阅读说明：本技术 基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量方法 (Xe molecular probe concentration rapid quantitative measurement method based on saturation energy non-uniform distribution ) 是由 周欣 蒋卫平 娄昕 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于饱和能量非均匀分布(Saturation Energy Nonuniform Distributed,SEND)的Xe分子探针浓度快速定量测量新方法,包括以下步骤：配制已知浓度Xe分子探针溶液,测量Xe分子探针与Xe的结合常数K；配制待测浓度Xe分子探针溶液,分别进行频率偏置为Δω<Sub>rf</Sub>和-Δω<Sub>rf</Sub>的SEND脉冲序列实验,采样获得待测溶液溶解态Xe信号强度S1和S2；计算SEND对比效果SENDR；根据公式计算待测溶液中Xe分子探针浓度。本方法采用饱和能量非均匀分布方法,可以快速测量溶液中Xe分子探针的浓度。(The invention discloses a new method for rapidly and quantitatively measuring the Xe molecular probe concentration based on the Nonuniform distribution of Saturated Energy (SEND), which comprises the following steps: preparing a Xe molecular probe solution with a known concentration, and measuring the binding constant K of the Xe molecular probe and Xe; preparing Xe molecular probe solution with concentration to be measured, and respectively carrying out frequency bias to be delta omega rf And- Δ ω rf The SEND pulse sequence experiment, sampling to obtain the dissolved Xe signal intensity S1 and S2 of the solution to be measured; calculating SEND contrast effect SENDR; and calculating the concentration of the Xe molecular probe in the solution to be detected according to a formula. The method adopts a saturated energy non-uniform distribution method, and can quickly measure the concentration of the Xe molecular probe in the solution.)

基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量 方法

技术领域

本发明属于磁共振技术和分析测量领域，特别涉及基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量新方法，该方法适用于测量溶液中分子探针的浓度。

背景技术

近年来，国内外学者开发出了许多不同的Xe分子探针，比如穴番、纳米乳、葫芦脲、气体胶囊和蛋白质等。这些分子探针，尤其是穴番，已经广泛的应用于生物大分子(如蛋白质、核酸、酶等)、代谢产物(硫醇)、金属离子(锌、汞、铅和镉等)和微环境参数(温度或pH)的检测。结合自旋交换光抽运(Spin Exchange Optical Pumping,SEOP)超极化Xe技术和化学交换饱和转移(Chemical Exchange Saturation Transfer,CEST)技术，Xe分子探针的检测限可达到pM量级。然而对低浓度Xe分子探针的快速定量检测方法仍然缺乏。

目前Xe分子探针的定量方法主要包括：通过对Xe分子探针的CEST z谱数据进行拟合、通过测量不同饱和照射强度或饱和照射时间与CEST效果之间的关系以及通过测量饱和照射时溶解态Xe去极化速率与Xe分子探针浓度线性关系获得分子探针浓度与动力学信息等方法，但是这些方法存在采样消耗时间较长和数据处理步骤复杂等局限。

发明内容

本发明的目的就在于克服现有定量方法存在的缺点和不足，提出基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量新方法，该方法将Xe信号减小过程分为施加多次180°射频脉冲块，只需对这一模块进行定量分析并循环重复，简化了数据处理步骤并减少了所需的实验扫描次数，从而使该方法具有采样耗时短和数据处理简单的特点。

本发明的目的实现步骤如下：

基于饱和能量非均匀分布SEND的Xe分子探针浓度快速定量测量方法，包含如下步骤：

步骤1，配制已知浓度的Xe分子探针溶液，测量Xe分子探针与Xe的结合常数K；

步骤2，配制待测Xe分子探针溶液，将频率偏置为Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S1；

步骤3，将频率偏置为-Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S2；

步骤4，根据公式SENDR＝S1/S2计算对比效果SENDR；

步骤5，根据以下公式计算待测Xe分子探针溶液中Xe分子探针浓度

待测[Xe分子探针]＝(1/K+[Xe])*(1-SENDR^(1/N))/2

其中，[Xe]为待测Xe分子探针溶液中溶解态Xe浓度，[Xe]＝(Xe分压*Xe溶解度)，Xe分压为步骤2和步骤3中使用的混合气体总压力和混合气体中Xe所占比例的乘积，Xe溶解度取决于测试时溶液的温度，通过查表获得，SENDR为对比效果，N为SEND脉冲序列中180°射频脉冲块的重复次数。

进一步地，步骤1中，Xe分子探针与Xe的结合常数K采用1D Xe NMR谱方法测量但不局限于这一种方法，其结合常数K的计算公式为

K＝[[email protected]分子探针]/(([分子探针]-[[email protected]分子探针])*[Xe]_y)

其中，[Xe分子探针]为步骤1的溶液中Xe分子探针浓度，[[email protected]分子探针]表示与Xe结合的Xe分子探针浓度，[[email protected]分子探针]＝I1/I2*[Xe]_y，I1和I2分别为溶液中与Xe结合的Xe分子探针浓度的积分值、和溶解态Xe浓度的积分值，I1和I2的值是分别通过对1D Xe NMR谱中与Xe结合的Xe分子探针信号范围，及溶解态Xe信号范围进行积分获得的，[Xe]_y为步骤1中Xe分子探针溶液中溶解态Xe浓度，[Xe]_y＝(Xe分压*Xe溶解度)，Xe分压为步骤1中使用的混合气体总压力和混合气体中Xe所占比例的乘积，Xe溶解度取决于步骤1中溶液的温度，通过查表获得。

进一步地，步骤2和步骤3中，所述的SEND脉冲序列包括由180°脉冲和间隔时间t组成的180°射频脉冲块的预处理，和随后的频率偏置为f2的90°bp脉冲，180°射频脉冲块重复N次，所述90°bp脉冲用于激发溶解态Xe信号进行采样检测，其中，180°脉冲为形状脉冲，其频率偏置为f1，步骤2和步骤3中f1分别设置为Δω_rf和-Δω_rf，Δω_rf表示与Xe结合的Xe分子探针信号与溶解态Xe信号之间的频率差，用于实现180°脉冲对与Xe结合的Xe分子探针信号进行选择性操作，-Δω_rf表示与Xe结合的Xe分子探针信号相对于溶解态Xe信号对称位置与溶解态Xe信号之间的频率差，用于获得与Xe结合的Xe分子探针信号外干扰因素对溶解态Xe信号的影响，间隔时间t≥3*滞留时间，滞留时间为Xe在Xe分子探针中停留时间，以保证与Xe结合的Xe分子探针信号与溶解态Xe信号进行充分交换。

进一步地，S1和S2分别为步骤2和步骤3中180°射频脉冲频率偏置f1设置为Δω_rf和-Δω_rf时，使用SEND脉冲序列获得的溶解态Xe的信号强度，分别对待测Xe分子探针溶液施加SEND脉冲序列，获得1D Xe NMR谱，对1D Xe NMR谱中溶解态Xe信号范围进行积分，测量并记录待测溶液溶解态Xe信号积分强度。

进一步地，步骤4中，若步骤4获得的对比效果SENDR>0.95，则增加180°射频脉冲块的重复次数N，若步骤4获得的对比效果SENDR<0.05，则减少180°射频脉冲块的重复次数N，然后重复步骤2和步骤3，直至SENDR不大于0.95并不小于0.05。

本发明为基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量新方法，可以直接测量一定条件Xe分子探针的浓度，与现有方法相比：①本方法只需要测量Xe分子探针在180°射频脉冲频率偏置分别为Δω_rf和-Δω_rf时溶解态Xe的信号强度，即通过2次扫描就可以定量Xe分子探针的浓度，耗时更短；②本方法使用180°射频脉冲块，射频脉冲之间的间隔时间较长，可以有效降低实验过程样品中射频脉冲能量的沉积；③结合MRI成像方法，可以快速定量测量Xe分子探针的浓度分布或者同时测量多个样品Xe分子探针浓度。

附图说明

图1为SEND脉冲序列图，首先进行由180°脉冲和间隔时间t组成的180°射频脉冲块的预处理，其中，180°脉冲为形状脉冲(图中为但不限于高斯脉冲)，频率偏置为f1，180°射频脉冲块重复次数为N，随后施加频率偏置为f2的90°bp脉冲激发溶解态Xe信号进行采样检测；

图2为298K、4.477atm时，9.32μM CrA-(COOH)₆溶液的1D Xe NMR谱；

图3为298K、4.477atm、180°射频脉冲块重复次数N＝200和间隔时间t＝150ms、饱和脉冲频率偏置分别为Δω_rf＝-14889Hz(蓝)和-Δω_rf＝14889Hz(红)时，2.50μM CrA-(COOH)₆溶液的1D Xe NMR叠加谱；

图4为2.50μM CrA-(COOH)₆溶液在180°射频脉冲块重复次数分别为25、50、100和200时测量浓度与真实浓度的对比；

图5为本发明的基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量方法的流程示意图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明作进一步的阐述，应当理解，此处所描述的实施方式仅用于说明和解释本发明，并不是对本发明的限定。

基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量方法，SEND脉冲序列如图1所示，首先进行由180°脉冲和间隔时间t组成的180°射频脉冲块的预处理，其中，180°脉冲为形状脉冲(图1中为但不限于高斯脉冲)，其频率偏置为f1，间隔时间为t，180°射频脉冲块重复次数为N，随后施加频率偏置为f2的90°bp脉冲激发溶解态Xe信号进行采样检测。

基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量方法，包括以下步骤：

步骤1，配制已知浓度的Xe分子探针溶液，测量Xe分子探针与Xe的结合常数K；

配制已知浓度的Xe分子探针溶液，此处采用在1D Xe NMR谱方法但不局限于这一种方法，测量一定溶液温度和混合气体压力条件下Xe分子探针与Xe的结合常数K，其结合常数计算公式为

K＝[[email protected]分子探针]/(([Xe分子探针]-[[email protected]分子探针])*[Xe]_y)

其中，[Xe]_y为溶液中溶解态Xe浓度＝(Xe分压*Xe溶解度)，Xe分压为测试时使用的混合气体总压力和混合气体中Xe所占比例的乘积，Xe溶解度取决于测试时溶液的温度，可通过查表获得，[Xe分子探针]为配制溶液中Xe分子探针浓度，[[email protected]分子探针]表示与Xe结合的Xe分子探针浓度，[[email protected]分子探针]＝I1/I2*[Xe]_y，I1和I2分别为溶液中与Xe结合的Xe分子探针浓度的积分值和溶解态Xe浓度的积分值，I1和I2的值是分别通过对1D Xe NMR谱中与Xe结合的Xe分子探针信号范围，及溶解态Xe信号范围进行积分获得的。

步骤2，配制待测Xe分子探针溶液，将频率偏置为Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S1；

步骤2中，将频率偏置为Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，SEND脉冲序列如图1所示，首先进行由180°脉冲和间隔时间t组成的180°射频脉冲块的预处理，使180°射频脉冲块重复N次，随后施加频率偏置为f2的90°bp脉冲激发溶解态Xe信号进行采样检测，设置SEND脉冲序列相关参数：180°脉冲为高斯脉冲但不限于高斯脉冲的形状脉冲，其频率偏置f1的值Δω_rf为与Xe结合的Xe分子探针信号和溶解态Xe信号之间频率差，以实现180°射频脉冲块对与Xe结合的Xe分子探针信号进行选择性操作；间隔时间t≥3*滞留时间(滞留时间为Xe在Xe分子探针中的停留时间)，以保证与Xe结合的Xe分子探针信号和溶解态Xe信号进行充分交换；180°射频脉冲块重复次数设为N。进行SEND实验，获得待测Xe分子探针溶液的1D Xe NMR谱，对1D Xe NMR谱中溶解态Xe信号范围进行积分，测量并记录待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S1，S1表示溶解态Xe信号受含Xe分子探针浓度在内不同因素的影响。

步骤3，将频率偏置为-Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S2；

步骤3中，采用与步骤2相同的SEND脉冲序列进行实验，在SEND脉冲序列相关参数设置上，除180°射频脉冲块中180°脉冲的频率偏置不同外，其余参数与步骤2中参数设置一致，180°脉冲的频率偏置f1的值-Δω_rf为与Xe结合的Xe分子探针信号相对于溶解态Xe信号对称位置，与溶解态Xe信号之间频率差，以获得与Xe结合的Xe分子探针信号外其他因素对溶解态Xe信号的影响。在与步骤2相同的溶液温度和混合气体压力条件下，进行SEND实验，获得待测Xe分子探针溶液的1D Xe NMR谱，对1D Xe NMR谱中溶解态Xe信号范围进行积分，测量并记录待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S2，S2表示溶解态Xe信号受除Xe分子探针浓度外其他因素(即弛豫等)的影响。

步骤4，根据公式SENDR＝S1/S2计算对比效果SENDR；

步骤4中，根据公式计算对比效果SENDR＝S1/S2，S1和S2分别为步骤2和步骤3中饱和照射频率偏置为Δω_rf和-Δω_rf时溶解态Xe的信号强度，SENDR应在0.05到0.95范围，若SENDR大于0.95，适当增加180°射频脉冲块重复次数N，若SENDR小于0.05，则适当减少180°射频脉冲块重复次数N，然后重复步骤2和步骤3；

步骤5，根据以下公式计算待测Xe分子探针溶液中Xe分子探针浓度

步骤5中，待测Xe分子探针溶液Xe分子探针浓度计算公式为

待测[Xe分子探针]＝(1/K+[Xe])*(1-SENDR^(1/N))/2

其中，K为步骤1中获得的Xe分子探针与Xe结合常数，[Xe]为步骤2和步骤3中待测Xe分子探针溶液中溶解态Xe浓度，其计算公式为[Xe]＝(Xe分压*Xe溶解度)，其大小与步骤2和步骤3中待测溶液使用的测试条件(即混合气体总压力、混合气体中Xe所占比例和待测溶液温度)有关，Xe分压为混合气体总压力与混合气体中Xe所占比例的乘积，Xe溶解度取决于待测溶液温度，可查表获得，SENDR为步骤4根据步骤2和步骤3的测量结果计算获得对比效果，N为步骤2和步骤3中使用的180°射频脉冲块重复次数，将K、[Xe]、SENDR和N代入公式，计算获得待测溶液中Xe分子探针浓度。

实施例1

本实施例中以穴番衍生物CrA-(COOH)₆作为Xe分子探针进行基于饱和能量非均匀分布的Xe分子探针浓度快速定量测量，所有磁共振相关实验均在Bruker 400M宽腔谱仪上完成。

基于饱和能量非均匀分布的CrA-(COOH)₆浓度快速定量测量方法，包括以下步骤：

步骤1，配制已知浓度的Xe分子探针溶液，测量Xe分子探针CrA-(COOH)₆与Xe的结合常数K

配制9.32μM CrA-(COOH)₆溶液，测得该溶液在298K和4.477atm条件下累加16次的1D Xe NMR谱(见图2)，实验耗时约384s，测量过程中，混合气体总压力为4.477atm，混合气体中Xe所占比例为0.02，混合气体中Xe分压为4.477atm*0.02＝0.08954atm，测量过程中溶液温度为298K，查表获得298K时溶液中Xe溶解度为4.4mM/atm，根据公式计算得溶液中溶解态Xe浓度[Xe]_y＝Xe分压*Xe溶解度＝0.08954atm*4.4mM/atm＝394μM；根据测得的1D XeNMR谱(图2)，可在以下化学位移：0ppm、-134.5ppm和-190ppm附近分别观测到溶解态Xe信号、与Xe结合的Xe分子探针CrA-(COOH)₆信号和气态Xe信号，分别对化学位移范围-133.5～135.5ppm和-2～2ppm进行积分，获得溶液中与Xe结合的Xe分子探针CrA-(COOH)₆浓度的积分值I1＝0.013091和溶解态Xe浓度积分值I2＝1.000000，代入公式，计算得溶液中与Xe结合的Xe分子探针CrA-(COOH)₆浓度为[[email protected](COOH)₆]＝I1/I2*[Xe]_y＝0.013091/1.000000*394μM＝5.16μM，进一步计算得与Xe的结合的Xe分子探针CrA-(COOH)₆常数为

K＝[[email protected](COOH)₆]/(([CrA-(COOH)₆]-[[email protected](COOH)₆])*[Xe]_y)

＝5.16μM/((9.32μM-5.16μM)*394μM)

＝3148.1840M^-1

步骤2，配制待测Xe分子探针溶液，将频率偏置为Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S1

配制2.5000μM CrA-(COOH)₆作为待测溶液，设置SEND脉冲序列相关参数：180°脉冲为高斯脉冲，180°脉冲频率偏置Δω_rf为-14889.15Hz，即与Xe结合的Xe分子探针信号和溶解态Xe信号频率差，间隔时间t＝150ms，180°射频脉冲块重复次数N＝200，使用SEND脉冲序列获得温度为298K、混合气体压力为4.477atm条件时待测Xe分子探针溶液的1D Xe NMR谱，实验耗时约53.4s，其化学位移(-2～2ppm范围)NMR谱如图3(实线)所示，对Xe分子探针溶液中的溶解态Xe信号(化学位移范围为-1～1ppm)进行积分，获得溶解态Xe信号强度S1＝0.3093，将180°射频脉冲块重复次数N分别设置为200、100、50和25，重复该实验过程，依次获得其相应溶解态Xe信号强度S1为0.3093、0.6748、1.0339和1.2663，实验耗时依次约为53.4s、38.2s、30.6s和26.8s。

步骤3，将频率偏置为-Δω_rf的SEND脉冲序列施加至待测Xe分子探针溶液，采样获得待测Xe分子探针溶液溶解态Xe信号强度S2

对步骤2配制的待测Xe分子探针溶液，设置SEND脉冲序列相关参数：180°脉冲为高斯脉冲，180°脉冲频率偏置-Δω_rf为14889.15Hz，即与Xe结合的Xe分子探针信号相对于溶解态Xe信号对称位置，与溶解态Xe信号频率差，间隔时间t＝150ms，180°射频脉冲块重复次数N＝200，使用SEND脉冲序列获得温度为298K、混合气体压力为4.477atm条件时待测Xe分子探针溶液的1D Xe NMR谱，其化学位移(-2～2ppm范围)NMR谱如图3(虚线)所示，实验耗时约为53.4s，对溶液溶解态Xe信号(化学位移范围为-1～1ppm)进行积分，获得溶解态Xe信号强度S2＝1.2772，将180°射频脉冲块重复次数N分别设置为200、100、50和25，重复该实验过程，依次获得其相应溶解态Xe信号强度S2为1.2772、1.3672、1.4845和1.5218，实验耗时依次约为53.4s、38.2s、30.6s和26.8s。

步骤4，根据公式SENDR＝S1/S2计算对比效果SENDR

根据步骤2和步骤3中S1和S2的测量结果，根据公式SENDR＝S1/S2计算180°射频脉冲块重复次数N为200、100、50和25时的对比效果SENDR，计算得SENDR依次为0.2422、0.4936、0.6965和0.8321。

步骤5，根据以下公式计算待测Xe分子探针溶液中Xe分子探针CrA-(COOH)₆浓度

待测Xe分子探针溶液中Xe分子探针CrA-(COOH)₆浓度计算公式为：

待测[CrA-(COOH)₆]＝(1/K+[Xe])*(1-SENDR^(1/N))/2

其中，K为Xe分子探针CrA-(COOH)₆与Xe结合常数，由步骤1获得，大小为K＝3148.1840M^-1，[Xe]为待测Xe分子探针溶液中溶解态Xe浓度，其计算公式为[Xe]＝Xe分压*Xe溶解度，步骤2和步骤3中待测Xe分子探针溶液使用的测试条件为混合气体总压力4.477atm，混合气体中Xe所占比例为0.02，待测Xe分子探针溶液温度为298K，其与步骤1中已知浓度Xe分子探针溶液测试条件相同，待测Xe分子探针溶液中溶解态Xe浓度大小为[Xe]＝394μM，SENDR为对比效果，由步骤4根据步骤2和步骤3的测量结果计算获得，180°射频脉冲块重复次数N为200、100、50和25时，SENDR分别为0.2422、0.4936、0.6965和0.8321，代入公式计算得待测Xe分子探针溶液中Xe分子探针CrA-(COOH)₆浓度测量值依次为2.5138μM、2.5037μM、2.5645μM和2.6065μM，图4为不同180°射频脉冲块重复次数时CrA-(COOH)₆浓度测量值与真实浓度(2.5000μM)对比，结果显示，施加180°射频脉冲块重复次数不同时，测得的Xe分子探针溶液中Xe分子探针浓度与真实浓度差异均较小，基于饱和能量非均匀分布方法可以实现待测Xe分子探针溶液Xe分子探针浓度的快速测量。

需要指出的是，本发明中所描述的具体实施例仅是对本发明作举例说明。本发明所属技术领域的技术人员可以对所描述的具体实施例作各种各样的修改或补充或采用类似的方式替代，但并不会偏离本发明的精神或超越所附权利要求书所定义的范围。