阅读说明：本技术 灭活脂包膜病毒的环境相容性去污剂 (Environmentally compatible detergents for inactivation of lipoenveloped viruses ) 是由 J-B·法西 J·金德曼 B·蒂尔 T·R·克雷尔 于 2018-10-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及使用环境相容性去污剂灭活脂包膜病毒的方法,并且涉及使用环境相容性去污剂制备生物药物的方法。本发明还提供了环境相容性去污剂。(The present invention relates to a method for inactivating a lipid-enveloped virus using an environmentally compatible detergent, and to a method for preparing a biopharmaceutical using an environmentally compatible detergent. The invention also provides environmentally compatible detergents.)

灭活脂包膜病毒的环境相容性去污剂

技术领域

本发明涉及使用环境相容性(environmentally compatible)去污剂灭活脂包膜(lipid-enveloped)病毒的方法，并且涉及使用环境相容性去污剂制备生物药物(biopharmaceutical drug)的方法。本发明还提供了环境相容性去污剂。

背景技术

作为治疗许多影响个体健康的疾病、病症或病况的方法，生物药物的用途的重要性不断提高。通常，生物药物通过在宿主细胞(例如哺乳动物细胞系)中纯化生物流体或重组生产而获得。然而，在此类生物制药生产过程中，病毒污染成为严重问题。病毒污染可通过待纯化的生物流体或通过动物来源产品的使用引入生物制药生产过程。与细菌污染不同，病毒污染难以检测。但是，如果不注意病毒污染而将感染性病毒掺入生物药物的制剂中，则会给患者造成严重健康风险。因此，病毒灭活在生物制药生产中至关重要。

在许多生物制药生产过程中，去污剂用于病毒灭活。通常，这些去污剂在所谓的溶剂/去污剂(S/D)处理中与溶剂混合。去污剂Triton X-100已用于商业产品的S/D处理多年。

然而，最近的生态研究表明，Triton X-100及其分解产物可能会成为水生生物的内分泌干扰物，从环境影响的角度引起担忧(参见“ECHA Support document foridentification of4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol,ethoxylated as substancesof very high concern because,due to their degradation to a substance of veryhigh concern(4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol)with endocrine disruptingproperties,they cause probable serious effects to the environment which giverise to an equivalent level of concern to those of CMRs and PBTs/vPvBs(ECHA支持文档，用于鉴定被高度关注的乙氧基化的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚，由于它们降解为具有内分泌干扰特性的高度关注的物质(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚)，它们可能会对环境造成严重影响，从而引起与CMR和PBT/vPvB相同程度的关注)”，2012年12月12日通过)。因此，需要替代的用于病毒灭活的环境相容性去污剂。

发明内容

通过提供以下实施方式，本发明满足上述需求并解决本领域的上述问题：

Triton-X100的致毒活性由酚部分引起，该酚部分具有停泊在海洋生物的某些内分泌受体中的能力。一致地，基于内分泌干扰物活性的计算机模拟预测，对于本发明的非酚类(non-phenolic)聚氧乙烯醚去污剂，没有任何证据表明它们具有内分泌干扰物活性。

本申请发明人惊奇地发现，在S/D处理中，环境相容性非酚类聚氧乙烯醚去污剂(例如Triton X-100Reduced、Triton N-101Reduced和Brij C10)可以有效地灭活脂包膜病毒。发明人还合成了环境相容性非酚类聚氧乙烯醚去污剂，该去污剂在S/D和单去污剂(single-detergent)处理中可以有效地灭活脂包膜病毒。因此，发明人发现，在本发明的灭活脂包膜病毒的方法中可使用环境相容性非酚类聚氧乙烯醚去污剂。

因此，本发明通过提供下述优选实施方式，提供了环境相容性非酚类聚氧乙烯醚去污剂以及灭活脂包膜病毒的改进方法：

1.下式(VIII)的化合物：

其中，

R表示烃基，该烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；

m表示1至4的整数；以及

A表示聚氧乙烯残基。

2.根据第1项所述的化合物，其中，A表示包含4至16个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基，优选包含9或10个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

3.根据第1或2项所述的化合物，其中，m等于1。

4.根据第1至3项中任一项所述的化合物，其中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基。

5.根据第1至4项中任一项所述的化合物，其中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和2至4个甲基作为所述直链上的取代基。

6.根据第1至5项中任一项所述的化合物，其中，R表示烃基，所述烃基具有4个碳原子的直链和4个甲基作为所述直链上的取代基。

7.根据第1至6项中任一项所述的化合物，其中，R表示2,4,4-三甲基-戊-2-基。

8.根据第1项所述的化合物，其中，式(VIII)的化合物为以下化合物：

其中，m和z为独立地选自下组的整数：

m＝1至4；

z＝1至5。

9.根据第8项所述的化合物，其中，m等于1。

10.根据第1项所述的化合物，其中，式(VIII)的化合物为以下化合物：

其中，n为4至16的整数，优选地，其中，n等于9或10。

11.根据第1至10项中任一项所述的化合物，条件是排除具有以下结构式的29-[4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九烷-1-醇：

12.一种灭活具有脂质包膜(lipid envelope)的病毒的方法，该方法包括以下步骤：

a)向液体中添加去污剂，制备所述去污剂和所述液体的混合物；以及

b)孵育所述混合物，灭活所述病毒；

其中，所述去污剂为聚氧乙烯醚，所述去污剂为非酚类去污剂。

13.根据第12项所述的方法，其中，所述去污剂是环境相容的。

14.根据第12或13项所述的方法，其中，所述去污剂为非离子型去污剂。

15.根据第12至14项中任一项所述的方法，其中，所述去污剂为第1至11中任一项所述的化合物。

16.根据第12至14项中任一项所述的方法，其中，所述去污剂为聚氧乙烯烷基醚。

17.根据第16项所述的方法，其中，所述聚氧乙烯烷基醚为聚氧乙烯环烷基醚。

18.根据第17项所述的方法，其中，所述聚氧乙烯环烷基醚的环烷基部分为烷基取代的环烷基部分。

19.根据第18项所述的方法，其中，所述烷基取代的环烷基部分为支链烷基取代的环烷基部分。

20.根据第17至19项中任一项所述的方法，其中，所述聚氧乙烯环烷基醚为聚氧乙烯环己基醚。

21.根据第17至20项中任一项所述的方法，其中，所述聚氧乙烯环烷基醚不为杂环的聚氧乙烯环烷基醚。

22.根据第12至14和16至21项中任一项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(I)的以下结构：

其中，x、y和z为独立地选自下组的整数：

x＝0至5；

y＝0至5；

z＝0至20。

23.根据第22项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(II)的以下结构：

24.根据第23项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(III)的以下结构：

其中，n为4至16的整数。

25.根据第24项所述的方法，其中，n等于9或10。

26.根据第22项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(IV)的以下结构：

27.根据第26项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(V)的以下结构：

其中，n为4至16的整数。

28.根据第27项所述的方法，其中，n等于9或10。

29.根据第12至14和16项中任一项所述的方法，其中，所述去污剂为线性聚氧乙烯烷基醚。

30.根据第29项所述的方法，其中，所述去污剂为线性聚氧乙烯十六烷基醚。

31.根据第30项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(VI)的以下结构：

其中，x等于15。

32.根据第31项所述的方法，其中，所述去污剂具有根据式(VII)的以下结构：

其中，x等于15，n为5至15的整数。

33.根据第32项所述的方法，其中，n等于10。

34.根据第12至33项中任一项所述的方法，其中，所述去污剂适合用于灭活所述病毒。

35.根据第12至34项中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，不将有机溶剂添加到所述液体中。

36.根据第12至34项中任一项所述的方法，其中，步骤a)还包括向所述液体中添加溶剂，在步骤a)中，通过向所述液体中添加所述去污剂和所述溶剂制得用于灭活所述病毒的溶剂/去污剂混合物。

37.根据第36项所述的方法，其中，所述溶剂为有机溶剂。

38.根据第36或37项所述的方法，其中，所述溶剂为磷酸三正丁酯。

39.根据第12至38项中任一项所述的方法，其中，在步骤a)中，不添加除所述去污剂之外的其他去污剂。

40.根据第12至38项中任一项所述的方法，其中，在所述方法中，不添加除所述去污剂之外的其他去污剂。

41.根据第12至38项中任一项所述的方法，其中，步骤a)还包括向所述液体中添加其他去污剂。

42.根据第41项所述的方法，其中，所述其他去污剂为聚山梨酯80。

43.根据第12至42项中任一项所述的方法，其中，所述液体包含生物医药产品。

44.根据第12至43项中任一项所述的方法，其中，所述液体包含生物药物。

45.根据第44项所述的方法，其中，所述生物药物不为病毒疫苗。

46.根据第44或45项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物为血液因子、免疫球蛋白(例如单克隆抗体)、替代酶、疫苗、基因治疗载体、生长因子或生长因子受体。

47.根据第44至46项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物为治疗性蛋白质。

48.根据第44至47项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物为血液因子，所述血液因子为：因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V、因子VII或因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、冯·维勒布兰德因子(VWF，vonwillebrand factor)、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)或纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)。

49.根据第44至48项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物为因子VIII，优选为重组人因子VIII。

50.根据第44至47项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物为免疫球蛋白，所述免疫球蛋白为来自人血浆的免疫球蛋白或单克隆抗体。

51.根据第12至50项中任一项所述的方法，其中，在步骤a)之前或在步骤a)和步骤b)之间，所述方法还包括用深层过滤器过滤所述液体或混合物的步骤。

52.根据第12至51项中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，将所述混合物孵育至少1小时。

53.根据第12至52项中任一项所述的方法，其中，在步骤b)中，将所述混合物在0℃至10℃的温度下孵育，或者其中，将所述混合物在16℃至25℃的温度下孵育。

54.根据第44至53项中任一项所述的方法，其中，所述方法在步骤b)之后还包括以下步骤：

c)纯化所述生物药物。

55.根据第54项所述的方法，其中，所述纯化包括将所述生物药物与所述去污剂分离。

56.根据第54或55项所述的方法，其中，所述纯化包括将所述生物药物与所述其他去污剂分离。

57.根据第54至56项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物的所述纯化包括通过至少一种色谱纯化来纯化所述生物药物。

58.根据第54至57项中任一项所述的方法，其中，所述至少一种色谱纯化是通过阴离子交换色谱法和/或通过阳离子交换色谱法。

59.一种制备生物药物的方法，所述方法包括第44至58项中任一项所述的方法，其中，所述生物药物如所述第44至58项中任一项所述。

60.根据第59项所述的方法，所述方法在第44至58项中任一项所述的方法之后，还包括制备包含所述生物药物的药物制剂的步骤。

61.第12至34项中任一项所述的去污剂在灭活具有脂质包膜的病毒的方法中的用途。

62.根据第61项所述的用途，其中，在所述用途中，不使用除所述去污剂之外的其他去污剂。

63.根据第61或62项所述的用途，其中，在所述用途中，不使用有机溶剂。

64.根据第61项所述的用途，其中，用于灭活所述病毒的所述方法为使用溶剂/去污剂处理的方法，所述溶剂/去污剂处理包括使用第12至34中任一项所述的去污剂。

65.根据第61至64项中任一项所述的用途，其中，所述病毒灭活为对液体进行病毒灭活，所述液体包含第44至50项中任一项所述的生物药物。

66.组合物，其中，所述组合物包含第12至34项中任一项所述的去污剂。

67.去污剂，其根据第12至34项中任一项所述。

68.根据第66项所述的组合物，其中，所述组合物还包含第44至50项中任一项所述的生物药物。

69.根据第66或68项所述的组合物，其中，所述组合物不包含任何有机溶剂。

70.根据第66或68项所述的组合物，其中，所述组合物还包含第37和38项中任一项所述的有机溶剂。

71.根据第66或68至70项中任一项所述的组合物，其中，所述组合物不包含除所述去污剂之外的任何其他去污剂。

72.根据第66或68至70项中任一项所述的组合物，其中，所述组合物还包含第41和42中任一项所述的其他去污剂。

73.一种用于病毒灭活的试剂盒，其中，所述试剂盒包含第67项所述的去污剂或前述项目中任一项所述的组合物，并且还包含用于第57至58项中任一项所述的色谱纯化的色谱树脂。

74.根据第73项所述的试剂盒，其中，所述试剂盒还包含深层过滤器。

75.一种合成下式(VIII)的化合物的方法，

其中，

R表示烃基，所述烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；

m表示1至4的整数；以及

A表示聚氧乙烯残基；

其中，所述方法包括以下步骤：

A)将下式(IX)的苯酚转化为下式(X)的醇：

其中，R如上所述，

其中，R和m如上所述；

以及

(B)将式(X)的醇转化为具有如上所述的通式(VIII)的聚氧乙烯醚。

76.一种合成下式(VIII)的化合物的方法，

其中，

R表示烃基，所述烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；

m表示1至4的整数；以及

A表示聚氧乙烯残基；

其中，所述方法包括以下步骤：

(1)使甲苯反应，得到下式(XI)的取代的甲苯，其中，R如上所述，

(2)将式(XI)的取代的甲苯转化为下式(XII)的化合物，其中，R和m如上所述，X选自羟基、溴原子、碘原子和氯原子，

以及

(3)将式(XII)的化合物转化为具有如上所述的通式(VIII)的聚氧乙烯醚。

77.一种合成下式(VIIIa)的化合物的方法，

其中，

R表示烃基，所述烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；以及

A表示聚氧乙烯残基；

其中，所述方法包括以下步骤：

(I)将苄醇转化为下式(XIII)的化合物，其中，R如上所述，

以及

(II)将式(XIII)的化合物转化为具有如上所述的通式(VIIIa)的聚氧乙烯醚。

78.根据第75至77项中任一项所述的方法，其中，A表示包含4至16个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

79.根据第78项所述的方法，其中，A表示包含8至10个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

80.根据第78项所述的方法，其中，A表示包含9或10个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

81.根据第75、76和78至80项中任一项所述的方法，其中，m等于1。

82.根据第75至81项中任一项所述的方法，其中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基。

83.根据第75至82项中任一项所述的方法，其中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和2至4个甲基作为所述直链上的取代基。

84.根据第75至83项中任一项所述的方法，其中，R表示烃基，所述烃基具有4个碳原子的直链和4个甲基作为所述直链上的取代基。

85.根据第75至84项中任一项所述的方法，其中，R表示2,4,4-三甲基-戊-2-基。

86.根据第75至77项中任一项所述的方法，其中，式(VIII)的化合物为以下化合物：

其中，m和z为独立地选自下组的整数：

m＝1至4；

z＝1至5。

87.根据第86项所述的方法，其中，m等于1。

88.根据第75至77项中任一项所述的方法，其中，式(VIII)的化合物为以下化合物：

其中，n为4至16的整数，优选，n等于9或10。

89.根据第76和78至88项中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中的转化是使用AIBN(偶氮二异丁腈)作为自由基引发剂的自由基反应。

90.根据第76和78至89项中任一项所述的方法，其中，X为溴原子。

91.根据第76和78至90项中任一项所述的方法，其中，步骤(2)中的转化使用N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)作为试剂。

92.根据第76和78至91项中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中的转化使用TBME(甲基叔丁基醚)作为溶剂。

93.根据第76和78至92项中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中的转化进行至少2小时，优选在环境温度下进行。

94.根据第76和78至93项中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中的转化进行不超过5小时，优选在环境温度下进行。

95.根据第76和78至94项中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中的转化进行3小时，优选在环境温度下进行。

96.根据第75至95项中任一项所述的方法，其中，所述方法以产生至少100g、至少1kg、至少10kg、至少100kg或至少1000kg的所述式(VIII)的所述化合物的规模进行。

附图说明

图1：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％的Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用HIV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF，reductionfactor)来表示。将使用Triton X-100Reduced(“TX-100Red.”)或Triton N-101Reduced(“TN-101Red.”)进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图2：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％的Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用PRV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Triton X-100Reduced(“TX-100Red.”)或Triton N-101Reduced(“TN-101Red.”)进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图3：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％的Brij C10、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用HIV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图4：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％的Brij C10、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用PRV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图5：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％的Brij C10、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图6：在1℃±1℃下，在对含有人血清白蛋白(HSA)的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.08％至0.1％的BrijC10、0.02％至0.03％的聚山梨酯80、0.02％至0.03％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用X-MuLV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图7：在1℃±1℃下，对含有HSA的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.08％至0.1％的Brij C10、0.02％至0.03％的聚山梨酯80、0.02％至0.03％的TnBP(与Triton X-100的现有数据进行比较)。对于使用BVDV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图8：在19℃±1℃下，对含有HSA的液体进行S/D处理时，低浓度的Brij C10的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.08％至0.1％的Brij C10、0.02％至0.03％的聚山梨酯80、0.02％至0.03％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用X-MuLV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用Brij C10进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。

图9：在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行S/D处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.04％至0.06％4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、0.01％至0.02％的聚山梨酯80、0.01％至0.02％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用PRV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。注意，在(A)中，两种去污剂显示出相同的灭活动力学。实心符号显示了具有剩余感染性(remaininginfectivity)的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

图10：在1℃±1℃下，对含有人血清白蛋白(HSA)的液体进行S/D处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.08％至0.1％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、0.02％至0.03％的聚山梨酯80、0.02％至0.03％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用X-MuLV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

图11：在19℃±1℃下，对含有HAS的液体进行S/D处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的病毒灭活效率。使用三组分混合物，得到的最终浓度为0.08％至0.1％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、0.02％至0.03％的聚山梨酯80、0.02％至0.03％的TnBP(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用X-MuLV的两次实验(分别为A和B)，随时间变化的病毒灭活情况用病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物进行S/D处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行S/D处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

图12：(A)在14℃±1℃下，对含有HSA的缓冲液进行去污剂处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced或Brij C10的病毒灭活效率。使用单去污剂处理，得到的最终浓度为0.09％至0.11％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced或Brij C10(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验，随时间变化的病毒灭活情况用平均病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(“TX-100red.”)或Brij C10进行单去污剂处理的病毒灭活与使用Triton X-100进行单去污剂处理的病毒灭活(“TX-100”)进行比较。注意，4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物和Triton X-100Reduced具有与Triton X-100相同的灭活动力学。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。(B)在14℃±1℃下，对含有HSA的缓冲液进行去污剂处理时，4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或TritonX-100Reduced的病毒灭活效率。使用单去污剂处理，得到的最终浓度为0.02％至0.04％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验，随时间变化的病毒灭活情况用平均病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(“TX-100red.”)进行单去污剂处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行单去污剂处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

图13：(A)在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行去污剂处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced的病毒灭活效率。使用单去污剂处理，得到的最终浓度为0.09％至0.11％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验，随时间变化的病毒灭活情况用平均病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或TritonX-100Reduced(“TX-100red.”)进行单去污剂处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行单去污剂处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。(B)在17℃±1℃下，对含有IVIG的液体进行去污剂处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced的病毒灭活效率。使用单去污剂处理，得到的最终浓度为0.02％至0.04％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验，随时间变化的病毒灭活情况用平均病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(“TX-100red.”)进行单去污剂处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行单去污剂处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

图14：在23℃±1℃下，对含有因子VIII的液体进行去污剂处理时，低浓度的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced的病毒灭活效率。使用单去污剂处理，得到的最终浓度为0.09％至0.11％的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(与相同浓度的Triton X-100并排比较)。对于使用BVDV的两次实验，随时间变化的病毒灭活情况用平均病毒减少系数(RF)来表示。将使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced(“TX-100red.”)进行单去污剂处理的病毒灭活与使用Triton X-100(“TX-100”)进行单去污剂处理的病毒灭活进行比较。实心符号显示了具有剩余感染性的值，非实心符号显示了低于检测限的减少系数。

具体实施方式

除非下文另有定义，否则应根据本领域技术人员已知的通用含义来理解本发明中使用的术语。

本文引用的所有出版物、专利和专利申请出于所有目的通过引用整体并入本文。

定义

术语“具有脂质包膜的病毒”、“脂包膜病毒”和“包膜病毒”在本文中可互换使用，并且具有本领域技术人员已知的含义。例如，脂包膜病毒可为：疱疹病毒科，例如伪狂犬病毒(PRV)、单纯疱疹病毒、水痘带状疱疹病毒、巨细胞病毒或爱泼斯坦-巴尔病毒(Epstein-Barr virus)；肝脱氧核糖核酸病毒科(Hepadnaviridae)，例如乙型肝炎病毒；披膜病毒科，例如辛德毕斯病毒(sindbis virus)、风疹病毒或甲病毒；砂粒病毒科(Arenaviridae)，例如淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(lmphocytic choriomeningitis virus)；黄病毒科，例如西尼罗河病毒(West Nile virus)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV，bovine viral diarrheavirus)、登革病毒(dengue virus)、丙型肝炎病毒或黄热病毒；正粘病毒科，例如甲型流感病毒、乙型流感病毒、丙型流感病毒、传染性鲑鱼贫血病毒(isavirus)或托高土病毒(thogotovirus)；副粘病毒科(Paramyxoviridae)，例如仙台病毒(sendai virus)、麻疹病毒、腮腺炎病毒、呼吸道合胞体病毒、牛瘟病毒或犬瘟热病毒；布尼亚病毒科(Bunyaviridae)，例如加利福尼亚脑炎病毒或汉坦病毒(hantavirus)；弹状病毒科(Rhabdoviridae)，例如水泡性口炎病毒或狂犬病毒；丝状病毒科，例如埃博拉病毒或马尔堡病毒；冠状病毒科，例如冠状病毒或严重急性呼吸系统综合症(SARS)冠状病毒；玻那病毒科(Bornaviridae)，例如玻那病病毒；或动脉炎病毒科，例如动脉炎病毒属或马动脉炎病毒；逆转录病毒科(Retroviridae)，例如人类免疫缺陷病毒(HIV)、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型(HTLV-1，Human T-lymphotropic virus 1)或异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV，xenotropic murine leukemia virus)；痘病毒科，例如牛痘病毒或正痘病毒属天花病毒科(Orthopoxvirus variolae)(天花病毒)。

如本文所用，术语“灭活具有脂质包膜的病毒”指破坏脂包膜病毒感染细胞的能力。如本领域技术人员会理解的，通常通过确定液体中感染性病毒颗粒的数量，来评估脂包膜病毒感染细胞的能力(即脂包膜病毒的感染性)。因此，如本文所用，术语“灭活具有脂质包膜的病毒”或“灭活脂包膜病毒”指减少溶液中感染性病毒颗粒的数量。

在本文，术语“Log10减少值”或“LRV”与术语“病毒减少系数”、“减少系数”、“RF”或“R”可互换使用。在一个实施方式中，“Log10减少值”或“LRV”可用作液体中感染性病毒颗粒减少的量度。如本文所用，“Log10减少值”或“LRV”定义为病毒灭活之前的感染性病毒颗粒与病毒灭活之后的感染性病毒颗粒的比率的对数(以10为底)。LRV值对给定类型的病毒具有特异性。对于本领域技术人员显而易见的是，任何高于0的Log10减少值(LRV)均有助于改善方法和过程(例如生物制药生产方法和过程)的安全性。如本领域技术人员所知的那样确定通过本发明方法实现的Log10减少值(LRV)。例如，可通过测定对液体进行本发明的病毒灭活方法之前和之后液体中的感染性病毒颗粒的数目，来确定LRV。

技术人员将知道用于测量液体中的感染性病毒颗粒的多种方法。例如但不限于，液体中的感染性病毒颗粒浓度可优选通过噬菌斑测定法或通过TCID₅₀测定法来测定，更优选通过TCID₅₀测定法来测定。如本文所用，“TCID₅₀测定法”指组织培养物感染剂量测定法。TCID₅₀测定是终点稀释检测，其中，TCID₅₀值表示在50％接种细胞培养物中诱导细胞死亡或病理变化所必需的病毒浓度。

如本文所用，术语“表面活性剂”指降低两种液体之间或液体与固体之间的表面张力的化合物。表面活性剂可用作去污剂、湿润剂、乳化剂、发泡剂和分散剂。

关于本发明，关于先提及和后提及的溶剂、去污剂和/或液体的术语(例如“添加到”、“添加至”或“加入”)包括将先提及的溶剂、去污剂和/或液体添加到后提及的溶剂、去污剂和/或液体中的情况。然而，这些术语还意在包括将后提及的溶剂、去污剂和/或液体添加到先提及的溶剂、去污剂和/或液体中的情况。因此，术语如“添加到”、“添加至”或“加入”并不意在说明是否将先提及的溶剂、去污剂和/或液体添加到后提及的溶剂、去污剂和/或液体中，反之亦然。

如本领域技术人员所知，术语“去污剂”根据其在本领域中已知的一般含义来使用，并且特别包括可透化脂质膜的表面活性剂。例如，已提出用去污剂Triton X-100和脱氧胆酸盐通过与蛋白质的疏水部分结合来溶解两亲性膜蛋白(参见Simons等，1973)。根据去污剂的电荷，将去污剂分为三大类。阴离子去污剂包含阴离子(即带负电荷)的亲水基团。示例性的阴离子去污剂为：十四烷基三甲基溴化铵、十二烷基三甲基溴化铵、月桂基硫酸钠、十二烷基硫酸钠(SDS)、溴棕三甲铵(cetrimide)和十六烷基三甲基溴化铵。阳离子去污剂包含阳离子(即带正电荷)的亲水基团。示例性的阳离子去污剂为：苯扎氯铵、十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、氯化十六烷基吡啶(CPC)和苄索氯铵(BZT)。如本文所用，术语“非离子型去污剂”指不具有正电荷或负电荷的去污剂，示例性的非离子型去污剂为：山梨聚糖酯(sorbitan ester)(山梨聚糖单月桂酸酯、山梨聚糖单棕榈酸酯、山梨聚糖单硬脂酸酯、山梨聚糖三硬脂酸酯、山梨聚糖单油酸酯、山梨聚糖三油酸酯)、聚山梨酯(聚氧乙烯(20)山梨聚糖单月桂酸酯(聚山梨酯20)、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单棕榈酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖三硬脂酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖三油酸酯、聚氧乙烯(20)山梨聚糖单油酸酯(Tween 80/聚山梨酯80))、泊洛沙姆(泊洛沙姆407、泊洛沙姆188)和克列莫佛(cremophor)。本发明的去污剂如优选实施方式中所述，包括但不限于Triton N-101Reduced、Triton X-100Reduced和Brij C10。

如本文所用，术语“非酚类(non-phenolic)”可与术语“不含酚(phenol-free)”互换使用。本发明中使用的非酚类去污剂指不包含任何酚官能团的去污剂。术语“芳香”具有本领域技术人员已知的含义。在本发明中使用的非芳香去污剂指不包含任何芳香环的去污剂。

如本文所用，术语“环境相容性”具有本领域技术人员已知的含义。在本发明的一个优选实施方式中，关于去污剂，术语“环境相容性”表示去污剂不充当内分泌干扰物。内分泌干扰物是改变内分泌系统功能的外源性物质，因此会在完整的有机体或它的后代或(亚)群中造成不利的健康影响。技术人员将知道鉴别内分泌干扰物的各种方法。有关内分泌干扰物及它们的评估的更多信息，例如，可见于“ECHA Support document for foridentification of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol,ethoxylated assubstances of very high concern because,due to their degradation to asubstance of very high concern(4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol)withendocrine disrupting properties,they cause probable serious effects to theenvironment which give rise to an equivalent level of concern to those ofCMRs and PBTs/vPvBs(ECHA支持文档，用于鉴定被高度关注的乙氧基化的4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚，由于它们降解为具有内分泌干扰特性的高度关注的物质(4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯酚)，它们可能会对环境造成严重影响，从而引起与CMR和PBT/vPvB相同程度的关注)”，于2012年12月12日通过，其全部内容通过引用整体并入本文并用于所有目的；或手册“Global Assessment of the Sate-of-the-Science of Endocrine Disruptors”(WHO/PCS/EDC/02.2)，由世界卫生组织国际化学品安全规划署(International Programme onChemical Safety of the World Health Organisation)出版，其全部内容通过引用整体并入本文并用于所有目的。

如本文所用，术语“溶剂”具有本领域技术人员已知的含义。在本发明的一个优选实施方式中，在本发明的方法中使用有机溶剂。特别有用的有机溶剂产生促进去污剂与脂包膜病毒的脂蛋白包膜之间接触的环境。如此，促进此种接触的有机溶剂优选用于本发明的方法中，包括但不限于醚、醇、磷酸烷基酯(例如磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯)或它们的任何组合。

可用于本文公开的方法的醚溶剂包括式R1-O-R2的那些，其中，R1和R2独立地为可包含氧原子或硫原子的C1-C18烷基或C1-C18烯基，优选C1-C18烷基或C1-C18烯基。醚的非限制性实例包括：二甲醚、二乙醚、乙基丙基醚、甲基丁基醚、甲基异丙基醚和甲基异丁基醚。可用于本文公开的方法的醇溶剂包括具有C1-C8烷基或C1-C8烯基的那些。醇的非限制性实例包括：甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、正丁醇、异丁醇、正戊醇和异戊醇。对本文公开的方法中有用的磷酸烷基酯溶剂包括具有C1-C18烷基或C1-C18烯基的那些，C1-C18烷基或C1-C18烯基可包含氧原子或硫原子。磷酸烷基酯的非限制性实例包括：磷酸二烷基酯，例如磷酸二(正丁基)酯、磷酸二(叔丁基)酯、磷酸二(正己基)酯、磷酸二(2-乙基己基)酯、磷酸二(正癸基)酯或磷酸二(正丁基)酯；以及磷酸三烷基酯，例如磷酸三(正丁基)酯、磷酸三(叔丁基)酯、磷酸三(正己基)酯、磷酸三(2-乙基己基)酯或磷酸三(正癸基)酯。

如本文所用，术语“生物医药产品”是本领域已知的，并且指其活性物质是生物物质(例如由哺乳动物细胞或微生物产生的生物物质)的产品。如本文所用，本发明的方法中使用的生物医药产品不限于最终制造的产品，而是优选地还包括在制造过程的任何阶段的中间产品。

如本文所用，术语“生物药物”具有本领域技术人员已知的含义。生物药物包括重组生物药物和其他来源的生物药物，例如从人血浆中获得的生物药物。

如本文所用，术语“深层过滤器”具有本领域已知的含义。特别地，此种过滤器(例如梯度-密度深层过滤器)实现了在过滤材料的深层内的过滤。此类过滤器的一个常见类别是包括粘结(或以其他方式固定)的纤维的随机矩阵以形成复杂曲折的流动通道迷宫的那些过滤器。这些过滤器中的颗粒分离通常由于被纤维基质截留或吸附而导致。用于细胞培养液和其他原料的生物加工的最常用深层过滤介质为纤维素纤维、助滤剂(例如DE)和带正电的树脂粘合剂。不同于绝对过滤器，深层过滤介质将颗粒保留在整个多孔介质中，从而允许保留大于和小于孔径的颗粒。颗粒保留被认为涉及尺寸排阻以及通过疏水、离子和其他相互作用的吸附。

如本文所用，术语“纯化生物药物”具有本领域技术人员已知的含义，并且指将生物药物与可能包含在本发明混合物中的其他物质分离。在本发明的一个优选实施方式中，术语“纯化生物药物”指将生物药物与本发明的去污剂分离。

根据本领域已知的含义使用术语“色谱法”。它包括将目标分析物(例如目标分子，例如生物药物)与混合物中存在的其他分子分离的任何色谱技术。通常，由于在移动相或结合过程和洗脱过程的影响下，混合物中各个分子迁移通过固定介质的速率不同，从而将目标分析物会与其他分子分离。

术语“色谱树脂”和“色谱介质”在本文中可互换使用，并且指将目标分析物(例如目标分子，例如生物药物)与存在于混合物中其他分子分离的任何种类的相(例如固相)。通常，由于在移动相或结合过程和洗脱过程的影响下，混合物中各个分子迁移通过固定固相的速率不同，从而将目标分析物会与其他分子分离。各种类型的色谱介质的实例包括：例如，阳离子交换树脂、阳离子交换膜、亲和树脂、阴离子交换树脂、阴离子交换膜、疏水相互作用树脂和离子交换整体柱(monolith)。

如本文所用，术语“药物制剂”具有本领域技术人员已知的含义，并且指适合施用于患者的任何制剂。可根据本领域已知的方法制备药物制剂。例如，对于制剂中存在的任何生物药物，技术人员将能够选择并添加优选的其他成分，包括缓冲剂、稳定剂、表面活性剂、抗氧化剂、螯合剂和/或防腐剂等。

如本文所用，术语“溶剂/去污剂混合物”具有本领域技术人员已知的含义。在一个优选实施方式中，本发明使用的溶剂/去污剂混合物包含除水之外的至少一种溶剂和至少一种去污剂。本发明使用的溶剂优选为有机溶剂，并且最优选为磷酸三正丁酯。混合物中所含的不同溶剂和/或去污剂的数量无特别限制。例如，根据本发明，溶剂/去污剂混合物可由磷酸三正丁酯、聚山梨酯80和聚氧乙烯醚去污剂组成。

应理解，当在本发明中用于表示数值范围时，术语“在...之间”包括相应范围的所指示的下限和上限。例如，当指示温度为0℃至10℃时，这包括0℃和10℃的温度。类似地，当变量x表示为例如4至16的整数时，它包括整数4和16。

应理解，本文所用的术语“1小时”不限于精确的60分钟。如本文所用，术语“1小时”应理解为涉及60分钟±5分钟，优选60分钟±2分钟。

实施方式

本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法包括：向液体中添加去污剂以制备所述去污剂和所述液体的混合物的步骤；以及孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤。如上所述，如本文所用，术语“灭活具有脂质包膜的病毒”指降低溶液中感染性病毒颗粒的浓度。在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，优选地，该方法实现至少一种病毒的至少1Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少2Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少3Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少4Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少5Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少6Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少7Log10减少值(LRV)，或至少一种病毒的至少8Log10减少值(LRV)，最优选至少一种病毒的至少4Log10减少值(LRV)。当然，对于本领域技术人员显而易见的是，至少一种病毒的任何Log10减少值(LRV)均是有益的，因为它提高了例如生物制药生产过程的安全性。本发明涉及的LRV为包膜病毒的LRV。

应理解，尽管本发明的方法通常用于灭活脂包膜病毒，但本发明的去污剂也可灭活未包膜的病毒，例如，如果此种非包膜病毒在其复制周期的某个阶段获得脂质包膜。因此，术语“灭活使具有脂质包膜的病毒”并不意在排除以下可能性：在本发明的方法中，除具有脂质包膜的病毒之外，也可对非包膜病毒进行灭活。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂添加到液体中以制备所述去污剂和所述液体的混合物，并孵育所述混合物以灭活所述病毒。应理解，本发明方法的所述液体可为任何种类的液体或几种液体的混合物，包括溶液、悬浮液或几种悬浮液和/或溶液的混合物。例如但不限于，本发明的所述液体可为血液或可包含血液或血液级分，可为血浆或可包含血浆或血浆级分，可为血清或可包含血清或血清级分，可为细胞培养基或可包含细胞培养基，可为缓冲液或可包含缓冲液。液体也可为工艺中间产品，例如制备生物药物的过程中间产品。

本发明的液体可包含具有脂质包膜的病毒，或者该液体可被怀疑包含具有脂质包膜的病毒(例如，在该液体为血液或包含血液或血液级分、为血浆或包含血浆或血浆级分、为血清或包含血清或血清级分的情况下，或者如果该液体包含细胞培养物中产生的生物药物)。根据本发明的所有其他实施方式，在本发明的一个优选实施方式中，本发明的所述液体包含具有脂质包膜的病毒。本发明的所述液体中的具有脂质包膜的所述病毒的来源并无特别限制。例如，病毒可源自可用于制备本发明的液体的人血液，或源自可用于制备本发明的液体的人血浆，或源自可用于制备本发明的液体的人血清，或源自可用于制备本发明的液体的细胞培养基。特别地，如果病毒源自用于制备本发明的液体的细胞培养基，则病毒可源自所述细胞培养基的动物来源的成分，例如牛血清白蛋白。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂添加到液体中，制备所述去污剂和所述液体的混合物。所述去污剂为聚氧乙烯醚。

聚氧乙烯醚是本领域技术人员已知的，并且具有根据式A的以下结构：

其中，n等于或大于1。

如本领域技术人员将清楚的，聚氧丙烯醚可具有与本发明的聚氧乙烯醚非常相似的性质。因此，根据本发明的所有其他实施方式，例如，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，可用聚氧丙烯醚代替聚氧乙烯醚。

聚氧丙烯醚也是本领域技术人员已知的，并且具有根据式B的以下结构：

其中，n等于或大于1。

如本文所述，本发明的“聚氧乙烯醚”，优选为具有其在本领域中通常含义的聚氧乙烯醚。或者，本发明的聚氧乙烯醚也可为聚氧醚，其中聚氧醚分子总数的一部分(优选大部分)为聚氧乙烯醚分子，但其中聚氧醚分子总数的另一部分(优选小部分)为包含氧乙烯单元和氧丙烯单元的混合聚合物和/或包含氧丙烯单元的聚合物。在此种情况下，术语“聚氧醚分子总数的大部分为聚氧乙烯醚分子”指聚氧醚分子总数的至少50％为聚氧乙烯醚分子。优选地，聚氧醚分子总数的至少60％为聚氧乙烯醚分子。更优选地，聚氧醚分子总数的至少70％为聚氧乙烯醚分子。进一步更优选地，聚氧醚分子总数的至少80％为聚氧乙烯醚分子。甚至更优选地，聚氧醚分子总数的至少90％为聚氧乙烯醚分子。最优选地，聚氧醚分子总数的至少95％为聚氧乙烯醚分子。又或者，本发明的聚氧乙烯醚也可为混合聚氧醚，其包含大部分(例如至少60％，优选至少70％，更优选至少80％，进一步更优选至少90％，最优选至少95％)的氧乙烯单元和小部分的氧丙烯单元。

本发明的方法使用的去污剂为非酚类去污剂。根据本发明所有其他实施方式，在另一个实施方式中，本发明的方法使用的去污剂不是芳香族去污剂。

本发明的聚氧乙烯醚去污剂可通过乙氧基化反应来合成。乙氧基化是用醇(或者可使用胺)进行的工业过程，以产生醇乙氧基化物(又名聚氧乙烯醚)。该反应通过在高温(例如约180℃)和高压(例如在1巴至2巴的压力下)下使环氧乙烷通过醇来进行，其中碱(例如氢氧化钾KOH)用作催化剂。该过程是高度放热的。

该反应导致形成具有重复单元长度的宽的多分散性的产物(上式中的n的值为平均聚合物长度)。

在实验室规模上，可通过首先由醇的羟基形成一个良好的离去基团(leavinggroup)(例如Cl、Br、I、OMs或OTf)，然后使该底物与单去质子化的聚乙二醇反应，来生产聚氧乙烯醚去污剂。或者，可在聚乙二醇链上安装一个良好的离去基团(例如Cl、Br、I、OMs或OTf)，在第二步中该聚乙二醇链与去质子化的醇反应。

合成聚氧乙烯醚的示例性方法详细描述于例如美国专利号1,970,578和Di Serio等(2005)，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

在TX-100、Triton N-101Reduced、Triton X-100Reduced和Brij C10为聚氧乙烯烷基醚(＝用环氧乙烷气体进行乙氧基化反应)时，也可使用环氧丙烷(＝丙氧基化)在工业规模上进行类似反应。唯一的不同是PEG链中的甲基取代：

也可在相同过程中结合乙氧基化和丙氧基化并得到混合产物，例如包含氧乙烯单元和氧丙烯单元的混合的聚合物聚氧醚。

Triton-X100的致毒活性由酚部分引起，该酚部分具有停留在海洋生物的某些内分泌受体中的能力。通过在芳香环和PEG链之间插入亚甲基，Triton-X100的苯酚官能度不再存在于新结构中。此外，一旦PEG链在被释放到环境中之后断裂，暴露的苄醇将容易氧化为相应的苯甲酸。此种代谢物的极性和几何结构与酚衍生物完全不同，这将防止内分泌受体受到任何抑制。

基于上述考虑，本发明人合成了非酚类聚氧乙烯醚并检测了其抗病毒活性(参见实施例4至10)。因此，本发明还提供了下式(VIII)的非酚类聚氧乙烯醚：

在式(VIII)中，R表示烃基，所述烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；m表示1至4的整数；以及A表示聚氧乙烯残基，可选地，条件是排除具有以下结构式的29-[4-(1,1,3,3-四甲基丁基)苯基]-3,6,9,12,15,18,21,24,27-九氧杂二十九烷-1-醇。

在式(VIII)中，R表示烃基，所述烃基具有2至12个(优选2至8个，更优选2至6个和最优选4个)碳原子的直链和一个以上(优选2至6个，最优选4个)甲基作为所述直链上的取代基。

优选地，R表示烃基：所述烃基具有2至12个(优选2至8个，更优选2至6个，最优选4个)碳原子的直链和2个甲基作为所述直链上的取代基；所述烃基具有2至12个(优选2至8个，更优选2至6个，最优选4个)碳原子的直链和4个甲基作为所述直链上的取代基；或者所述烃基具有2至12个(优选2至8个，更优选2至6个，最优选4个)碳原子的直链和6个甲基作为所述直链上的取代基。

最优选地，R表示2,4,4-三甲基-戊-2-基。

在式(VIII)中，m表示1至4的整数，优选为1至2的整数，最优选为1的整数。

在式(VIII)中，A表示聚氧乙烯残基，优选为包含2至20个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基，更优选为包含4至16个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基，甚至更优选为包含8至12个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基，最优选为包含9或10个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

通式(VIII)的化合物的一个优选实施方式为如下的化合物：式中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和2至4个甲基作为所述直链上的取代基；m表示1至2的整数；以及A表示包含8至12个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

通式(VIII)的化合物的另一个优选实施方式为如下的化合物：式中，R表示烃基，所述烃基具有2至6个碳原子的直链和2至4个甲基作为所述直链上的取代基；m表示1的整数；以及A表示包含8至12个氧乙烯单元的聚氧乙烯残基。

通式(VIII)的化合物的一个具体优选实施方式为以下化合物：

其中，m和z为独立地选自下组的整数：

m＝1至4；优选地，其中，m等于1；

z＝1至5。

通式(VIII)的化合物的另一个具体优选实施方式为以下化合物：

4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物

其中，n为4至16的整数；优选地，其中，n等于9或10。

式(VIII)的化合物可通过通常已知的合成方法合成，例如描述于Vogel的教科书Practical Organic Chemistry(实用有机化学)(第5版，1989年，A.I.Vogel,A.R.Tatchell,B.S.Furnis,A.J.Hannaford,P.W.G.Smith)中的那些。例如，可通过将包含取代基(其对应于通式(VIII)的R基团)的苯酚转化为相应的苯甲酸或高苯甲酸，将酸基还原为醇基，并使醇反应形成聚乙二醇醚(也称为聚氧乙烯醚、POE醚)，制得4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物。在本文中，环氧乙烷或合适的聚乙二醇可用作引入聚乙二醇醚官能团的基础(方案1；有效地进行单独转化的实验程序的代表性示例可见于，例如Bioorganic&Medicinal Chemistry,16(9)，4883-4907,2008；Journal of Medicinal Chemistry，48(10)，3586-3604,2005；Journal of Physical Chemistry B，107(31)，7896-7902；2003；Journal of Nanoparticle Research,15(11)，2025/1-2025/12，第12页，2013；和PCT国际申请2005016240，2005年2月24日)。

方案1：

此外，可通过甲苯的烷基化反应，然后将苄基甲基官能团化，然后进一步反应形成聚乙二醇醚，来获得式(VIII)的化合物(方案2；有效地进行单独转化的实验程序的代表性示例可见于，例如Russian Journal of Applied Chemistry，82(6)，1029-1032,2009；Journal of Organic Chemistry，79(1)，223-229，2014；以及Chemistry-A EuropeanJournal,23(60)，15133-15142，2017)。还提出了将苄醇直接烷基化以获得合适的中间体，以引入聚乙二醇醚官能团(方案3；进行相应转化的实验程序的代表性示例可见于，例如Russian Journal of Organic Chemistry，51(11)，1545-1550，2015)。

方案2：

方案3：

式(VIII)的结构的上述聚氧乙烯醚可用于本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法。

如上所述，对本领域技术人员将显而易见的是，聚氧乙烯醚的合成通常产生具有聚氧乙烯重复单元长度的宽的多分散性的产物。因此，当指示本发明的聚氧乙烯醚的聚氧乙烯重复单元的数目时，该数目指聚氧乙烯重复单元的平均长度。聚氧乙烯重复单元的平均长度指样品中所有聚氧乙烯醚分子的聚氧乙烯重复单元的平均数。例如，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法的一个实施方式中，将去污剂添加到液体中以制备所述去污剂和所述液体的混合物，其中，所述去污剂可为具有根据式(III)的以下结构的聚氧乙烯醚：

其中，n等于10。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法的此实施方式中，上式(III)中的n＝10为添加至本发明的液体中的所有聚氧乙烯醚分子的聚氧乙烯重复单元的平均数。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，使用的聚氧乙烯醚去污剂的聚氧乙烯重复单元的平均数为2至100、2至50、2至20或4至16或者9或10。优选地，聚氧乙烯重复单元的平均数为4至16，更优选为9或10，最优选为10。

如本领域技术人员将清楚的，在本发明的聚氧乙烯/聚氧丙烯醚去污剂中，甲基可连接至聚氧乙烯/聚氧丙烯部分的末端羟基(即，末端羟基可被封闭)。末端羟基的此种封闭可促进合成。这对于不是通过乙氧基化或丙氧基化制备的化合物(例如根据以上方案1或方案2制备的化合物)特别有用。具有甲基封闭的聚氧乙烯/聚氧丙烯部分的结构通常称为mPEG衍生物，如以下示例性结构所示：

如本领域技术人员将清楚的，聚氧丙烯醚的合成通常也产生具有聚氧丙烯重复单元长度的宽的多分散性的产物。因此，当指示本发明的聚氧丙烯醚的聚氧丙烯重复单元的数目时，该数目指聚氧丙烯重复单元的平均长度。如以上针对聚氧乙烯醚所述，聚氧丙烯重复单元的平均长度指样品中所有聚氧丙烯醚分子的聚氧丙烯重复单元的平均数。

发明使用的聚氧丙烯醚去污剂的聚氧丙烯重复单元的平均数为2至100、2至50、2至20，或5至15，或9，或10。优选地，聚氧丙烯重复单元的平均数为5至15，更优选为9或10，最优选为10。

在本发明的一个实施方式中，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中使用的聚氧乙烯醚具有根据式(II)的以下结构：

在本发明的一个优选实施方式中，由上式(II)表示的化合物是可商购的TritonX-100Reduced(CAS号92046-34-9)。

在本发明的一个实施方式中，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中使用的聚氧乙烯醚具有根据式(IV)的以下结构：

在本发明的一个优选实施方式中，由上式(IV)表示的化合物是可商购的TritonN-101Reduced(CAS号123359-41-1)。

在本发明的一个实施方式中，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中使用的聚氧乙烯醚具有根据式(VI)的以下结构：

其中，x等于15。

在本发明的一个优选实施方式中，由上式(VI)表示的化合物是可商购的Brij C10(CAS号9004-95-9)。

根据本发明的所有其他实施方式，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，也可用单氧乙烯醚代替聚氧乙烯醚。在本发明的一个优选实施方式中，所述单氧乙烯醚具有根据式C的以下结构：

其中，x、y和z为独立地选自下组的整数：

x＝0至5；

y＝0至5；

z＝0至20。

优选地，所述单氧乙烯醚具有根据式D的以下结构：

或具有根据式E的以下结构：

根据本发明的所有其他实施方式，本发明还提供了与本发明提供的聚氧乙烯醚相对应的单氧乙烯醚。在本发明的一个优选实施方式中，所述单氧乙烯醚具有根据式F的以下结构：

其中，R表示烃基，所述烃基具有2至12个碳原子的直链和一个以上甲基作为所述直链上的取代基；m表示1至4的整数；以及A表示聚氧乙烯残基。

在另一个优选实施方式中，式F的单氧乙烯醚为以下化合物：

式F的结构的以上单氧乙烯醚可用于本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂添加到液体中以制备所述去污剂和所述液体的混合物。在本发明的一个实施方式中，将聚氧乙烯醚去污剂添加到液体中，得到液体中的聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为约0.03％(w/w)至10％(w/w)，优选约0.05％(w/w)至10％(w/w)，更优选0.1％(w/w)至10％(w/w)，甚至更优选约0.5％(w/w)至5％(w/w)，最优选约0.5％(w/w)至2％(w/w)。

在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法的一个优选实施方式中，在该方法中使用的聚氧乙烯醚适合于灭活所述具有脂质包膜的病毒。如本文所用，灭活指破坏脂包膜病毒感染细胞的能力。如本领域技术人员将清楚的，通常通过测定溶液中感染性病毒颗粒的数量，来评估脂包膜病毒感染细胞的能力(即脂包膜病毒的感染性)。本文描述了测定溶液中感染性病毒颗粒数量的示例性方法。

在一个实施方式中，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂和溶剂添加到液体中的步骤以制备灭活所述病毒的溶剂/去污剂混合物的方式进行。优选地，所述溶剂为有机溶剂，甚至更优选地，所述溶剂为磷酸三正丁酯。应理解，本领域技术人员可通过考虑例如液体中潜在存在的病毒、所需LRV、可能存在于液体中的生物药物的性质以及可能存在于液体中的生物药物的制造过程的特征(例如，灭活将在哪种温度下进行)，来适当地选择去污剂的浓度以及溶剂的类型和浓度。通常，在本发明的孵育过程中，有机溶剂和单去污剂的最终浓度为约0.01％(w/w)至约5％(w/w)的有机溶剂和约0.05％(w/w)至约10％(w/w)的去污剂，优选为约0.1％(w/w)至约5％(w/w)的有机溶剂和约0.1％(w/w)至约10％(w/w)的去污剂，更优选为约0.1％(w/w)至约1％(w/w)的有机溶剂和约0.5％(w/w)至约5％(w/w)的去污剂，最优选为约0.1％(w/w)至约0.5％(w/w)的有机溶剂和约0.5％(w/w)至约2％(w/w)的去污剂。

在另一个实施方式中，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂(和可选的溶剂)添加到液体中的步骤以向该液体中添加其他去污剂的方式进行。优选地，所述其他去污剂为聚氧乙烯(80)山梨聚糖单油酸酯(也称为例如聚山梨酯80或Tween 80)。优选地，所述溶剂为有机溶剂，甚至更优选地，所述溶剂为磷酸三正丁酯。应理解，本领域技术人员可通过考虑例如例如液体中存在的潜在病毒、所需LRV、可存在于液体中的生物药物的性质以及可存在于液体中的生物药物的制造过程的特征(例如，灭活将在哪种温度下进行)来适当地选择本发明的去污剂的浓度、其他去污剂的类型和浓度以及溶剂的类型和浓度。通常，有机溶剂的最终浓度为约0.01％(w/w)至约5％(w/w)，本发明的去污剂的最终浓度为约0.05％(w/w)至约10％(w/w)，其他去污剂的最终浓度为约0.01％(w/w)至约5％(w/w)。优选地，有机溶剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约5％(w/w)，本发明的去污剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约10％(w/w)，其他去污剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约5％(w/w)。更优选地，有机溶剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约1％(w/w)，本发明的去污剂的最终浓度为约0.5％(w/w)至约5％(w/w)，其他去污剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约1％(w/w)。最优选地，有机溶剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约0.5％(w/w)，本发明的去污剂的最终浓度为约0.5％(w/w)至约2％(w/w)，其他去污剂的最终浓度为约0.1％(w/w)至约0.5％(w/w)。

在本发明的另一个实施方式中，仅使用一种去污剂。例如，在本发明的方法的一个实施方式中，在步骤a)中，除本发明的去污剂之外不添加其他去污剂。在本发明的方法的另一个实施方式中，在该方法中，除本发明的去污剂之外不添加其他去污剂。在本发明的另一个实施方式中，在本发明的去污剂在灭活具有脂质包膜的病毒的方法中的用途中，除本发明的去污剂之外不使用其他去污剂。这些实施方式的一个优点是可在随后的(方法)步骤中更容易地除去单去污剂。例如，与在标准溶剂/去污剂(S/D)处理中使用的三种组分(其通常包括两种去污剂和一种溶剂，特别是有机溶剂)相比，可更容易地除去单去污剂。因此，在本发明的另一个实施方式中，包含本发明的去污剂的组合物不包含除所述去污剂之外的任何其他去污剂。

在本发明的另一个实施方式中，不使用有机溶剂。例如，在本发明方法的一个实施方式中，在步骤a)中不添加有机溶剂。在本发明的另一个实施方式中，在本发明的去污剂在灭活具有脂质包膜的病毒的方法中的用途中，不使用有机溶剂。在本发明的另一个实施方式中，包含本发明的去污剂的组合物不包含任何有机溶剂。

如上所述，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法在生物制药生产过程中特别有用，其中，必须确保最终产物中不存在活性(即感染性)病毒，以确保患者安全。因此，在一个实施方式中，在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，将去污剂添加至包含生物医药产品或生物药物(优选生物药物)的液体中。在本发明的一个优选实施方式中，所述生物药物不为病毒疫苗。对本发明的生物药物没有特别限制。它们包括重组生物药物和其他来源的生物药物，例如从人血浆中获得的生物药物。本发明的生物药物包括但不限于：血液因子、免疫球蛋白、替代酶、疫苗、基因治疗载体、生长因子及其受体。在一个优选实施方式中，生物药物为治疗性蛋白质。优选的血液因子包括：因子I(纤维蛋白原)、因子II(凝血酶原)、组织因子、因子V、因子VII和因子VIIa、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、冯·维勒布兰德因子(VWF)、前激肽释放酶、高分子量激肽原(HMWK)、纤连蛋白、抗凝血酶III、肝素辅因子II、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、纤溶酶原、α2-抗纤溶酶、组织纤溶酶原激活物(tPA)、尿激酶、纤溶酶原激活物抑制剂-1(PAI1)和纤溶酶原激活物抑制剂-2(PAI2)。因子VIII为特别优选的血液因子，甚至更优选重组因子VIII。可用于本发明的血液因子旨在包括功能性多肽变体和编码该血液因子或编码此种功能性变体多肽的多核苷酸。优选的免疫球蛋白包括来自人血浆的免疫球蛋白、单克隆抗体和重组抗体。本发明的生物药物优选为相应的人蛋白质或重组人蛋白质或它们的功能变体。

如上所述，本发明的生物药物也可为基因治疗载体，包括病毒基因治疗载体。对本领域技术人员显而易见的是，灭活具有本发明脂质包膜的病毒的方法通常不会灭活非包膜病毒。因此，在一个优选实施方式中，当本发明的生物药物为病毒基因治疗载体时，此种病毒基因治疗载体基于非包膜病毒。在一个优选实施方式中，此种病毒基因治疗载体基于腺相关病毒(AAV)。

根据本发明的所有其他实施方式，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法在孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤之后，可以包括纯化所述生物药物的步骤。优选地，所述纯化包括将所述生物药物与所述去污剂分离。技术人员将知道将生物药物与去污剂分离的各种方法。本领域技术人员可在考虑生物药物的特性、其获得来源(例如重组或其他来源，例如人血浆)以及所需的生物药物应用(例如它是否将皮下施用或静脉施用等)来选择此类方法。例如，可使用色谱法(例如阴离子交换色谱法或阳离子交换色谱法)将生物药物与去污剂分离。在一个实施方式中，由所述去污剂进行的所述纯化包括超过一种的色谱纯化。

根据本发明的所有其他实施方式，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法可包括过滤所述混合物的步骤，优选用深层过滤器过滤所述混合物。该过滤步骤可在向液体中添加去污剂以制备所述去污剂和所述液体的混合物的步骤之前进行。或者，该过滤步骤可在向液体中添加去污剂以制备所述去污剂和所述液体的混合物的步骤与孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤之间进行。

根据本发明所有其他实施方式，在另一个实施方式中，在灭活具有脂质包膜的病毒的方法中，孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤可以如下进行：孵育所述混合物至少10分钟，至少30分钟，至少1小时，至少2小时，至少4小时，至少12小时或至少24小时。

根据本发明所有其他实施方式，在另一个实施方式中，在孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤中，所述混合物在低温下孵育，例如温度为0℃至15℃，0℃至10℃，0℃至8℃，0℃至6℃，0℃至4℃或0℃至2℃，优选0℃至10℃。根据本发明所有其他实施方式，在一个替代实施方式中，在孵育所述混合物以灭活所述病毒的步骤中，所述混合物在室温或接近室温下孵育，例如16℃至25℃，18℃至24℃或20℃至23℃。

应理解，进行本发明方法的步骤的方式并无特别限制。特别地，方法步骤可以分批方式进行。或者，方法步骤也可以半连续方式或连续方式进行。

如上所述，本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法在生物制药生产过程中特别有用。因此，本发明还涉及一种制备生物药物的方法，所述方法包括根据本发明及其任何实施方式的灭活具有脂质包膜的病毒的方法的方法步骤。优选地，本发明的制备生物药物的方法包括制备包含所述生物药物的药物制剂的步骤，该步骤在本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法的步骤之后进行。可根据制备药物制剂的已知标准制得此种药物制剂。例如，可以能适当地存储和施用制剂的方式制备该制剂，例如通过使用药学上可接受的组分，例如载体、赋形剂或稳定剂。此类药学上可接受的成分在向患者施用药物制剂时所用剂量下是无毒的。

本发明人惊奇地发现，本发明的聚氧乙烯醚去污剂对于灭活具有脂质包膜的病毒特别有用。因此，本发明还涉及所公开的本发明的聚氧乙烯醚去污剂在灭活具有脂质包膜的病毒的任何方法中的用途。优选地，所述灭活所述病毒的所述方法为使用溶剂/去污剂处理的方法，其中，所述溶剂/去污剂处理包括使用本发明的去污剂。在另一个实施方式中，所述病毒灭活为在包含生物药物的液体中的病毒灭活。

由于本发明人惊奇地发现，本发明的非酚类聚氧乙烯醚去污剂对于灭活具有脂质包膜的病毒特别有用，本发明还涉及本发明的聚氧乙烯醚去污剂以及包含本发明的聚氧乙烯醚去污剂的组合物。在另一个实施方式中，包含本发明的聚氧乙烯醚去污剂的组合物还包含生物药物和/或有机溶剂和/或其他去污剂。

本发明还提供了灭活病毒的试剂盒，该试剂盒包含本发明的聚氧乙烯醚去污剂或组合物(该组合物包含本发明的聚氧乙烯醚去污剂)，并且还包含用于色谱纯化的色谱树脂。在另一个实施例中，所述试剂盒还包含深层过滤器。

本发明提供了非酚类聚氧乙烯醚。如上所述，这些聚氧乙烯醚可用于本发明的灭活具有脂质包膜的病毒的方法中。然而，本发明的这些非酚类聚氧乙烯醚以及所有其他非酚类聚氧乙烯醚也可用于各种其他目的，例如，通常使用Triton X-100的那些目的。例如，本发明的非酚类聚氧乙烯醚可在实验室中使用。在实验室中，它们可用于：例如，裂解细胞以提取蛋白质或细胞器；透化活细胞的膜；透化未固定的(或轻微固定的)真核细胞膜；与两性离子去污剂(例如CHAPS)一起溶解天然状态的膜蛋白；作为DNA提取中的裂解缓冲液(通常为碱性裂解缓冲液中的5％溶液)的一部分；降低免疫染色期间水溶液的表面张力(通常以TBS或PBS缓冲液中的0.1％至0.5％浓度)；在微生物学上限制构巢曲霉(Aspergillusnidulans)的菌落扩增；使动物来源的组织脱细胞；或者在使凝胶中的蛋白质复性之前从SDS-PAGE凝胶中除去SDS。在另一个实施方式中，本发明的非酚类聚氧乙烯醚可用于电子工业，例如，作为板条的润湿剂以改善和加快某些程序和操作。在另一个实施方式中，本发明的非酚类聚氧乙烯醚可具有医药用途，例如，它们可用作杀精剂Nonoxinol 9的替代品，或用作药物赋形剂，或用作流感疫苗(Fluzone)的成分。在其他实施方式中，本发明的非酚类聚氧乙烯醚可用于从重工业产品到温和去污剂的多种类型的清洁剂中；它们可与蒸馏水和异丙醇一起用作自制乙烯基唱片清洁液的成分；它们可用于清洁金刚石锯片；它们可用于乳液聚合的制剂中；它们可用于轮胎；它们可用于洗涤剂和清洁剂；它们可在工业上用作生产聚合物或胶水的起始化学品；它们可用于家用或工业清洁剂、油漆或涂料、纸浆或纸张、油田、纺织品、农药、金属加工液方面；它们可用于软复合材料中碳材料的分散；或者它们可用于金属电镀。

在下文中，将通过实施例对本发明进行说明，但本发明不限于这些实施例。

实施例

如上所述，最近的生态学研究提出了有关在生物制药生产过程中使用Triton X-100的环境问题。基于结构考虑，本发明人已确定与负面环境影响无关的候选去污剂作为Triton X-100的有用替代品。特别地，本发明人惊奇地发现，聚氧乙烯醚是Triton X-100的合适替代物，用于在生物制药生产过程中通过溶剂/去污剂(S/D)处理灭活脂包膜病毒。在以下实验中，用含有静脉注射免疫球蛋白(IVIG，intravenous immunoglobulin)和人血清白蛋白(HSA)的液体，检测示例性候选去污剂用于S/D处理的适合性(suitability)。此外，在以下实验中，合成了4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物，用各种检测项目检测4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物和其他聚氧乙烯醚用于S/D处理以及单去污剂处理的适合性。

实施例1：使用Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced对包含静脉注射免 疫球蛋白的液体进行HIV和PRV灭活

检测Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced用于S/D处理以灭活含有静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的液体中的脂包膜病毒(即人体免疫缺陷病毒(HIV)和伪狂犬病毒(PRV))的适合性，并与Triton X-100进行比较。为此，将病毒添加到包含IVIG的液体中。然后将包含IVIG的含病毒液体与包含低浓度的Triton X-100Reduced、Triton N-101Reduced或Triton X-100的S/D混合物孵育不同的时间，并测定病毒的剩余感染性。以低浓度使用Triton X-100Reduced、Triton N-101Reduced和Triton X-100，以评估病毒灭活的动力学，即随时间变化的病毒灭活效率(以RF表示)。对本领域技术人员而言显而易见的是，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可以以明显更高的浓度使用包含Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced的本发明的去污剂，这将加速病毒灭活的动力学，也有望提高所实现的LRV。

材料

包含IVIG的液体

将包含IVIG的液体(含IVIG液体)在干冰上冷冻，保存在≤-60℃下直至收集之日起一年内使用。

病毒

伪狂犬病毒(PRV；疱疹病毒科；包膜；dsDNA；)用作大型包膜DNA病毒的模型。

人类免疫缺陷病毒(HIV；逆转录病毒科；包膜；ssRNA；)用作相关靶标病毒和其他脂包膜RNA(核糖核酸)病毒(例如HIV-2)的模型。

表1：实验中使用的病毒储备液

¹ECACC：欧洲细胞培养物保藏所(European Collection of Authenticated CellCultures,Public Health England Porton Down,Salisbury,SP4 0JG UK)

²NIAID：美国国家过敏症和传染病研究所(National Institute Of Allergiesand Infectious Diseases,5601Fishers Lane,MSC 9806,Bethesda MD,20892-9806USA)

使用前对病毒储备液进行表征。此表征包括：通过至少十次独立的滴定来确定病毒滴度并指定可接受的病毒滴度范围用作阳性对照，确定病毒储备液蛋白含量，PCR检测鉴定病毒以及PCR检测其他病毒和支原体污染，使用不允许大型病毒聚集物通过的过滤器检测病毒聚集。仅使用通过PCR鉴定/污染检测且无明显聚集的病毒储备液(即病毒储备液和过滤储备液之间的感染性滴度之差小于1.0log)。

Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced的试剂混合物

将S/D组分聚山梨酯80(PS80，Crillet 4HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)与相应去污剂(即Triton X-100，Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced)按以下比率(参见表2至表4)进行组合：

表2：Triton X-100S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		Triton X-100	10.61±0.11
PS80	3.23±0.03
		TnBP	2.93±0.03
所得S/D试剂	16.77

表3：Triton X-100Reduced S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		Triton X-100Reduced	10.61±0.11
PS80	3.23±0.03
		TnBP	2.93±0.03
所得S/D试剂	16.77

表4：Triton N-101Reduced S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		Triton N-101Reduced	10.61±0.11
PS80	3.23±0.03
		TnBP	2.93±0.03
所得S/D试剂	16.77

搅拌各个混合物至少15分钟。室温保存S/D试剂混合物，一年内使用。使用前再次搅拌各个S/D试剂混合物至少15分钟以确保均匀。

方法

在不利于病毒灭活的条件(即较短的孵育时间和相对较低的温度)下，评估S/D处理的病毒灭活能力和稳健性。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更长孵育时间和更高温度，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。此外，如上所述，使用低浓度的S/D组分。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更高浓度的S/D组分，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。

由于蛋白质浓度对S/D处理期间的病毒灭活无显著影响(也参见Dichtelmüller等，2009)，未研究有关蛋白质含量的稳健性。

将含有IVIG的液体解冻，所有其他步骤均在二级生物安全柜中进行；对于孵育，使用连接至低温恒温器(cryostat)的双壁容器，在搅拌下在+17℃±1℃的温度下孵育含有IVIG的液体。然后用有效过滤面积为25cm²的0.2μm深层过滤器对含有IVIG的液体进行过滤，(ZetaVR06、Cuno/3M或同等产品)，该深层过滤器被连接至使用目标压力0.9巴(极限：0.5巴-1.5巴)的加压氮气的Sartorius(SM16249)不锈钢过滤器支架。对于调节，过滤材料预先涂有55l/m²的Hyflo Supercel悬浮液(5.0g±0.05g Hyflo Supercel/L；用3M NaCl将电导率调整为3.5mS/cm(指定范围：2.5mS/cm至6.0mS/cm))(压力≤0.5巴)，然后过滤液体。过滤期间，冷却过滤器支架，使用连接至低温恒温器的双壁容器在≤18℃的目标温度下收集滤液。冷却装有滤液的容器。在过滤器堵塞的情况下，使用新鲜的预处理过滤器继续过滤剩余的液体。过滤后，测量温度(目标：≤18℃)和体积。

测量含IVIG的液体的体积后，在搅拌下用冷(+2℃至+8℃)稀释缓冲液(目标电导率为3.5mS/cm(范围：2.5mS/cm至6.0mS/cm)的NaCl溶液)，将液体调节为28.9AU_280-320/cm(范围：14.5AU_280-320/cm至72.3AU_280-320/cm)的计算目标吸光度。考虑到后来的1:31病毒添加(spike)，这使得在过滤后与S/D试剂一起孵育时的计算目标吸光度值为28AU_280-320/cm(范围：14AU_280-320/cm至70AU_280-320/cm)。

使用连接至低温恒温器的双壁容器，在搅拌下再次将经过滤且经蛋白质调节的包含IVIG的液体调节至+17℃±1℃。在搅拌下保持该温度范围，直至经过滤的含IVIG液体与S/D试剂的孵育结束，连续进行记录。将转移到已确定皮重的螺帽烧瓶中的确定体积的过滤后的含IVIG液体，以1:31的比率添加病毒，例如30mL含IVIG液体中加入1mL病毒储备液。在持续搅拌下于17℃±1℃下进一步孵育加标(spiked)的含IVIG液体。在加标后1分钟至2分钟内，采集病毒滴定样品(0.5mL加标对照(Spike Control，SC)和2mL保持对照(HoldControl，HC))。

吸取后，将保持对照(HC)与添加S/D试剂后的加标工艺材料保存在相同的温度(即+17℃±1℃)下，即，将保持对照(HC)储存在与装有含IVIG液体的容器相同的冷却循环中，直至S/D处理结束。在插入保持对照样品之前，以及在S/D处理之后且取出保持对照进行滴定之前不久，测定冷却液的温度。

测定加标的含IVIG液体的重量，以计算要添加的S/D试剂混合物的量。视需要，在搅拌下将称量的材料重新调节至+17℃±1℃。将相应的S/D试剂混合物添加到含IVIG液体中，得到的相应聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为0.05％。使用注射器在1分钟内在搅拌下添加S/D试剂混合物，通过对注射器进行称重来确定S/D试剂混合物的实际添加量。在持续搅拌下，在+17℃±1℃下继续孵育加标的含IVIG液体与S/D试剂59±1分钟。在孵育过程中，在1分钟至2分钟、10±1分钟、30±1分钟和59±1分钟后，吸取1mL病毒滴定样品。为防止吸取样品后S/D试剂进一步灭活病毒，将样品立即用冷(+2℃至+8℃)细胞培养基以1:20(即1体积样品加19体积细胞培养基)稀释。

为滴定样品，用适当的组织培养基制备样品的0.5log连续稀释液，将100μL每种稀释液添加到接种有相应指示细胞系的微量滴定板的8个孔中的每个孔中。细胞在36.0℃(设定点)下孵育7天，然后在显微镜下通过目测评估细胞病变作用。根据泊松分布计算半数组织培养感染剂量(median tissue culture infectious dose)(TCID₅₀)，表示为log10[TCID₅₀/mL]。

根据下式计算病毒清除能力：

其中，

R＝病毒减少系数

V₁＝起始材料的体积[mL]

T₁＝起始材料中的病毒的浓度[TCID₅₀/mL]

V₂＝病毒灭活后的材料的体积[mL]

T₂＝病毒灭活后的病毒的浓度[TCID₅₀/mL]

使用处理前后各个加标样品的体积和滴度来计算R。当未检测到病毒时，将检测限作为病毒滴度进行计算。

结果

当使用Triton X-100Reduced、PS80和TnBP的混合物或Triton N-101Reduced、PS80和TnBP的混合物进行含IVIG液体的S/D处理时，10分钟内灭活HIV的病毒减少系数(RF)为至少4(图1A)。重复实验中获得类似结果(图1B)。

在其他实验中，当使用Triton X-100Reduced、PS80和TnBP的混合物或Triton N-101Reduced、PS80和TnBP的混合物对含IVIG液体进行S/D处理时，10分钟内灭活PRV约4(图2A)。重复实验中获得类似结果(图2B)。

这些实验表明，用Triton X-100Reduced或Triton N-101Reduced代替Triton X-100对含有生物药物的液体进行S/D处理，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例2：使用BrijC10灭活包含静脉注射免疫球蛋白的液体中的HIV、PRV和BVDV 材料和方法

如以上实施例1所述，进行实验。但是，对于S/D处理，检测包含Brij C10的S/D混合物，并将其与包含Triton X-100的S/D混合物进行比较。如以上实施例1中所述，制备包含Triton X-100的S/D混合物的组合物。如下制备包含Brij C10的S/D混合物的组合物。

将S/D组分聚山梨酯80(PS80，Crillet 4HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)与去污剂Brij C10按以下比率(参见表5)进行组合：

表5：Brij C10 S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		20％(w/v)Brij C10	53.05±0.53
PS80	3.23±0.03
		TnBP	2.93±0.03
所得S/D试剂	59.21

搅拌混合物至少15分钟。室温保存S/D试剂混合物，一年内使用。使用前再次搅拌S/D试剂混合物至少15分钟以确保均匀。

将相应的S/D试剂混合物添加到含IVIG液体中，得到相应聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为0.05％。

此外，还检测了病毒BVDV的灭活：

表6：实验中使用的病毒储备液

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

结果

当使用Brij C10、PS80和TnBP的混合物对含IVIG的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活HIV的病毒减少系数(RF)超过4(图3A)。重复实验中获得类似结果(图3B)。

在其他实验中，当使用Brij C10、PS80和TnBP的混合物对含IVIG的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活PRV的病毒减少系数(RF)为约4(图4A)。重复实验中获得类似结果(图4B)。

在其他实验中，当使用Brij C10、PS80和TnBP的混合物对含IVIG的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)为约5(图5A)。重复实验中获得类似结果(图5B)。

这些实验表明，用Brij C10代替Triton X-100对含生物药物的液体进行S/D处理，即使在低浓度的去污剂下也可有效灭活脂包膜病毒。

实施例3：使用BrijC10灭活包含人血清白蛋白的液体中的X-MuLV和BVDV

检测Brij C10用于S/D处理以灭活含有人血清白蛋白(HSA)作为生物药物模型蛋白的液体中的脂包膜病毒(即异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV))的适合性，并与Triton X-100进行比较。为此，将病毒添加到包含HSA的液体中。然后将包含HSA的含病毒液体与包含低浓度的Brij C10的S/D混合物孵育不同的时间，确定病毒的剩余感染性。Brij C10以低浓度使用，以便能够评估病毒无活性的动力学，即随时间变化的病毒灭活效率(由RF表示)。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，Brij C10可以明显更高的浓度使用，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的RF。

材料

含有HSA的液体

含有人血清白蛋白(HSA)的液体被用作含有生物药物的液体的模型。

病毒

异嗜性小鼠白血病病毒(X-MuLV；逆转录病毒科；包膜的ssRNA病毒；)用作内源性逆转录病毒颗粒和包膜RNA病毒的模型。此外，使用BVDV。

表7：实验中使用的病毒储备液

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, 10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection, 10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

使用前对病毒储备液进行表征。此表征包括：通过至少十次独立的滴定来确定病毒滴度并指定可接受的病毒滴度范围用作阳性对照，确定病毒储备液蛋白含量，PCR检测鉴定病毒以及PCR检测其他病毒和支原体污染，使用不允许大型病毒聚集物通过的过滤器检测病毒聚集。仅使用通过PCR鉴定/污染检测且无明显聚集的病毒储备液(即病毒储备液和过滤储备液之间的感染性滴度之差小于1.0log)。

Brij C10试剂混合物

将S/D组分聚山梨酯80(PS80，Crillet 4HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)与相应去污剂(即Triton X-100或Brij C10)按以下比率(参见表8至表9)进行组合：

表8：Triton X-100S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		Triton X-100	10.5±0.1
PS80	3.2±0.03
		TnBP	2.9±0.03
所得S/D试剂	16.6

表9：Brij C10 S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		20％(w/v)Brij C10	52.5±0.5
PS80	3.2±0.03
		TnBP	2.9±0.03
所得S/D试剂	58.6

搅拌各个混合物至少15分钟。室温保存S/D试剂混合物，一年内使用。使用前将相应S/D试剂混合物再次搅拌至少15分钟以确保均匀。

方法

在不利于病毒灭活的条件(即较短的孵育时间和相对较低的温度)下，评估S/D处理的病毒灭活能力和稳健性。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更长孵育时间和更高温度，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。此外，如上所述，使用低浓度的S/D组分。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更高浓度的S/D组分，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。

由于蛋白质浓度对S/D处理期间的病毒灭活无显著影响(也参见Dichtelmüller等，2009)，未研究有关蛋白质含量的稳健性。

以下所有步骤均在二级生物安全柜中进行。使用连接到低温恒温器的双壁容器在搅拌下于+1℃±1℃的温度下孵育起始材料。然后，用0.2μm PVDF膜针筒式过滤器(亲水性PVDF过滤器、Millipak 60或同等产品)对含有HSA的液体进行过滤。过滤后，测量温度和体积。

使用连接至低温恒温器的双壁容器，在搅拌下再次将过滤的含HSA的液体调节至+1℃±1℃。在搅拌下保持该温度范围，直至经过滤的含HSA液体与S/D试剂的孵育结束，连续进行记录。将转移到已确定皮重的螺帽烧瓶中的确定体积的过滤后的含HSA液体，以1:31的比率加标，例如48mL含HSA液体中加入1.6mL病毒储备液。在持续搅拌下于1℃±1℃下进一步孵育加标的含HSA液体。在加标后1分钟至2分钟内，采集病毒滴定样品(0.5mL加标对照，SC和2mL保持对照，HC)。

吸取后，将保持对照(HC)与添加S/D试剂后的加标的含HSA液体保存在相同的温度(即+1℃±1℃)下，即，将保持对照(HC)储存在与装有含HSA液体的容器相同的冷却循环中，直至S/D处理结束。在插入保持对照样品之前，以及在S/D处理之后且取出保持对照进行滴定之前不久，测定冷却液的温度。

测定加标的含HSA液体的重量，以计算要添加的S/D试剂混合物的量。视需要，在搅拌下将称量的材料重新调节至+1℃±1℃。将相应的S/D试剂混合物添加到含HSA液体中，得到相应聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为0.08％-0.1％。使用注射器在1分钟内在搅拌下添加S/D试剂混合物，通过对注射器进行称重来确定S/D试剂混合物的实际添加量。在持续搅拌下，在+1℃±1℃下继续孵育加标的含HSA液体与S/D试剂59±1分钟。在孵育过程中，在1分钟至2分钟、10±1分钟、30±1分钟和59±1分钟后，吸取1mL病毒滴定样品。为防止吸取样品后S/D试剂进一步灭活病毒，将样品立即用冷(+2℃至+8℃)细胞培养基以1:20(即1体积样品加19体积细胞培养基)稀释。

如以上实施例1所述，滴定样品和计算病毒清除能力。

结果

当使用Brij C10、PS80和TnBP的混合物在1℃±1℃下对含HSA的液体进行S/D处理时，60分钟内灭活X-MuLV的病毒减少系数(RF)超过2(图6A)。重复实验中获得类似结果(图6B)。

在其他实验中，当使用Brij C10、PS80和TnBP的混合物在1℃±1℃下对含HSA的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)为约4(图7A)。重复实验中获得类似结果(图7B)。

完全按照本实施例的“材料和方法”部分所述进行其他实验，只是对含HSA的液体进行的S/D处理在19℃±1℃而不是1℃±1℃下进行。当使用Brij C10、PS80和TnBP(BrijC10)的混合物在19℃±1℃下对含HSA的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活X-MuLV的病毒减少系数(RF)超过3(图8A)。重复实验中获得类似结果(图8B)。

这些实验表明，用Brij C10代替Triton X-100对含生物药物的液体进行S/D处理，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例4：4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物I的合成(方法1)

中间体III的合成：

将苯酚II(170,3g，800mmol)放入装有内部温度计和搅拌棒的3颈2L烧瓶中。将无水CH₂Cl₂(1000mL)加入到烧瓶中，开始搅拌。起始材料溶解后，将溶液冷却至0℃。全部溶解后，在10分钟内加入NEt₃(225mL，1.6mol)。在0℃下在120分钟内将Tf₂O(256g，907mmol)的CH₂Cl₂(180mL)溶液添加至反应混合物中，反应在室温下搅拌过夜。加入饱和NaHCO₃水溶液(400mL)，萃取反应混合物。用水(2×400mL)和盐水(500mL)重复洗涤有机相。然后真空浓缩有机相。将甲苯(300mL)加到残余物中，浓缩粗产物，得到314g黑色原液。将该残余物装到SiO₂塞的顶部，用石油醚/EtOAc(0％至2％)洗脱。浓缩纯馏分得到269.5g(产率：99.6％)的透明无色油。R_f＝0.74(石油醚/EtOAc 5％)。

中间体IV的合成：

将三氟甲磺酸酯III(269g，795mmol)溶于无水且脱气的DMF(1.3L)，依次加入Zn(CN)₂(95.3g，795mmol)和Pd(PPh₃)₄(25g，21.5mmol)。将反应混合物加热至80℃保持3小时，然后在真空下除去DMF。向残余物中加入甲苯(300mL)，浓缩粗产物，得到432g黑色残余物。将该粗产物装到SiO₂塞的顶部，用石油醚/EtOAc(0-10％)洗脱。浓缩纯馏分得到128.1g(产率：74.8％)的澄清无色油状物。R_f＝0.23(石油醚/EtOAc 2％)。

中间体V的合成：

加入溶于MeOH(500mL)的腈IV(127.6g，592.5mmol)、4M NaOH水溶液(750mL)，将混合物进行回流，在此温度(80℃)下保持过夜。将另外的10M NaOH水溶液(150mL)加到温热的混合物中，将溶液进一步加热20小时。冷却至环境温度后，将反应容器的内容物转移至大烧杯中，在冰浴中冷却。在30分钟内添加HCl 4M(1.1L)水溶液，此时如pH纸所示pH呈酸性，白色固体已沉淀。过滤沉淀物，用水(500mL)冲洗。将湿滤饼(wet cake)转移至2L烧瓶中，在真空下干燥3天，得到127.5g(产率：91.9％)的白色粉末。R_f＝0.42(石油醚/EtOAc 2∶1)。

中间体VI的合成：

将羧酸V(127g，542mmol)悬浮在干燥的mTHF(1.2L)中，冷却至-10℃。在60分钟内加入溶于THF中的LiAlH₄溶液(1M，575mL，575mmol)，然后将反应物缓慢升温至环境温度，进一步搅拌过夜。将反应容器的内容物转移至大烧杯中，用冰(15g)小心淬灭过量的氢化物。在20分钟内添加3M HCl水溶液(500mL)，此时如pH纸所示pH呈酸性。将EtOAc(300mL)加到粗混合物中，剧烈搅拌两相。将水相用EtOAc(300mL和500mL)反萃取两次。合并的有机相依次用饱和NaHCO₃水溶液(300mL)、水(300mL)和盐水(500mL)洗涤。然后真空浓缩有机相。向残余物中加入甲苯(300mL)，浓缩粗产物，得到123.3g澄清的淡黄色油。将该残余物装到SiO₂塞的顶部，用石油醚/EtOAc(0％至15％)洗脱。浓缩纯级分，得到85.3g(产率：71.4％)的无定形白色固体。R_f＝0.37(石油醚/EtOAc 4∶1)。

中间体VII的合成：

将苄醇VI(84.8g，385mmol)溶于无水CH₂Cl₂(1L)中，在冰/水浴中冷却。加入NEt₃(110mL，770mmol)，然后在60分钟内缓慢加入MsCl(45mL，577mmol)的无水CH₂Cl₂(25mL)溶液。反应物缓慢升温至环境温度，进一步搅拌过夜。加入饱和NaHCO₃水溶液(420mL)，剧烈搅拌反应混合物。用水(2×500mL)和盐水(300mL)重复洗涤有机相。然后真空浓缩有机相。将甲苯(200mL)和CH₂Cl₂(100mL)添加至残余物中，浓缩粗产物，得到90g(产率：78.4％)发橙色半固体。R_f＝0.71(石油醚/EtOAc 4∶1)。

I的合成：

将PEG400(360g，900mmol)溶解于无水THF(1L)中，在环境温度下历时15分钟分批加入tBuOK(90g，802mmol)，将混合物在环境温度下搅拌60分钟，冰浴冷却。同时，将甲磺酸盐VII(89.5g，300mmol)悬浮在THF(300mL)中，将乳白色溶液在20分钟内添加到冷却的去质子化PEG400溶液中。将反应缓慢加热至环境温度，进一步搅拌过夜。加入冰(500g)以及1MHCl水溶液(820mL)。真空除去THF，加入EtOAc(1L)。搅拌各相，依次用水(2×500mL)洗涤有机相。各个水相用EtOAc(300mL)反萃取。用水(500ml)洗涤合并的有机相，真空浓缩。向残余物中加入甲苯(250mL)，浓缩粗产物，得到125.2g的澄清的淡黄色油。将该残余物装到SiO₂塞的顶部，用CH₂Cl₂/MeOH(0％至8％)洗脱。浓缩纯馏分得到107.5g(产率：59.5％)的浅棕色澄清油。R_f＝0.37-0.22(CH₂Cl₂/MeOH 20:1)。MS(ESI)：m/z＝[M+H]⁺＝573.5,617.5(100％),661.6；[M+Ac]^-＝631.4,675.4(100％),719.5。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.33(d,J＝8.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.3Hz,2H),4.52(s,2H),3.72-3.58(m,33H),2.54(br s,1H),1.72(s,2H),1.34(s,6H),0.70(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝149.7,135.1,127.4(2C),126.2(2C),73.2,72.6,70.7(m),70.5,69.4,61.9,57.0,38.6,32.5,31.9(3C),31.6(2C)。

实施例5a：4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物I的合成(方法2)

在圆底烧瓶中将甲苯(35mL，328mmol)和浓H₂SO₄(10mL)冷却至0℃。在2小时内将甲苯(27mL，256mmol)和二异丁烯的混合物(2,4,4-三甲基-1-戊烯+2,4,4-三甲基-2-戊烯的3:1混合物，10mL，64mmol)缓慢加入反应混合物中。在0℃下进一步搅拌反应物2小时。加入水(100mL)。相分离后，有机相用饱和NaHCO₃水溶液(100mL)洗涤，用MgSO₄干燥并浓缩，得到14g的澄清无色油。将该油置于100mL圆底烧瓶中，在短程蒸馏装置上蒸馏(1×10^-1mbar)。收集在62℃至70℃之间蒸馏的级分(8.1g，收率61.9％)。R_f＝0.65(石油醚40-60 100％)。

将对位取代的甲苯X(500mg，2.45mmol)溶于乙腈(ACN)(5mL)。加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(460mg，2.57mmol)，溶解后，将Duran 25mL圆底烧瓶置于距卤素灯(300W)15cm的位置。辐射60分钟(反应温度＝45℃)后，除去溶剂。加入石油醚40-60(25mL)，沉淀出固体。用水(2×20mL)洗涤液相，用MgSO₄干燥并浓缩，得到540mg(产率：77.9％)的淡黄色原油。R_f＝0.43(石油醚40-60 100％)。

在环境温度下将PEG400(2.25g，5.61mmol)溶解在无水THF(5mL)中。在1分钟内分批加入tBuOK(420mg，3.74mmol)，搅拌混合物90分钟，然后在冰/水浴中冷却至0℃。同时，将苄基溴中间体XI(530mg，1.87mmol)悬浮在THF(2mL)中，将溶液加到冷却的去质子化的PEG400溶液中。将反应物缓慢加热至环境温度，进一步搅拌过夜。将HCl(1M，20mL)以及EtOAc(50mL)和水(20mL)加到反应混合物中。将该溶液转移至分液漏斗中，剧烈萃取。相分离后，有机相依次用水(5×15mL)洗涤，最后用MgSO₄干燥，得到0.8g的油状粗残余物。将该残余物装到SiO₂柱的顶部，用CH₂Cl₂/MeOH(0至8％)洗脱。浓缩纯馏分得到588mg(收率：52.2％)的澄清淡黄色油。R_f＝0.37-0.22(CH₂Cl₂/MeOH 20：1)。

实施例5b：4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物I的合成(方法2的变体)

第1步：

此步骤如下进行：

在圆底烧瓶中将甲苯(750mL，7.04mol)和浓H₂SO₄(20mL，0.375mol)冷却至0℃。在90分钟内，将甲苯(250mL，2.35mol)和二异丁烯(2,4,4-三甲基-1-戊烯+2,4,4-三甲基-2-戊烯的3:1混合物，200mL，1.28mol)的混合物缓慢加到反应混合物中。将反应物在0℃下进一步搅拌，温热至环境温度过夜。加入冰(400g)，将混合物转移至分液漏斗中。相分离后，依次用饱和NaHCO₃水溶液(300mL)和水(2×250mL)洗涤有机相。浓缩有机相，得到199.1g的澄清无色油。将油置于500mL圆底烧瓶中，在短程蒸馏装置上蒸馏(20毫巴)。收集在138℃至161℃之间蒸馏的馏分(134.1g，收率51.4％)。R_f＝0.65(石油醚40-60 100％)。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.28(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(d,J＝8.2Hz,2H),2.34(s,3H),1.75(s,2H),1.38(s,6H),0.75(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝147.3,134.7,128.6(2C),126.1(2C),57.1,38.4,32.5,31.9(3C),31.7(2C),21.0。

或者，可按以下步骤进行此步骤：

在环境温度下，在圆底烧瓶中搅拌甲苯(400mL，3.83mol)和九氟-1-丁磺酸(4mL，24mmol)。在60分钟内将甲苯(200mL，1.92mol)和二异丁烯的混合物(3：1 2,4,4-三甲基-1-戊烯+2,4,4-三甲基-2-戊烯的混合物，100mL，0.64mol)缓慢加到反应混合物中。将反应物在环境温度下进一步搅拌过夜。加入饱和NaHCO₃水溶液(200mL)，搅拌混合物20分钟。将混合物转移至分液漏斗中，弃去水相。依次用水(3×300mL)洗涤有机相。浓缩有机相，得到132.5g的澄清无色油。将该油置于500mL圆底烧瓶中，在短程蒸馏装置上蒸馏(26毫巴至16毫巴)。收集115℃至135℃之间蒸馏的馏分(80.5g，产率62％)。R_f＝0.65(石油醚40-60100％)。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.28(d,J＝8.2Hz,2H),7.10(d,J＝8.2Hz,2H),2.34(s,3H),1.75(s,2H),1.38(s,6H),0.75(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝147.3,134.7,128.6(2C),126.1(2C),57.1,38.4,32.5,31.9(3C),31.7(2C),21.0。

第2步：

此步骤如下进行：

将对位取代的甲苯X(63.6g，311mmol)溶于乙腈(ACN)(650mL)中。加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(58.2g，327mmol)，溶解后，在搅拌(350rpm)下，将Duran2L圆底烧瓶放置在距卤素灯(300W)5cm至25cm处。辐射6小时(反应温度＝最高46℃)后，真空除去溶剂。加入石油醚40-60(450mL)，沉淀出深色固体。浓缩液相，得到深褐色残余物(75g)。将该残余物装到SiO₂塞的顶部，用40-60(100％)汽油醚洗脱。浓缩纯馏分得到43.8g(产率：49.7％)橙色澄清油。R_f＝0.43(石油醚40-60 100％)。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),4.50(s,2H),1.74(s,2H),1.36(s,6H),0.72(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝150.9,134.8,128.6(2C),126.7(2C),57.0,38.7,33.9,32.5,31.9(3C),31.6(2C)。

或者，可按以下步骤进行此步骤：

将对位取代的甲苯X(85.2g，417mmol)溶于三氟甲苯(830mL)。其他溶剂，例如酯或烷烃(EtOAc和己烷)也是有效的。在搅拌(450rpm)同时加入N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)(74.2g，417mmol)以及AIBN(偶氮二异丁腈(3.4g，21mmol))，将混合物加热至80℃，持续5小时。真空除去溶剂，加入石油醚40-60(350mL)，沉淀出白色固体，浓缩液相，得到澄清的橙色残余物(108g)，将该残余物装到SiO₂塞顶部，用40-60汽油醚(100％)洗脱，浓缩纯馏分得到64.1g(收率：54.3％)澄清几乎无色的油状物，结晶形成无色针状物，表明产物纯度高。R_f＝0.43(石油醚40-60 100％)。¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.34(d,J＝8.4Hz,2H),7.30(d,J＝8.4Hz,2H),4.50(s,2H),1.74(s,2H),1.36(s,6H),0.72(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝150.9,134.8,128.6(2C),126.7(2C),57.0,38.7,33.9,32.5,31.9(3C),31.6(2C)。预期使用AIBN(偶氮二异丁腈作为自由基引发剂有助于在该反应步骤中获得的高纯度产物。

第3步：

此步骤如下进行：

在环境温度下将PEG400(184.1g，460mmol)溶解在无水THF(550mL)中。在15分钟内分批加入tBuOK(27.2g，245mmol)，90分钟混合物搅拌。同时，将苄基溴中间体XI(43.5g，153mmol)悬浮在THF(300mL)中，将溶液加到冷却的去质子化的PEG400溶液中。将反应物在环境温度下搅拌过夜。将HCl(1M，270mL)添加至反应混合物。除去挥发物，添加EtOAc(600mL)。将该溶液转移至分液漏斗中，剧烈萃取。相分离后，进一步用EtOAc(300mL)萃取水相。用水/盐水(1:1，3×300mL)依次洗涤合并的有机相，最后浓缩，得到90.4g的粗橙色油状残余物。将该残余物装到SiO₂柱的顶部，用CH₂Cl₂/MeOH(0至8％)洗脱。浓缩纯馏分得到82.2g(产率：89.0％)的透明浅棕色油。R_f＝0.37-0.22(CH₂Cl₂/MeOH 20：1)。MS(ESI)：m/z＝[M+H]⁺＝573.5,617.5(100％),661.6；[M+Ac]^-＝631.4,675.4(100％),719.5.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.33(d,J＝8.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.3Hz,2H),4.52(s,2H),3.72-3.58(m,33H),2.54(br s,1H),1.72(s,2H),1.34(s,6H),0.70(s,9H)。¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝149.7,135.1,127.4(2C),126.2(2C),73.2,72.6,70.7(m),70.5,69.4,61.9,57.0,38.6,32.5,31.9(3C),31.6(2C)。

或者，可按以下步骤进行此步骤：

在环境温度下将PEG400(475g，1.19mol)溶解在TBME(甲基叔丁基醚)(1.0L)中。在20分钟内分批加入tBuOK(43.2g，385mmol)，搅拌混合物90分钟。同时，将苄基溴中间体XI(84g，297mmol)悬浮在TBME(250mL)中，将该溶液在环境温度下添加至去质子化的PEG400溶液中。将反应物在环境温度下搅拌3小时。将冰(200g)和HCl(1M，400mL)加到反应混合物中。将该溶液转移至分液漏斗中，加入EtOAc(1L)和水(500mL)，剧烈萃取。相分离后，依次用水/盐水(1:1，3×500mL)洗涤有机相，最后浓缩，得到165g橙色粗油状残余物。将该残余物装到SiO₂柱的顶部，用CH₂Cl₂/MeOH(0％至10％)洗脱。浓缩纯馏分得到151.7g(产率：84.9％)的透明浅棕色油。R_f＝0.37-0.22(CH₂Cl₂/MeOH 20：1)。MS(ESI)：m/z＝[M+H]⁺＝573.5,617.5(100％),661.6；[M+Ac]^-＝631.4,675.4(100％),719.5.¹H-NMR(600MHz,CDCl₃)：δ＝7.33(d,J＝8.3Hz,2H),7.23(d,J＝8.3Hz,2H),4.52(s,2H),3.72-3.58(m,33H),2.54(br s,1H),1.72(s,2H),1.34(s,6H),0.70(s,9H).¹³C-NMR(150MHz,CDCl₃)：δ＝149.7,135.1,127.4(2C),126.2(2C),73.2,72.6,70.7(m),70.5,69.4,61.9,57.0,38.6,32.5,31.9(3C),31.6(2C)。预期使用TBME(甲基叔丁基醚)作为溶剂、反应时间适中为3小时(预期可将反应副产物减至最少)、生产规模较大和起始材料(即苄基溴中间体XI)纯度较大均有助于该反应步骤中所观察到的高产率。

实施例6：使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物灭活包含静脉注射免疫球蛋白的液体 中的PRV

材料和方法

如以上实施例1所述进行实验。然而，对于S/D处理，检测包含实施例5a中生产的4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的S/D混合物，并将其与包含Triton X-100的S/D混合物进行比较。如以上实施例1中所述制备包含Triton X-100的S/D混合物的组合物。如下制备包含4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的S/D混合物的组合物。

将S/D组分聚山梨酯80(PS80，Crillet 4HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)与实施例5a中生产的去污剂4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物按以下比率(参见表10)进行组合：

表10：4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物(缩写为“4-TOBAPE”)S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		4-TOBAPE	10.61±0.11
PS80	3.23±0.03
		TnBP	2.93±0.03
所得S/D试剂	16.77

将混合物搅拌至少15分钟。室温保存S/D试剂混合物，一年内使用。使用前再次搅拌S/D试剂混合物至少15分钟以确保均匀。

将相应的S/D试剂混合物添加到含IVIG的液体中，以使相应的聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为0.05％w/w。

仅检测病毒PRV的灭活。

结果

当使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、PS80和TnBP的混合物对含IVIG的液体进行S/D处理时，1分钟至2分钟内灭活PRV的病毒减少系数(RF)为约4(图9A)。重复实验中获得类似结果(图9B)。

这些实验表明，用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物代替Triton X-100进行S/D处理含生物药物的液体，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例7：使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物灭活包含人血清白蛋白的液体中的X- MuLV

材料和方法

如以上实施例3所述进行实验。然而，对于S/D处理，检测包含4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的S/D混合物，并将其与包含Triton X-100的S/D混合物进行比较。如以上实施例3中所述制备包含Triton X-100的S/D混合物的组合物。如下制备包含4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的S/D混合物的组合物。

将S/D组分聚山梨酯80(PS80，Crillet 4HP，Tween 80)和磷酸三正丁酯(TnBP)与去污剂4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物按以下比率(参见表11)进行组合：

表11：4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物(缩写为“4-TOBAPE”)S/D试剂混合物的组分的量

S/D试剂	S/D试剂混合物中所添加的量[g]
		4-TOBAPE	10.5±0.1
PS80	3.2±0.03
		TnBP	2.9±0.03
所得S/D试剂	16.6

将混合物搅拌至少15分钟。室温保存S/D试剂混合物，一年内使用。使用前再次搅拌S/D试剂混合物至少15分钟以确保均匀。

将相应的S/D试剂混合物添加到含HSA的液体中，以使相应的聚氧乙烯醚去污剂的最终浓度为0.1％。

仅检测病毒X-MuLV的灭活。

结果

当使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、PS80和TnBP的混合物在1℃±1℃下对含HSA的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活X-MuLV的病毒减少系数(RF)超过2(图10A)。重复实验中获得类似结果(图10B)。

完全按照本示例的“材料和方法”部分所述进行其他实验，只是对含HSA的液体进行S/D处理是在19℃±1℃而不是1℃±1℃下进行的。当使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、PS80和TnBP的混合物在19℃±1℃下对含HSA的液体进行S/D处理时，10分钟内灭活X-MuLV的病毒减少系数(RF)超过2(图11A)，30分钟内灭活X-MuLV的病毒减少系数(RF)为约4。重复实验中获得类似结果(图11B)。

这些实验表明，在室温或约室温及低至1℃±1℃下用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物代替Triton X-100对含生物药物的液体进行S/D处理，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例8：使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、TritonX-100Reduced或BrijC10对含 有HSA的缓冲液进行BVDV灭活

检测4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物、Triton X-100Reduced或Brij C10用于单去污剂处理以灭活缓冲液(含有人血清白蛋白(HSA)作为治疗性抗体的模型蛋白)中的脂包膜病毒(即牛病毒性腹泻病毒(BVDV))的适合性，并与Triton X-100进行比较。为此，将低浓度的相应去污剂添加到含有HSA的缓冲液中，然后将病毒加入混合物中。孵育不同时间后，确定病毒的剩余感染性。为能够评估病毒灭活的动力学，即随时间变化的病毒灭活效率(由RF表示)，使用低浓度的相应去污剂。对本领域技术人员显而易见的是，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，本发明的去污剂可以显著更高的浓度使用，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的RF。

材料

含有HSA的缓冲液

包含人血清白蛋白(HSA)的缓冲液用作治疗性抗体的模型。

病毒

表12：实验中使用的病毒储备液

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

使用前对病毒储备液进行表征。此表征包括：通过至少十次独立的滴定来确定病毒滴度并指定可接受的病毒滴度范围用作阳性对照，确定病毒储备液蛋白含量，PCR检测鉴定病毒以及PCR检测其他病毒和支原体污染，使用不允许大型病毒聚集物通过的过滤器检测病毒聚集。仅使用通过PCR鉴定/污染检测且无明显聚集的病毒储备液(即病毒储备液和过滤储备液之间的感染性滴度之差小于1.0log)。

去污剂

在使用相应去污剂或其1:10稀释液(即1g±2％相应去污剂加9g±2％蒸馏水)之前，搅拌至少15分钟以确保均匀。

方法

在不利于病毒灭活的条件(即较短的孵育时间和相对较低的温度)下，评估单去污剂处理的病毒灭活能力和稳健性。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更长孵育时间和更高温度，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。此外，如上所述，使用低浓度的相应去污剂。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更高浓度的相应去污剂，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。

由于蛋白质浓度对病毒灭活无显著影响(也参见Dichtelmüller等，2009)，因此未研究有关蛋白质含量的稳健性。

以下所有步骤均在二级生物安全柜中进行。使用连接到低温恒温器的双壁容器，在+14℃±1℃的温度下，在搅拌下孵育起始材料。

将含有HSA的缓冲液转移到已确定皮重的螺帽烧瓶中。确定含有HSA的缓冲液的重量(在密闭烧瓶中)，以计算要加入的单去污剂的量。将所需量的去污剂([mg])或其相应量的1:10稀释液添加到含HSA液体/g中，得到以下最终浓度的相应去污剂：0.1％±0.01％(w/w)或0.03％±0.01％(w/w)。使用注射器在1分钟内在搅拌下添加去污剂，通过对注射器进行称重来确定实际添加量。添加完去污剂后，将含有HSA的缓冲液进一步搅拌至少10分钟。用0.2μm Supor注射器膜过滤器(或同等产品)对含有与去污剂混合的HSA的缓冲液进行过滤，使用与低温恒温器相连的双壁容器在14℃±1℃的目标温度下收集滤液。冷却装有滤液的容器。在过滤器堵塞的情况下，使用新鲜的过滤器继续过滤含有HSA的缓冲液。过滤后，测量温度(目标：14℃±1℃)和体积。

使用连接至低温恒温器的双壁容器，在搅拌下将含有HSA和相应去污剂的过滤缓冲液调节至14℃±1℃。在搅拌下保持该温度范围，直至经过滤的含HSA液体与去污剂的孵育结束，连续进行记录。将测定体积的含有HSA和去污剂的缓冲液以1:31的比率加标，例如在含HSA的48mL缓冲液中加入1.6ml病毒储备液。在持续搅拌下，将含有HSA的加标缓冲液在14℃±1℃下继续孵育59±1分钟。在孵育过程中，在1分钟至2分钟、5±1分钟、29±1分钟和59±1分钟时，吸取病毒滴定样品。为防止抽取样品后去污剂进一步灭活病毒，将样品立即用相应的冷(+2℃至+8℃)细胞培养基以1:20比率(即1体积样品加19体积细胞培养基)稀释。

加标对照和保持对照在同一天进行：如上所述过滤含HSA的缓冲液，无需事先添加去污剂。然后如上所述在搅拌下将滤液调节至14℃±1℃。如上所述，将含有HSA的缓冲液以1:31的比率加标，然后在14℃±1℃下进一步孵育59±1分钟。加标后1分钟至2分钟内，采集病毒滴定样品(加标对照)。孵育59±1分钟后，采集病毒滴定样品(即保持对照样品)(HC)。

如以上实施例1所述滴定样品和计算病毒清除能力。

结果

使用0.1％±0.01％的Triton X-100、Brij C10、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced剂在14℃±1℃下对含有HSA的缓冲液进行单去污剂处理时，5分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)为约5(图12A)。当在14℃±1℃下使用0.03％±0.01％的Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含有HSA的缓冲液进行单去污剂处理时，5分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)超过3，29分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)超过4(图12B)。

这些实验表明，使用Triton X-100，Brij C10、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含有生物药物的液体进行单去污剂处理，即使在低浓度下也能有效灭活脂包膜病毒去污剂。

实施例9：使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced灭活含IVIG的 液体中的BVDV

检测4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced用于单去污剂处理以灭活含有静脉注射免疫球蛋白(IVIG)的液体中的脂包膜病毒(即牛病毒性腹泻病毒(BVDV))的适合性，并与Triton X-100进行比较。为此，将病毒添加到包含IVIG的液体中。然后将包含IVIG的含病毒液体与低浓度的Triton X-100Reduced、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100一起孵育不同时间，确定病毒的剩余感染性。以低浓度使用Triton X-100Reduced、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物和Triton X-100，以评估病毒灭活的动力学，即随时间变化的病毒灭活效率(由RF表示)。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，包含Triton X-100Reduced或4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的本发明去污剂可以明显更高的浓度使用，这将加速病毒灭活的动力学，还有望提高所实现的LRV。

材料

包含IVIG的液体

将包含IVIG的液体(含IVIG的液体)在干冰上冷冻，保存在≤-60℃下直至收集之日起一年内使用。

病毒

表13：实验中使用的病毒储备液

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

使用前对病毒储备液进行表征。此表征包括：通过至少十次独立的滴定来确定病毒滴度并指定可接受的病毒滴度范围用作阳性对照，确定病毒储备液蛋白含量，PCR检测鉴定病毒以及PCR检测其他病毒和支原体污染，使用不允许大型病毒聚集物通过的过滤器检测病毒聚集。仅使用通过PCR鉴定/污染检测且无明显聚集的病毒储备液(即病毒储备液和过滤储备液之间的感染性滴度之差小于1.0log)。

去污剂

在使用相应去污剂或其1:10稀释液(即1g±2％相应去污剂加9g±2％蒸馏水)之前，搅拌至少15分钟以确保均匀。

方法

在不利于病毒灭活的条件(即较短的孵育时间和相对较低的温度)下，评估单去污剂处理的病毒灭活能力和稳健性。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更长孵育时间和更高温度，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。此外，如上所述，使用低浓度的相应去污剂。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更高浓度的相应去污剂，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。

由于蛋白质浓度对病毒灭活无显著影响(也参见Dichtelmüller等，2009)，因此未研究有关蛋白质含量的稳健性。

将含有IVIG的液体解冻，所有其他步骤均在二级生物安全柜中进行。对于孵育，使用连接至低温恒温器的双壁容器在搅拌下于+17℃±1℃的温度下对含有IVIG的液体进行孵育。然后，用有效过滤面积为25cm²的0.2μm深层过滤器(Cuno VR06或同等产品)对含IVIG的液体进行过滤，该深层过滤器被连接至使用目标压力0.9巴(极限：0.5巴-1.5巴)的加压氮气的Sartorius(SM16249)不锈钢过滤器支架。为进行调理，过滤材料预先涂有55L/m²的Hyflo Supercel悬浮液(5.0g±0.05g Hyflo Supercel/L；用3M NaCl将导电率调节为3.5mS/cm(指定范围：2.5-6.0mS/cm))(压力≤0.5巴)，然后过滤液体。在过滤过程中，冷却过滤器支架，使用与低温恒温器连接的双壁容器在+17℃±1℃的目标温度下收集滤液。冷却装有滤液的容器。在过滤器堵塞的情况下，使用新鲜的预处理过滤器继续过滤剩余的液体。过滤后，测量体积。

测量含IVIG的液体的体积后，在搅拌下用冷(+2℃至+8℃)稀释缓冲液(目标电导率为3.5mS/cm(范围：2.5mS/cm至6.0mS/cm的NaCl溶液))，将液体调节为28.9AU_280-320/cm(范围：14.5-72.3AU_280-320/cm)的计算目标吸光度。考虑到后来的1:31病毒添加，这使得在过滤后与去污剂一起孵育时的计算目标吸光度值为28AU_280-320/cm(范围：14-70AU_280-320/cm)。

使用连接至低温恒温器的双壁容器，在搅拌下再次将经过滤且经蛋白质调节的含IVIG的液体调节至+17℃±1℃。在搅拌下保持该温度范围，直至经过滤的含IVIG液体与去污剂的孵育结束，连续进行记录。将转移到已确定皮重的螺帽烧瓶中的确定体积的过滤后的含IVIG液体，以1:31的比率添加病毒，例如30mL含IVIG液体中加入1mL病毒储备液。在持续搅拌下于17℃±1℃下进一步孵育加标的含IVIG液体。在加标后1分钟至2分钟内，采集病毒滴定样品(加标对照，SC和保持对照，HC)。

吸取后，将保持对照(HC)与添加去污剂后的加标的含IVIG液体保存在相同的温度(即+17℃±1℃)下，即，将保持对照(HC)储存在与装有含IVIG液体的容器相同的冷却循环中，直至去污剂处理结束。在插入保持对照样品之前，以及在去污剂处理之后取出保持对照进行滴定之前不久，测定冷却液的温度。

测定加标的含IVIG液体的重量，以计算要添加的去污剂的量。视需要，在搅拌下将称量的材料重新调节至+17℃±1℃。将所需量的去污剂([mg])或其相应量的1:10稀释液添加到含IVIG液体/g中，得到以下最终浓度的相应去污剂：0.1％±0.01％(w/w)或0.03％±0.01％(w/w)。使用注射器在1分钟内在搅拌下添加去污剂，通过对注射器进行称重来确定去污剂的实际添加量。在持续搅拌下，在+17℃±1℃下继续孵育加标的含IVIG液体与相应去污剂59±1分钟。在孵育过程中，在1分钟至2分钟、10±1分钟、30±1分钟和59±1分钟后，吸取1mL病毒滴定样品。为防止吸取样品后S/D试剂进一步灭活病毒，将样品立即用冷(+2℃至+8℃)细胞培养基以1:20(即1体积样品加19体积细胞培养基)稀释样品。

如以上实施例1所述，滴定样品和计算病毒清除能力。

结果

当在17℃±1℃下使用0.1％±0.01％的Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含有IVIG的液体进行单去污剂处理时，10分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)为约5(图13A)。当在17℃±1℃下使用0.03％±0.01％的Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含IVIG的液体进行单去污剂处理时，10分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)超过3，30分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)超过4(图13B)。

这些实验证实，使用Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含生物药物的液体进行单去污剂处理，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例10：使用4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced灭活含FVIII 的液体中的BVDV

检测4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced用于单去污剂处理以灭活含有血浆来源因子VIII(pdFVIII)的液体中的脂包膜病毒(即牛病毒性腹泻病毒(BVDV))的适合性，并与Triton X-100进行比较。为此，将病毒添加到包含pdFVIII的液体中。然后将包含pdFVIII的含病毒液体与低浓度的Triton X-100Reduced、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100一起孵育不同时间，确定病毒的剩余感染性。以低浓度使用Triton X-100Reduced、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物和Triton X-100，以评估病毒灭活的动力学，即随时间变化的病毒灭活效率(由RF表示)。如本领域技术人员将清楚，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，包含Triton X-100Reduced或4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物的本发明去污剂可以明显更高的浓度使用，这将加速病毒灭活的动力学，还有望提高所实现的LRV。

材料

包含pdFVIII的液体

将包含pdFVIII的液体(含pdFVIII的液体)在干冰上冷冻，保存在≤-60℃下直至收集之日起一年内使用。

病毒

表14：实验中使用的病毒储备液

¹ATCC：美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection,10801University Boulevard,Manassas,VA 20110USA)

使用前对病毒储备液进行表征。此表征包括：通过至少十次独立的滴定来确定病毒滴度并指定可接受的病毒滴度范围用作阳性对照，确定病毒储备液蛋白含量，PCR检测鉴定病毒以及PCR检测其他病毒和支原体污染，使用不允许大型病毒聚集物通过的过滤器检测病毒聚集。仅使用通过PCR鉴定/污染检测且无明显聚集的病毒储备液(即病毒储备液和过滤储备液之间的感染性滴度之差小于1.0log)。

去污剂

在使用相应去污剂或其1:10稀释液(即1g±2％相应去污剂加9g±2％蒸馏水)之前，搅拌至少15分钟以确保均匀。

方法

在不利于病毒灭活的条件(即较短的孵育时间)下，评估病毒灭活能力和单去污剂处理的稳健性。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更长的孵育时间，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。此外，如上所述，使用低浓度的相应去污剂。如本领域技术人员将清楚的，在商业生产过程(例如生物制药生产)中，可使用更高浓度的相应去污剂，这将加速病毒灭活的动力学且还可提高所实现的LRV。

由于蛋白质浓度对病毒灭活无显著影响(也参见Dichtelmüller等，2009)，因此未研究有关蛋白质含量的稳健性。

解冻含有pdFVIII的液体，所有其他步骤均在二级生物安全柜中进行。为除去可能存在的大量聚集体，用0.45μm膜滤器(例如Sartorius SartoScale Sartobran或同等产品)对含pdFVIII的液体进行过滤。将含有pdFVIII的液体转移至已确定皮重的螺帽烧瓶中，使用连接至低温恒温器的双壁容器，在搅拌下，将其调节至+23℃±1℃的目标温度。将确定体积的含pdFVIII液体以1:31的比率加标，例如将1.6mL病毒储备液48mL加入含pdFVIII液体中。随后，分别采集用于病毒滴定的样品(加标对照，SC)和用于保持对照的样品(HC)。

将保持对照与添加去污剂后的加标的含pdFVIII液体保存在相同的温度(即+23℃±1℃)下，即，将保持对照(HC)储存在与装有含pdFVIII液体的容器相同的冷却循环中，直至去污剂处理结束。在插入保持对照样品之前，以及在去污剂处理之后取出保持对照进行滴定之前不久，测定冷却液的温度。

测定加标的含pdFVIII的液体的重量，以计算要加入的去污剂的量。使用连接到低温恒温器的双壁容器，在搅拌下，将称量的材料调节至+23℃±1℃。在搅拌下保持该温度范围，直至加标的含pdFVIII的液体与去污剂的孵育结束，连续进行记录。将所需量的去污剂([mg])或其相应量的1:10稀释液添加到含pdFVIII液体/g中，以使最终去污剂浓度为0.1％±0.01％(w/w)。使用注射器在1分钟内在搅拌下添加去污剂，通过对注射器进行称重来确定去污剂的实际添加量。完成去污剂的添加后，在+23℃±1℃下在继续搅拌下进一步孵育加标的含pdFVIII的液体59±1分钟。在孵育过程中，在1分钟至2分钟、5±1分钟、30±1分钟和59±1分钟后，吸取1mL病毒滴定样品。为防止吸取样品后去污剂进一步灭活病毒，将样品立即用相应的冷(+2至+8℃)细胞培养基以1:20(即1体积样品加19体积细胞培养基)稀释样品。

如以上实施例1所描述地，滴定样品并计算病毒清除能力。

结果

当在23℃±1℃下使用0.1％±0.01％的Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含pdFVIII的液体进行单去污剂处理时，5分钟内灭活BVDV的病毒减少系数(RF)为约5(图14)。

这些实验证实，使用Triton X-100、4-叔辛基苄醇聚乙氧基化物或Triton X-100Reduced对含生物药物的液体进行单去污剂处理，即使在低浓度的去污剂下也能有效灭活脂包膜病毒。

实施例11：毒理学检测

基于计算机模拟数据，未发现本发明的去污剂具有作为内分泌干扰物的活性的任何证据。

工业适用性：

本发明的方法、过程和产品具有商业用途，例如用于工业生产过程中的环境相容性的脂包膜病毒灭活。例如，本发明可用于生物药品的工业生产。因此，本发明具有工业适用性。

参考文献：

Dichtelmüller et al.(2009):Robustness of solvent/detergent treatmentof plasma derivatives:a data collection from Plasma Protein TherapeuticsAssociation member companies.Transfusion 49(9):1931-1943.

Di Serio et al.(2005):Comparison of Different Reactor Types Used inthe Manufacture of Ethoxylated,Propoxylated Products.Ind.Eng.Chem.Res.44(25):9482-9489.

ECHA Support document for for identification of 4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol,ethoxylated as substances of very high concernbecause,due to their degradation to a substance of very high concern(4-(1,1,3,3-tetramethylbutyl)phenol)with endocrine disrupting properties,they causeprobable serious effects to the environment which give rise to an equivalentlevel of concern to those of CMRs and PBTs/vPvBs,adopted on 12December 2012

Brochure“Global Assessment of the Sate-of-the-Science of EndocrineDisruptors”(WHO/PCS/EDC/02.2),published by the International Programme onChemical Safety of the World Health Organisation

Simons et al.(1973):Solubilization of the membrane proteins fromSemliki Forest virus with Triton X100.J Mol Biol.80(1):119-133.

US patent no.1,970,578

Vogel‘s Textbook of Practical Organic Chemistry((5th Edition,1989,A.I.Vogel,A.R.Tatchell,B.S.Furnis,A.J.Hannaford,P.W.G.Smith)

Bioorganic&Medicinal Chemistry,16(9),4883-4907；2008:Effects ofmodifications of the linker in a series of phenylpropanoic acid derivatives:Synthesis,evaluation as PPARα/γdual agonists,and X-ray crystallographicstudies；Casimiro-Garcia,Agustin；Bigge,Christopher F.；Davis,Jo Ann；Padalino,Teresa；Pulaski,James；Ohren,Jeffrey F.；McConnell,Patrick；Kane,Christopher D.；Royer,Lori J.；Stevens,Kimberly A.；Auerbach,Bruce J.；Collard,Wendy T.；McGregor,Christine；Fakhoury,Stephen A.；Schaum,Robert P.；Zhou,Hairong.

DOI:10.1016/j.bmc.2008.03.

Chemistry-A European Journal,23(60),15133-15142；2017:Solid PhaseStepwise Synthesis of Polyethylene Glycols；Khanal,Ashok；Fang,Shiyue.DOI:10.1002/chem.201703004

Journal of Medicinal Chemistry,48(10),3586-3604；2005:Synthesis andStructure-Activity Relationships of Novel Selective Factor Xa Inhibitors witha Tetrahydroisoquinoline Ring；Ueno,Hiroshi；Yokota,Katsuyuki；Hoshi,Jun-Ichi；Yasue,Katsutaka；Hayashi,Mikio；Hase,Yasunori；Uchida,Itsuo；Aisaka,Kazuo；Katoh,Susumu；Cho,Hidetsura.DOI:10.1021/jm058160e

Journal of Nanoparticle Research,15(11),2025/1-2025/12,12 pp.；2013:Magnetic nanoparticles conjugated to chiral imidazolidinone as recoverablecatalyst；Mondini,Sara；Puglisi,Alessandra；Benaglia,Maurizio；Ramella,Daniela；Drago,Carmelo；Ferretti,Anna M.；Ponti,Alessandro.DOI:10.1007/s11051-013-2025-3

Journal of Organic Chemistry,79(1),223-229；2014:A Scalable ProcedureforLight-Induced Benzylic Brominations in Continuous Flow；Cantillo,David；deFrutos,Oscar；Rincon,Juan A.；Mateos,Carlos；Kappe,C.Oliver.DOI:10.1021/jo402409k

Journal of Physical Chemistry B,107(31),7896-7902；2003:Anellatedhemicyanine dyes with large symmetrical solvatochromism of absorption andfluorescence；Huebener,Gerd；Lambacher,Armin；Fromherz,Peter.DOI:10.1021/jp0345809

PCT Int.Appl.,2005016240,24 Feb 2005:Preparation of aryl carbamateoligomers for hydrolyzable prodrugs and prodrugs comprising same；Ekwuribe,Nnochiri N.；Odenbaugh,Amy L.WO 2004-US15004,May 6,2004

Russian Journal of Applied Chemistry,82(6),1029-1032；2009:Relativeactivity of alkenyl-gem-dichlorocyclopropanes in the reactions ofhydrogenation and alkylation；Brusentsova,E.A.；Zlotskii,S.S.；Kutepov,B.I.；Khazipova,A.N.DOI:10.1134/S1070427209060196

Russian Journal of Organic Chemistry,51(11),1545-1550；2015:Alkylationof aromatic compounds with 1-bromoadamantane in the presence of metal complexcatalysts；Khusnutdinov,R.I.；Shchadneva,N.A.；Khisamova,L.F.