阅读说明：本技术 Rna序列调整 (RNA sequence modulation ) 是由 斯蒂芬·海因茨 蒂尔蔓·鲁斯 多米尼克·瓦伦霍斯特 马库斯·康策尔曼 于 2018-11-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及改变RNA在色谱柱上的保留时间的方法。本发明还涉及从至少两个RNA种类的混合物中纯化RNA的方法。此外,本发明涉及从至少两个RNA种类的混合物中共纯化至少两个RNA种类的方法。特别地,本发明提供了用于协调至少两个RNA种类中A和/或U核苷酸的数目的方法。本发明还涉及可通过所述方法获得的RNA、包含所述RNA的组合物、或包含所述RNA的疫苗、以及制备这种RNA和组合物的方法。此外,本发明涉及试剂盒,特别是试剂盒套装,其包含RNA、组合物或疫苗。本发明还涉及治疗或预防病症或疾病的方法,RNA、组合物和疫苗的第一药用和第二药用。此外,本发明涉及提供调整的RNA序列或调整的RNA混合物的方法。(The present invention relates to methods for altering the retention time of RNA on a chromatography column. The invention also relates to a method for purifying RNA from a mixture of at least two RNA species. Furthermore, the present invention relates to a method for co-purifying at least two RNA species from a mixture of at least two RNA species. In particular, the invention provides methods for coordinating the number of a and/or U nucleotides in at least two RNA species. The invention also relates to RNAs obtainable by said method, compositions comprising said RNAs, or vaccines comprising said RNAs, and methods of making such RNAs and compositions. Furthermore, the present invention relates to a kit, in particular a kit of parts, comprising an RNA, a composition or a vaccine. The invention also relates to methods of treating or preventing a disorder or disease, first and second pharmaceutical uses of the RNA, compositions, and vaccines. Furthermore, the present invention relates to methods of providing a modified RNA sequence or a modified RNA mixture.)

RNA序列调整

引言

本发明涉及改变RNA在色谱柱上的保留时间的方法。本发明还涉及从至少两个RNA种类的混合物中纯化RNA的方法。此外，本发明涉及从至少两个RNA种类的混合物中共纯化至少两个RNA种类的方法。特别地，本发明提供了一种用于协调至少两个RNA种类中的A和/或U核苷酸的数目的方法。本发明还涉及通过所述方法可获得的RNA，包含所述RNA的组合物或包含所述RNA的疫苗以及用于产生这种RNA和组合物的方法。此外，本发明涉及试剂盒，特别是试剂盒套装，其包含RNA、组合物或疫苗。本发明还涉及一种治疗或预防病症或疾病的方法，RNA、组合物和疫苗的第一药用和第二药用。此外，本发明涉及提供调整的RNA序列或调整的RNA混合物的方法。

基于核糖核酸(RNA)的疗法可用于免疫疗法、基因疗法和基因疫苗接种。它们可以为多种疾病的治疗提供高度特异性和个性化的治疗选择。

对于某些医学治疗和应用，期望施用包含不同RNA分子种类的RNA混合物。基于RNA混合物的此类治疗的实例包括施用提供针对病原体的几种血清型(例如，来自甲型和乙型流感病毒的多种血清型的血凝素(HA))的保护的多价RNA混合物；施用提供一种病原体的不同抗原(例如流感的不同抗原，例如HA、核蛋白(NP)、神经氨酸酶(NA)等)的RNA混合物；施用提供针对癌症抗原的几种同种型或变体的保护(例如前列腺癌中的前列腺特异性抗原(PSA))的RNA混合物；施用提供抗原的不同表位的RNA混合物；施用含有癌症特异性和/或患者特异性癌症抗原(表达的抗原或突变的抗原)的RNA混合物；施用编码各种抗体(例如，靶向一种或多于一种蛋白质的不同表位的抗体)的RNA混合物，或任何其他具有治疗活性的RNA混合物(例如，编码用于分子疗法的酶的不同同工型，编码用于治疗其中必须补充几种蛋白质的适应症的不同治疗性蛋白质)。

通过建立经监管机构批准的RNA制造方法，实现了基于RNA的治疗领域的重要一步，如WO2016/180430A1中所述，对DNA水平和RNA水平实施了各种质量控制。所述方法的关键要素是经由RP-HPLC的RNA产物的制备性纯化(如WO 2008/077592A1中所述)。

然而，到目前为止，RNA制备方法仅适合一次制备一种单一的特定RNA分子，例如编码一种特异性治疗靶标的RNA分子。每个RNA分子种类都必须用单独的制备方法制备。为了制备包含不同RNA分子种类的RNA混合物，必须进行单独的制备过程，并且必须将单独生产制备的RNA分子种类混合以产生RNA混合物。因此，常规制备包含几种RNA分子种类(例如，编码不同抗原，例如流感病毒抗原的RNA)的RNA混合物(例如多价疫苗)是费力、昂贵且耗时的，因为需要多次运行DNA模板产生、RNA产生和RNA产物的HPLC纯化。除了经济原因外，特别是在大流行情况下，加速RNA混合物(例如多价RNA疫苗)的制备可能是非常有利的，并且对公共卫生至关重要。因此，理想的是同时制备和纯化RNA混合物，理想的是只用一个制备和纯化方法。

RNA混合物的同时制备、纯化和分析对于多价/多功能疫苗，特别是多价/多功能流感RNA疫苗的制造特别重要。有利的是，这种多价/多功能流感RNA疫苗的制备应允许快速交换(一种或多于一种)抗原(例如，疫苗的季节性调整；大流行情况)，而无需改变关键制备方法的条件(例如，纯化、分析等)。

最近，如WO20171090134中所述，已经开发了在一种制备过程中同时制备不同RNA分子种类的程序，旨在经济化和加速制备基于RNA混合物的治疗剂。

同时制备不同的RNA分子种类，例如WO20171090134中所描述的，将节省基于RNA混合物的治疗剂的制备中的时间、人工成本、生产成本和生产能力(例如空间、设备)。然而，存在与使用RP-HPLC来同时制备纯化所获得的RNA混合物(在本文中也称为“共纯化”)有关的严重问题。RNA混合物中的不同RNA分子种类通常在不同的时间点洗脱(由于HPLC中保留时间不同)，这使得在大多数情况下通过HPLC进行共纯化在技术上是不可能的(如图1A和图1B所示)。例如，仅在以下情况下才可以通过HPLC进行共纯化，其中RNA混合物中包含的所有不同RNA分子种类在基本上相同的时间点洗脱，使得不同RNA产物峰重叠，从而有助于分离纯净的全长RNA产物混合物(峰部分)以及与杂质分离(如图1C和图1D所示)。

因此，用本领域已知的现有方法纯化RNA混合物，例如包含多个RNA种类的基于RNA的治疗剂(例如，多价RNA疫苗)是不可行的。特别地，在RNA混合物中共纯化单个RNA种类是不可行的。然而，例如在开发能够适应抗原组成的季节性变化的多价/多功能流感RNA疫苗平台的背景下，这样的共纯化是非常需要的。在这种情况下，需要快速交换抗原(例如流感血凝素(HA)和/或神经氨酸酶(NA))。由于编码不同抗原的不同种类的RNA分子通常会在不同的时间点洗脱，因此本领域中可用的方法不允许从RNA混合物中共纯化不同的RNA种类，特别是通过HPLC。

出于相似的原因，当使用现有技术时，同时进行基于RNA混合物或(多价)疫苗的HPLC质量控制(以一种制备方法制备或单独制备并混合)也是不可行的。为了分析包含RNA混合物的治疗剂，需要根据存在、完整性、比率和数量(质量控制参数)表征药物产品的不同组分(即不同的RNA分子种类)。这样的质量控制可以在RNA混合物的制备过程期间或之后进行，和/或作为间歇释放质量控制。但是，如上所述，RNA混合物中不同种类的RNA分子通常会在不同的时间点洗脱，这严重阻碍了通过HPLC同时评估单个RNA分子种类/或整个RNA混合物的质量/完整性(“共分析”)(如图1A和图1B所示)。仅在可以清楚地区分每个RNA分子种类的峰面积(同时确定每个RNA分子种类的RNA质量；见图1E)的情况下和/或在RNA混合物中不同的RNA种类在基本上相同的时间点洗脱，从而使得基本完全覆盖HPLC峰(确定整个RNA混合物的RNA质量；请参见图1C和图1D)的情况下，才有可能通过HPLC可靠地确定RNA混合物的完整性。

因此，用本领域提供的现有方法分析RNA混合物，例如包含多个RNA种类的RNA治疗剂(例如，多价流感RNA疫苗)也是不可行的。特别地，不可能对RNA混合物中的RNA种类进行共分析。例如，共分析，如通过HPLC进行的共分析不适用于需要快速交换抗原的多价RNA疫苗平台(例如季节性疫苗，例如流感疫苗)，因为不同种类的RNA分子各自编码不同的抗原(例如流感HA和/或NA)在不同的时间点洗脱，通常导致HPLC峰部分重叠。

总之，上述技术难题严重阻碍了RNA混合物的(共)纯化和(共)分析。特别是，代表一般RNA纯化和分析、特别是GMP级RNA纯化和分析关键要素的RP-HPLC，不能用于RNA混合物中单个RNA种类的(共)纯化和(共)分析。此外，必须解决所描述的问题以促进开发用于制备可快速调节的RNA疫苗例如RNA流感疫苗的多价/多功能RNA制备方法。

综上所述，仍然需要满足能够对RNA混合物进行纯化和/或分析的系统的需求。

因此，本发明的目的是提供一种用于纯化和/或分析RNA，特别是RNA混合物的系统。本发明的另一个优选目的是提供一种用于(共)纯化和/或(共)分析包含多个RNA种类的RNA混合物中的各个RNA种类的系统。

通过所要求保护的主题解决了该问题。