一种体外合成siRNA的纯化方法
阅读说明：本技术 一种体外合成siRNA的纯化方法 (Purification method for in vitro synthesis of siRNA ) 是由 李萍 唐雪明 李学文 于 2021-10-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种体外合成siRNA的纯化方法。本发明的纯化方法具体指体外转录合成siRNA后进行纯化,得到高纯度的siRNA。具体操作流程：将带有T7启动子的DNA模板体外转录合成siRNA；DNaseI降解DNA模板,S1核酸酶降解单链DNA和RNA；磁珠纯化富集siRNA；核酸吸附柱进一步去除小于20nt的核酸、碱基,以得到纯度很高的siRNA。这种制备方式快捷、便宜,且产物的纯度比市场销售的siRNA体外转录试剂盒要高很多,避免了市售体外转录试剂盒得到的产物中有过多杂质,而使实验结果非常不稳定。极大的提高了体外转录制备siRNA的质量,提高实验效率,减少假阴性的实验结果,具有非常高的推广价值。(The invention discloses a purification method for in vitro synthesis of siRNA. The purification method of the invention specifically refers to that after siRNA is synthesized by in vitro transcription, the siRNA is purified to obtain high-purity siRNA. The specific operation flow is as follows: in vitro transcribing the DNA template with the T7 promoter to synthesize siRNA; DNaseI degrades a DNA template, and S1 nuclease degrades single-stranded DNA and RNA; purifying and enriching siRNA by magnetic beads; the nucleic acid adsorption column further removes nucleic acid and base less than 20nt to obtain siRNA with high purity. The preparation method is quick and cheap, the purity of the product is much higher than that of the siRNA in-vitro transcription kit sold in the market, and the phenomenon that the product obtained by the in-vitro transcription kit sold in the market contains too many impurities, so that the experimental result is very unstable is avoided. Greatly improves the quality of siRNA preparation by in vitro transcription, improves the experimental efficiency, reduces the experimental result of false negative, and has very high popularization value.)
技术领域
本发明涉及siRNA制备技术领域，尤其涉及一种体外合成siRNA的纯化方法。
背景技术
siRNA技术是上个世纪在植物中发现的。由于它可以作为一种简单、有效的代替基因敲除的遗传工具，近年来对哺乳动物的研究越来越多。它在生物基因组中特定基因功能的研究、封闭和阻断病原体基因表达等方面，取得了重要进展，显示出良好的应用前景。siRNA技术将在治疗肿瘤、肝炎、遗传性疾病等多种无法治愈的疾病中带来希望，也是目前新药开发的热门。
全球首款非病毒载体给药的siRNA药物patisiran由Alnylam公司研发，是一种特异性沉默hATTR表达的药物。hATTR是人体转甲状腺素蛋白(transthyretin，TTR)淀粉样蛋白沉积引起的，是一种罕见且难以治愈的遗传病。Patisiran与脂质体形成复合物，通过静脉注射给药，沉默人体内hAATR mRNA的表达，减少转甲状腺素蛋白的产生。迄今，Alnylam公司还研发了siRNA药物Givosiran、Iumasiran、Inclisiran。
圣诺制药的在研药物STP705就是一种siRNA疗法药物。它由两种siRNA组成，分别以TGF-β1和COX-2的mRNA为靶向，并通过组氨酸-赖氨酸多肽共聚物(HKP)混合成纳米颗粒制剂。每一个siRNA可以抑制其靶标mRNA的表达，两种siRNA的联合使用，具备减少促纤维化和促炎反应的协同作用。该公司临床前研究表明，药物STP705还有肿瘤抑制的效果。
目前siRNA制备方法有以下几种：1)化学合成法。该方法由核酸合成仪制备得到，适用于短期体外实验研究，可进行化学修饰，如硫代、2-OMe、2-F’等。因为化学合成价格成本较高，一条2OD的21bp siRNA售价约600元，如果添加化学修饰，则价格更高，不适用于长期研究；2)质粒载体合成法。该方法将siRNA序列构建到T7或U6启动子的质粒中，质粒转入细胞，在可在细胞内持续产生siRNA，适用于长期研究。该方法价格较贵，构建过程相对复杂，只适用于体外研究；3)病毒载体合成法。该方法用腺病毒载体或逆转录病毒载体整合siRNA，可进行体内实验。该方法构建过程复杂，成功率相对较低，而且具有安全隐患；4)体外转录法。该方法从带T7启动子的DNA单链开始，四种NTP为底物，退火成两条双链DNA作模板，再添加T7酶转录该模板，得到siRNA。市面上现有的体外转录试剂盒中，通常会将获得的产物再做一步纯化，比如磁珠纯化，表示能得到较高纯度的siRNA。该方法价格低廉，且时间短，可以在短时间内制备，适合体内体外实验。通过AKTA设备分析，该方法的不足之处是虽然能得到目标siRNA，但产物纯度仍需进一步提高，由于该方法容易产生较多的杂质，如错配的短核酸、碱基，使得产物并不适合做更高要求医药级水平的研究和应用。到目前为止，获得高纯度的siRNA的快速、高效、稳定的方法依然是核酸生物医药领域研发的重点之一。
发明内容
为了解决现有体外转录法或者市售试剂盒制备的siRNA纯度不高，影响后续实验结果的问题，本发明提供了一种全新的体外转录合成后进行纯化的方法，旨在获取高纯度siRNA的产物。
本发明的第一个目的是提供一种体外合成siRNA的纯化方法，包括如下步骤：
S1、将含目的基因的DNA单链通过体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物；
S2、采用DNaseI和S1核酸酶对所述的体外转录产物进行消化处理，得到消化产物；
S3、向所述的消化产物中加入磁珠进行目的siRNA富集处理，得到富集产物；
S4、采用核酸吸附柱对所述的富集产物进行纯化，得到纯化的siRNA；
其中，所述的核酸吸附柱中填充至少4层，孔径为8～12nm的核酸吸附膜。
进一步地，所述的核酸吸附膜为玻璃纤维膜或硅胶膜。
进一步地，所述的磁珠为硅羟基磁珠、羧基磁珠或氨基磁珠。
进一步地，所述的磁珠的粒径约0.8～1.2μm，表面电荷约-15～-40mV。
进一步地，在消化处理时，DNaseI的浓度为0.3U/μl～0.4U/μl。
进一步地，在消化处理时，S1核酸酶的浓度为0.8U/μl～1.2U/μl。
进一步地，采用核酸吸附柱对所述的富集产物进行纯化时，具体包括：
S41、将富集产物上样至核酸吸附柱中，离心去除废液；
S42、采用RPE Solution对核酸吸附柱上的样品进行清洗，并离心充分去除核酸吸附柱上的液体；
S43、采用DEPC水溶解核酸吸附柱上的siRNA样品，得到纯化的siRNA。
进一步地，S41步骤或S42步骤中，离心的条件为10000～14000rpm离心1～3min。
进一步地，S41步骤中，先向富集产物中加入Buffer A，再加入70％～100％乙醇，混匀后进行上样。
进一步地，S42步骤中采用RPE Solution对核酸吸附柱上的样品进行清洗时，可重复进行2～4次清洗。
进一步地，所述的含目的基因的DNA单链中，还包含5’端的增强子、T7启动子和3’端的dTdT。
进一步地，体外转录获得含目的siRNA的体外转录产物的步骤包括：
S11、将四条含目的基因的DNA单链退火成2对双链DNA；
S12、2对双链DNA各自转录出单链RNA，其中一条为正义链、一条为反义链；
S13、两条单链RNA退火杂交得到双链RNA，为体外转录产物。
本发明的有益效果是：
通常市售试剂盒水解siRNA非特异核酸的生物酶是DNaseI和RNase T1，而RNaseT1只特异性降解在G残基处的单链RNA，本发明是用DNaseI和S1核酸酶，其中S1核酸酶是一种单链特异性核酸内切酶，可水解单链RNA或DNA为5′单核苷酸，使用S1核酸酶充分降解粗产物中的单链DNA和RNA，提高双链siRNA的纯度；
本发明在生物酶处理粗产物后连续使用磁珠富集及吸附柱纯化两种方式最大程度的提高目标siRNA的纯度，尤其是本发明使用的吸附柱中，填充至少4层以上，孔径是10±2nm的玻璃纤维薄膜，使小于20nt的单链、碱基、错配的双链穿过吸附柱，而目标siRNA产物结合在吸附柱中；进一步提高双链siRNA的纯度；而常规的方法是使用磁珠纯化或者PAGE胶纯化方法中的一种，前者纯化产物含较多杂质，后者纯化费时费力且siRNA容易降解；
本发明方法极大的提高了体外转录制备siRNA的质量，提高实验效率，减少假阴性的实验结果，具有非常高的推广价值。
附图说明
：图1是市售体外转录试剂盒合成siRNA的琼脂糖电泳图，其中，1～3分别代表siIL-25、siTNF-α、siGAPDH，4代表溴酚蓝的位置，5代表二甲苯青的位置；
图2是市售体外转录试剂盒合成siRNA的AKTA分析图；
图3是使用市售试剂盒与实施例1方法得到siGAPDH产物后，细胞转染，检测靶基因mRNA的水平；
图4是市售试剂盒与实施例1中‘第三步纯化’联合使用的AKTA分析图；
图5是实施例1方法纯化后siRNA产物的AKTA分析图；
图6是市售试剂盒与实施例1方法制备得到siGAPDH产物后，细胞转染，检测靶基因蛋白的水平；
图7是蛋白水平的灰度统计图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
主要试剂及设备：DNA引物购买自华大基因，T7 RNAi Transcription Kit购买自诺唯赞公司(主要使用其中的NTP Mix、10×Transcription Buffer、T7 Enzyme Mix及磁珠)，DNaseI酶及S1核酸酶购买自赛默飞公司，核酸吸附柱中多层的玻璃纤维薄膜购买自迈博瑞，DMEM培养基购买自赛默飞公司，血清购买自赛默飞公司，RNA提取试剂盒购买自天根公司，逆转录试剂盒购买自赛默飞公司，Q-PCR试剂盒购买自启衡星公司，AKTA设备信息购买自GE公司，荧光Q-PCR仪购买自Bio-Rad公司，GAPDH的一抗、二抗购买自abcam公司，lip3000购买自赛默飞公司。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：
本实施例以siGAPDH、siIL-25和siTNF-α为例，体外合成siRNA。
步骤①四条单链DNA退火成2对双链DNA：模板A、模板B：
(1)采用化学合成的方法得到四条单链DNA模板，模板链包含5’端6个碱基的增强子、20个碱基的T7启动子、21个目标基因碱基以及3’端的dTdT。序列如下表1所示：
表1体外合成siRNA所涉及的引物表
退火体系如下表2：
表2退火体系
(2)退火程序：水浴锅加热到95℃，上述配置退火体系的pcr管插入浮漂里，置漂浮于水浴锅中，2min；随后关闭水浴锅，使水温自然下降至室温，大约5h左右。
步骤②两对模板各自转录出单链RNA，其中一条是正义链、一条是反义链：
按下表3配置转录体系：
表3转录体系
试剂
体积
模板A
4μl
模板B
4μl
10×Transcription Buffer
2μl
NTP Mix
8μl
T7 Enzyme Mix
2μl
步骤③退火杂交得到双链：
水浴锅加热到37℃，上述配置退火体系的pcr管插入浮漂里，漂浮在水浴锅中，过夜。
上述三组siRNA在获得转录产物后，采用试剂盒自带的纯化方法进行纯化。
如图1所示，市售的试剂盒体外转录产物经过试剂盒自带的纯化方式后，跑2％琼脂糖电泳，图中Marker表示DL5000，第二道～第四道是siRNA，1～3分别代表siIL-25、siTNF-α、siGAPDH，4代表溴酚蓝的位置，5代表二甲苯青的位置。初步看条带单一，提示siRNA产物纯度符合要求。将3种siRNA产物上AKTA设备分析纯度(图2)，目标区的峰面积均小于杂峰区的面积。其中，siIL-25目标峰面积占比约29.249％，siTNF-α目标峰面积占比约20.425％，siGAPDH目标峰面积占比约19.772％，证明siRNA在溶液中的实际占比都已经低于50％，远低于预期高纯度siRNA的要求，提高了后续实验失败的风险。
按本申请方法进一步纯化：
步骤④第一步纯化：DNaseI降解DNA模板，S1核酸酶降解单链DNA和RNA：
按下表4配置酶消化体系：
表4酶消化体系
(2)水浴锅加热到37℃，上述配置退火体系的pcr管插入浮漂里，漂浮在水浴锅中，30min。
步骤⑤第二步纯化：磁珠纯化富集siRNA：
按照T7 RNAi Transcription Kit说明书用磁珠纯化siRNA。
步骤⑥第三步纯化：核酸吸附柱进一步去除小于20nt的核酸、碱基，得到纯度很高的siRNA：
(1)向待纯化的siRNA溶液中加入360μl的Buffer A，混匀；
(2)加入600μl的无水乙醇，混匀；
(3)核酸吸附柱置于收集管中，混合液全部转移至核酸吸附柱中，离心12000rpm，1min，弃废液；
(4)加入700μl RPE Solution，离心12000rpm，1min，弃废液；
(5)加入300μl RPE Solution，离心12000rpm，1min，弃废液；
(6)核酸吸附柱置于收集管中，离心12000rpm，2min，甩干；
(7)向吸附柱正中央滴加30μl DEPC水，室温静置3min后，离心12000rpm，1min，所得溶液即最终纯化后的siRNA。
因为GAPDH作为管家基因在同种细胞或者组织中的蛋白质表达量一般是恒定的，且在蛋白免疫印迹实验(Western blot)和荧光定量PCR实验(qPCR)中作内参，GAPDH基因在实验中是非常重要的。以siRNA转染实验为例，siGAPDH通常被设置成阳性对照组。
图4是试剂盒加‘第三步纯化’联合使用的AKTA分析图。图4的AKTA分析结果表明，联合使用后，3中siRNA目标区的峰面积远大于杂峰区的面积，其中，siGAPDH实际纯度约80.112％，纯度能到明显提高，但是杂峰依然较明显的存在。
我们用本申请提供的方法，即‘第一步纯化’、‘第二步纯化’、‘第三步纯化’后siRNA产物上AKTA设备分析纯度，图5结果显示，3种siRNA目标区的峰面积远大于杂峰区的面积，其中siGAPDH实际纯度进一步提高到91.293％，杂峰进一步减少，目标峰占主要面积。这与图2相比，极大的提高了目标siRNA产物的纯度，进一步保障后续实验的稳定性。
实施例2：
以实施例1方法得到siGAPDH产物为例，细胞转染，检测靶基因mRNA的水平。
(1)细胞准备
HaCat细胞接种至12孔板，使第二天转染前细胞密度在30％～40％之间。
(2)siGAPDH转染
50μl基础培养基加入5μl lip3000作A管，50μl基础培养基加入适量siGAPDH(使试剂盒产物转染浓度为25pmol、50pmol、100pmol、150pmol、200pmol，实施例1方法产物转染浓度为25pmol、50pmol)作B管，B管迅速加入A管并轻轻混匀，室温静置10min，滴加至12孔板中。每个实验组做3个平行，外加1个阳性对照，一个无siRNA的脂质体对照，一个细胞空白对照。
(3)细胞培养48h后，收集细胞，提取RNA
①每孔加入400μl Trizol，移液枪反复吹打10次，转移至无核酸酶的1.5ml EP管中；
②加入20μl的三氯甲烷，震荡混匀30s，冰上静置10min，4℃离心机12000rpm，10min；
小心翼翼吸取最上层透明水相至另一个EP管中；
③加入200μl异丙醇，混匀，冰上静置10min，4℃离心机12000rpm，10min，弃上清，RNA沉淀在官底，呈白色；
④加入1ml 75％乙醇(DEPC水配制)，轻轻洗涤RNA沉淀，4℃离心机12000rpm，5min，尽量弃掉上清；
⑤空甩EP管，4℃离心机12000rpm，2min，尽量弃掉上清，使EP管中没有肉眼可见的液体；
⑥开盖室温晾干10min；
⑦加入30μl DEPC水溶解沉淀，适当地，可放入37℃水浴锅加热，使沉淀溶解加速；
⑧定量测浓度及RNA A260/280的比值。
(4)逆转录RNA
①按下表5逆转录RNA得到cDNA
表5逆转录配置体系
试剂
体积
5×RT Buffer
4μl
M-MLV(H<sup>-</sup>)Reverse Transcription Mix
1μl
RNA
1000ng
oligo(dT)<sub>20</sub>(10μM)
4μl
DEPC水
补足20μl
②PCR仪运行程序：42℃，1h；85℃，5min；4℃，∞；
③20μl的cDNA原液加入180μl的纯化水，混匀。
(5)Q-PCR检测
①按下表6配置Q-PCR体系，以检测目的基因的表达：
表6Q-PCR配置体系
试剂
体积
2×Q-PCR Mix
10μl
cDNA
20ng
引物上游(10μM)
1μl
引物下游(10μM)
1μl
纯水
补足20μl
②Q-PCR仪运行程序：95℃，3mins；39个循环(95℃，15s；60℃，30s)；95℃15s；60℃，1min；95℃，15s。用GAPDH作内参，3个重复，观察溶解曲线和CT值，用2-△△Ct计算目的基因的表达量。
(6)实验结果
图3表明，siGAPDH用体外转录试剂盒时，细胞mRNA水平在24h时敲降效率较低。用实施例1方法制备并纯化siRNA后，siRNA敲降50％左右，效果良好。使得有用的siRNA序列得到较好的实验结果，提高了实验效率及成本。
实施例3：
以实施例1方法得到siGAPDH产物为例，细胞转染，检测靶基因蛋白的表达水平。
(1)细胞准备
HaCat细胞接种至12孔板，使第二天转染前细胞密度在30％～40％之间。
(2)siGAPDH转染
50μl基础培养基加入5μl lip3000作A管，50μl基础培养基加入适量siGAPDH使作B管，B管迅速加入A管并轻轻混匀，室温静置10min，滴加至12孔板中。产物转染浓度分别为25pmol、50pmol、100pmol。每个实验组做3个平行，外加1个阳性对照，一个无siRNA的脂质体对照，一个细胞空白对照。
(3)细胞培养48h后，收集细胞，提取蛋白质
①PBS洗一遍细胞后，加入200ul含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液(RIPA)，移液器充分吹打后转移至1.5ml EP管中；室温离心12000rpm，5min，手机上清，即细胞总蛋白产物；
②放入水浴锅95℃，5min，使得蛋白充分变性，蛋白定量后-80℃保存备用。
(4)Western Blot检测
①配胶，上样，60V、30min，120V、90min；
②减大小适中的PDVF膜，甲醇激活20s，弃甲醇，用纯水洗涤5min，拆开跑胶，放到膜的洗盒里，弃水，倒入转膜液，摇床上洗15min；
③转膜板白板放板，黑面放胶，胶放在棉花最中间一层，一般2层棉花加胶加两层棉花，在膜左上角剪一缺口作标记；
④放入转膜槽内，放入盆里，倒满槽内转膜液，盖上盖子，倒入冰盖满，放入适量的水(水不超过盖子，防止电流不稳定)，100V，2h；
⑤用TBST稀释5％脱脂奶粉，将膜放入5％的牛奶纵，摇床2h进行封闭；
⑥将膜稍微在TBST中洗一下，用一抗稀释液稀释一抗，敷膜上，室温过夜；
⑦用TBST+0.1％Tween-20洗膜，室温10min，3次；
⑧用二抗稀释液稀释二抗，敷膜，室温2h；
⑨用TBST洗膜室温5min，4次，TBS洗膜，室温5min，1次；暗室显影。
(5)实验结果
图6是Western Blot图，1号、2号、3号是siNC，即无干扰效率的对照序列；4号、5号、6号是试剂盒合成的siGAPDH；7号、8号、9号是本发明合成的siGAPD；M是maker。其中1号、4号、7号转染浓度是25pmol；2号、5号、8号转染浓度是50pmol；3号、6号、9号转染浓度是100pmol。其中试剂盒合成的4号、5号、6号均出现不同程度的细胞毒性，细胞状态比siNC组的1号、2号、3号及发明合成的7号、8号、9号状态稍差些，出现细胞碎片，甚至细胞抱团衰老的现象。从图6试验结果来看，试剂盒合成的4号、5号及本发明合成的7号、8号、9号都有明显敲降水平。6号没有明显的目的条带及内参，分析原因是，试剂盒合成siGAPDH转染100pmol时，浓度较高，转染带进去的未知杂质相对增多，引起较多细胞毒性，细胞48h收集细胞时，细胞数量减少，提取蛋白浓度较低，使得6号结果不稳定。这也符合本发明需要解决的问题。6号和9号相比，9号是本发明合成的siGAPDH，即使转染浓度是100pmol，实验结果依然稳定。
图7是Western Blot的灰度统计图。序号编写与图6完全对应，即1号、2号、3号是siNC，即无干扰效率序列的对照；4号、5号、6号是试剂盒合成的siGAPDH；7号、8号、9号是本发明合成的siGAPD；M是marker。其中1号、4号、7号转染浓度是25pmol；2号、5号、8号转染浓度是50pmol；3号、6号、9号转染浓度是100pmol。结果分析与图6完全相同。
综上所述，目前的体外转录方法或者市售体外转录试剂盒得到的产物中有过多杂质，而使实验结果非常不稳定。本申请方法通过带有T7启动子的DNA模板体外转录合成siRNA；DNaseI降解DNA模板，S1核酸酶降解单链DNA和RNA；磁珠纯化富集siRNA；核酸吸附柱进一步去除小于20nt的核酸、碱基，得到纯度很高的siRNA。极大的提高了体外转录制备siRNA的质量，提高实验效率，具有非常高的推广价值。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。