45％。发酵8h至OD600为10-30时，温度维持在37℃，加入IPTG，使其终浓度为0.4mmol/L进行诱导，以0.3-0.5g/L·h-1的速率流加底物烟酰胺(NAM)，发酵19h后，取样进行HPLC检测，检测方法详见实验方法5。
实验方法5：HPLC测定发酵液中的NR和相关副产物
精密吸取800μL发酵液(或者200μL反应液)加800μL乙腈，旋涡震荡5min，12000rpm离心2min，取上清液过0.22μm有机滤膜，HPLC检测。HPLC的参数如下：采用Agilent SB Aq4.6*150mm 5μm，流动相为甲醇和10mM乙酸铵(pH 5.0)，流动相比例0.01-4.4分钟甲醇比例维持在1％，流速0.8mL/min，4.4-5.4分钟甲醇比例由1％上升到7％，流速0.8mL/min，5.4-6.5分钟甲醇比例由7％上升到18％，流速1.2mL/min，6.5-6.6分钟甲醇比例由18％下降到2％，6.6-12分钟甲醇比例维持2％，流速1.2mL/min，利用紫外检测器检测波长260nm；发酵液的上样量2μL，柱温30℃。NMN出峰时间为2.348分钟，乳清酸出峰时间为2.471分钟，NR出峰时间为3.074分钟，NA出峰时间为3.915分钟，NAD出峰时间为8.347分钟，NAM出峰时间为10.505分钟。HPLC图谱如图2所示。
实验方法6：质粒及菌株信息
表1质粒、菌株信息
质粒/菌株
详细信息
pHQ01
pETrc-rihA
pHQ02
pETrc-rihB
pHQ03
pETrc-rihC
pHQ04
pETrc-deoA
pHQ05
pETrc-udP
pHQ06
pETrc-ppnN
pHQ07
pETrc-ushA
pHA171
pET3.1-ushA
pHA172
pUC19-P3.1-ushA
pHF57
pHD03-ushA
SHA04K
W3110△ushA△cdh△pncC△nadR△pncA△xapA△deoD::KanFRT
SHQ01C
SHA04△rihA::CmFRT
SHQ02C
SHA04△rihC::CmFRT
SHQ05C
SHQ01C△rihC::CmFRT
实施例1：筛选磷酸水解酶或核苷酸酶编码基因并构建表达质粒生产NR
1.磷酸水解酶或核苷酸酶筛选：NMN催化生成NR主要是通过水解核苷酸侧链磷酸基团实现，在大肠杆菌中具有水解磷酸基团或者水解核苷的编码基因包括phoA、yfbT、yniC、appA、aphA、nadN、ushA等。通过构建过表达质粒，并以NMN作为反应底物进行体外催化，筛选能够催化NMN生成NR的基因。具体地，将基因phoA、yfbT、yniC、appA、aphA、nadN、ushA分别构建至pETrc载体上(其中pETrc载体是以pET30a(武汉淼灵生物科技有限公司，货号P0031)为模板，将T7启动子替换为trc启动子，序列见下表3)，将构建好的质粒转化至BL21(DE3)宿主中，按照实验方法3的酶液表达制备方法进行过表达。酶催化反应体系为：3mL反应体系(0.1M pH7.0 PBS)中含有10g/L NMN，200μL酶液，37C水浴锅中反应3h，以实验方法5的HPLC方法进行检测，结果如表2所示，基因phoA、aphA、nadN、ushA表达的酶液具有催化NMN生成NR的功能，其中UshA酶活最高。
表2筛选催化NMN生成NR的编码基因
基因
NR产量(g/L)
phoA
1.2
yfbT
0
yniC
0
appA
0
aphA
1.96
nadN
0.97
ushA
8.6
表3 Trc、P3.1启动子序列
2.质粒构建：大肠杆菌ushA基因可编码具有5'-核苷酸酶和UDP-糖水解酶活性的双功能酶。它具有相对广泛的底物特异性，UDP糖和CDP-醇。因此，它能够催化底物β-烟酰胺单核苷酸(NMN)脱去一分子磷酸基团生成产物烟酰胺核糖(NR)。但如果仅依靠基因组上自身的单拷贝ushA来进行NR生产，ushA的表达量远不够用于连续催化NMN，因此将ushA基因分别构建到高拷贝表达载体pETrc、pET3.1(其中pET3.1载体构建是以pET30a为模板，将T7启动子替换为P3.1启动子，序列见上表3)上作为体外酶催化制备NR的表达质粒pHQ07、pHA171，另外在实验室已有的用于发酵生产NMN的表达质粒pHD03(质粒pEZ07-nadV-prs128，其中pEZ07同中国专利申请号：201510093004.3，在pEZ07载体上依次连接Acinetobacter baylyi sp.ADP1来源的nadV基因以及大肠自身来源的具有D128A点突变的prs基因)基础上连接ushA基因作为工程菌发酵生产NR的表达质粒pHF57。
质粒构建具体过程如下：以pHQ07为例，以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为模板，分别以引物pHQ07-F(SEQ ID NO:1)/pHQ07-R(SEQ ID NO:2)扩增ushA片段，得到的PCR产物大小为1700bp，且电泳检测无杂带，直接进行过柱回收纯化(捷瑞胶回收纯化试剂盒)，得到的纯化片段与NcoI/XhoI酶切回收的pETrc载体片段以纳摩尔比3:1进行无缝克隆构建(苏州神洲基因GBclonart无缝克隆试剂盒)，重组克隆反应液于45℃水浴锅温浴30min，然后转移到冰上放置5min，转入TG1化转感受态细胞，42℃热击2min，冰浴2min后加入800μL复苏培养基LB，复苏培养1h后离心涂布含50mg/L卡那霉素抗性的LB平板，次日挑取克隆培养过夜，提取质粒进行酶切验证，最终构建得到质粒pHQ07。
3.SHA04K菌株构建：根据实验方法1中基因敲除的方法，以大肠杆菌W3110(ATCC27325)为初始菌株，为了使细胞中积累NMN，依次敲除了降解和利用NMN的基因ushA、cdh、pncC、nadR，同时去除了消耗底物NAM的基因pncA、xapA，去除了降解NR的基因deoD。
由于要依靠ushA编码的核苷酸酶进行连续催化生产NR，通过构建过表达质粒而不依赖基因组自身单拷贝的ushA表达，因此选用已经敲除ushA的SHA04K作为出发菌株。
实施例2：筛选降解NR的编码基因
根据图1可知，在NMN生产菌株SHA04K基因组上已经去除了代谢路径中已知的利用和降解NAM、NMN和NR的相关基因，理论上以SHA04K为宿主，过表达pHQ07(pETrc-ushA)质粒的酶液进行体外催化时不会出现NR的大量降解。但是实验结果显示(图3)，在3mL反应体系中，5g/L NMN添加200μL表达的pHQ07粗酶液(酶液制备方法见实验方法3)，在50mM pH7.0的PBS缓冲液中35℃反应不同时间，结果随着反应时间的延长，催化产物NR很快被降解为NAM，反应6h后NR仅有0.9g/L，表明代谢路径中除了已知的DeoD、XapA降解NR外，仍然存在未知的降解NR的酶。
NR降解主要途径是通过核糖核苷水解酶水解掉侧链核糖来实现，在大肠杆菌中具有水解核糖核苷功能的编码基因，包括具有嘧啶特异性的核糖核苷水解酶RihB、RihA，非特异性核糖核苷水解酶RihC，对脱氧核糖核苷也具有催化作用的胸苷磷酸化酶DeoA，尿嘧啶核糖核苷磷酸化酶Udp，5'-单磷酸核苷酶PpnN等。本发明通过构建过表达质粒，并以NR作为反应底物进行体外催化，筛选能够催化NR至NAM的基因。
根据实施例1中质粒构建的方法，将基因rihA、rihB、rihC、deoA、udP、ppnN分别构建到载体pETrc上，获得质粒pHQ01-pHQ06，转化宿主SHA04K，通过将带有不同质粒的菌株进行过表达，获得相关酶液。其催化反应体系为：在3mL反应液中加入底物NR，使其终浓度为3g/L，并加入酶液100μL，缓冲液10mM pH6.0的PBS，于37℃水浴锅中搅拌反应1h，取样检测是否有NAM生成，检测结果只有质粒pHQ01(pETrc-rihA)、pHQ03(pETrc-rihC)表达的酶液反应后能检测到产物NAM(见下表4)，表明基因rihA、rihC编码的酶可造成NR的快速降解。
表4筛选降解NR的编码基因
基因
NR(g/L)
NAM产量(g/L)
rihA
1.48
0.67
rihB
2.97
0
rihC
1.2
0.81
deoA
2.97
0
udP
2.95
0
ppnN
2.97
0
实施例3：敲除降解NR至NAM的编码基因
根据实施例2的实验结果，基因rihA、rihC是造成NR降解的关键原因，因此，按照实验方法1中基因敲除的方法在NMN生产菌株SHA04K的基础上分别敲除rihA、rihC，构建菌株SHQ01C(SHA04△rihA::CmFRT)、SHQ02C(SHA04△rihC::CmFRT)，分别转化表达质粒pHQ07(pETrc-ushA)，按照实验方法3中的酶液表达及收集的方法制备酶液，以实施例2中的反应体系进行催化反应，检测结果见图4，在敲除了rihA、rihC的宿主菌SHQ01C、SHQ02C中表达ushA后，酶催化产生的NR产量明显高于SHA04K，其中在SHQ02C中表达的酶液催化的摩尔转化率高达72％，与SHA04K比较，副产物NAM的量显著降低，表明敲除rihA、rihC有效，但是仍存在NR的降解。
实施例4：构建rihA、rihC双敲除菌株
根据实施例3的结果，分别敲除rihA、rihC能够明显提高NR的产量，同时副产物NAM的量减少，但是仍然无法达到完全不降解NR的水平，因此，在SHQ01C的基础上继续敲除rihC基因，构建菌株SHQ05C(SHQ01△rihC::CmFRT)，将表达质粒pHF57(pHD03-ushA)、pHQ07(pETrc-ushA)分别转入宿主SHQ05C中，按照实验方法2、实验方法3中的方法分别验证通过自身代谢路径摇瓶发酵是否能够积累NR以及酶体外催化是否有副产物NAM。
经HPLC检测，在SHQ05C中表达UshA酶液，以6g/L NMN作为底物，反应1h即能催化得到4.3g/L NR，NMN到NR的摩尔转化率达到了93.5％，且随着反应时间延长，副产物NAM含量维持在20mg/L左右，与SHA04K比较，效果显著(见图5、图6)。
摇瓶发酵生产NR的结果显示，通过细胞自身代谢，细胞可利用底物NAM发酵得到近300mg/L NR(见图7)，而对照菌株SHA04K/pHF57中仅检测出18mg/L，近一步说明rihA、rihC同时敲除后能够显著提高NR产量，降低副产物NAM的积累。
重组菌株W3110△ushA△cdh△pncC△nadR△pncA△xapA△deoD△rihA△rihC::CF简写为菌株SHQ05C，其分类命名为大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，该菌株已于2021年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏编号为CGMCC NO.22633。
实施例5：在重组微生物中进行双质粒共表达发酵
虽然SHQ05C/pHF57摇瓶发酵能够积累近300mg/L NR，但是发酵液中检测仍然有约120mg/L NMN未被转化至NR，表明表达质粒pHF57上ushA表达量不足，无法催化NMN的完全转化，因此，在SHQ05C/pHF57菌株中又转入pHA171(pET3.1-ushA)表达质粒进行双质粒共表达，通过增加ushA的表达量将NMN尽量完全转化至NR，推动反应朝向NR进行从而最大限度利用NAM。
具体地，按照实验方法2进行摇瓶发酵，检测结果见表5，在增加了UshA的表达量后，摇瓶发酵NR产量可达418mg/L，没有检测到NAM，NMN残留约40mg/L，表明增加UshA是有效的，但是表达量仍然不足。
表5双质粒共表达发酵结果
菌株
NR(mg/L)
NAM(mg/L)
NMN(mg/L)
SHA04k/pHF57
18.5
267.1
103.8
SHQ05C/pHF57
299.7
71.7
121.8
SHQ05C/pHF57&pHA171
418.8
0
41.1
实施例6：构建更高拷贝表达质粒进行摇瓶发酵生产NR
实施例5结果表明，UshA的表达量需要大量增加才能保证发酵过程完全耗尽NAM、NMN，用pHA171质粒共表达仍然不足以把发酵液中的NMN完全转化，因此，进一步构建了具有200-300个拷贝的高表达质粒pHA172(pUC19-P3.1-ushA)，在SHQ05C中共表达pHF57和pHA172，摇瓶发酵结果NR产量高达520mg/L，且没有NAM、NMN检测出。
实施例7：发酵罐酶催化制备NR
以SHQ05C/pHA171表达的均质酶液在发酵罐中进行3L反应液催化，催化反应体系为：底物NMN终浓度为120g/L、酶液36mL，在136mM pH6.5的醋酸钠缓冲液(含8mM Co2+)中55℃水浴锅搅拌反应1h，检测生成NR 89g/L，NAM副产物仅含有4.13g/L，转化率为96.7％。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 苏州华赛生物工程技术有限公司
<120> 生产β-烟酰胺核糖的重组微生物及其构建方法和应用
<130> 20210518
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 1
gattaaataa ggaggaataa accatgaaat tattgcagcg gggcg 45
<210> 2
<211> 47
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 2
catatggtac cagctgcaga tctcgattac tgccagctca cctcacc 47
<210> 3
<211> 193
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 3
ctgttgacaa ttaatcatcc ggctcgtata atgtgtggaa ttgtgagcgg ataacaattt 60
cacacaggaa acagcgccgc tgagaaaaag cgaagcggca ctgctcttta acaatttatc 120
agacaatctg tgtgggcact cgaccggaat tatcgattaa ctttattatt aaaaattaaa 180
gaggtatata tta 193
<210> 4
<211> 205
<212> DNA
<213> 人工序列(artificial sequence)
<400> 4
gacggtcggg taactaccac ttggtatcaa agaacagtta atcttcccag atattgacta 60
caataaagta acaaaggttc gcggaataga catcgttatc gtaacaactg ctaatactga 120
cgaagaagct cgtgagctat taactcaagt aggtatgccg ttccagaaat aatcaatgaa 180
agggaggcga aatcgtggct aaaaa 205