阅读说明：本技术 地榆炭在体股癣、手足癣防治中的应用 (Application of garden burnet charcoal in preventing and treating tinea corporis, tinea cruris, tinea manus and tinea pedis ) 是由 顾琦 梁莹 陈军 顾薇 苏曼 王昊 于 2020-06-21 设计创作，主要内容包括：本发明提供地榆炭在体股癣、手足癣防治中的应用,及其在药物或日用品制备中应用。同时提供没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶醛中一个或多个成分在体股癣、手足癣防治中的应用,及其在药物或日用品制备中应用。红色毛癣菌是体股癣和手足癣的主要致病菌,本发明表明地榆炭能显著抑制其生长,效果与皮肤癣常用中药苦参、土荆皮相当。给药地榆炭后,目镜观察红色毛癣菌生长受到显著抑制。临床疗效观察表明,用含量0.5％地榆炭凝胶治疗4周后患者显愈率达96.15％,其中一半患者痊愈。同时,地榆中主要成分没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶醛均具显著抗红色毛癣菌功效,以上内容未见报道。(The invention provides application of garden burnet charcoal in preventing and treating tinea corporis, tinea cruris, tinea manus and tinea pedis, and application of garden burnet charcoal in preparation of medicines or daily necessities. Simultaneously provides the application of one or more components of gallic acid, pyrogallic acid, gallic acid methyl ester, gallic acid ethyl ester and protocatechuic aldehyde in preventing and treating tinea corporis and cruris, tinea manus and pedis, and the application in the preparation of medicines or daily necessities. The present invention shows that the sanguisorba root charcoal can obviously inhibit the growth of tinea corporis, tinea cruris, tinea manus and tinea pedis, and the effect of the sanguisorba root charcoal is equivalent to that of common traditional Chinese medicines of radix sophorae flavescentis and golden larch bark for treating tinea. After the sanguisorba officinalis charcoal is administrated, the growth of trichophyton rubrum is obviously inhibited by ocular observation. Clinical curative effect observation shows that the cure rate of patients after 4 weeks of treatment by 0.5 percent sanguisorba officinalis charcoal gel reaches 96.15 percent, and half of patients are cured. Meanwhile, the main components of the garden burnet, namely gallic acid, pyrogallic acid, gallic acid methyl ester, gallic acid ethyl ester and protocatechuic aldehyde, have remarkable anti-trichophyton rubrum effects, and the contents are not reported.)

地榆炭在体股癣、手足癣防治中的应用

技术领域

本发明属于中药外用领域，具体涉及地榆炭在体股癣、手足癣防治中的应用。

背景技术

体股癣、手足癣的致病真菌为皮肤癣菌，共同的特点是亲角质。皮肤癣菌约有40余种，其中可引起人或动物致病的约有20余种。国内各地区及不同医院的流调资料显示，体癣、股癣、手足癣的病原菌大致相同，最常见的是红色毛癣菌，为主要致病菌，其他包括须癣毛癣菌、犬小孢子菌和石膏样小孢子菌等。皮肤癣菌可以在人与人、动物与人、污染物与人以及人体不同部位之间传播。患者体质和环境因素在发病中起一定作用，如湿热地区和高温季节是体股癣、手足癣高发的诱因，穿着不透气及过紧衣物、肥胖多汗者或司机易患股；饲养宠物、糖尿病、密切接触感染者及污染物、自身患有手足癣或甲真菌病等其他部位真菌感染易感染体癣。

体股癣、手足癣的治疗临床一般采用局部外用给药，然而，长期局部外用或者系统应用糖皮质激素及免疫抑制剂者可使皮损不典型，形成“难辨认癣”。(《中国体癣和股癣诊疗指南》2018修订版)

地榆为蔷薇科植物地榆Sanguisorba officinalis L.或长叶地偷Sanguisorbaofficinalis L.var.longifolia(Bert.)Yüet Li的干燥根，后者习称“绵地榆”。地榆炭为地榆照炒炭法炮制所得的炮制品，表面焦黑色，内部棕褐色，具焦香气，味味苦涩。地榆炭性微寒，味苦、酸、涩，归肝、大肠经。具凉血止血、解毒敛疮的功效，主治便血、痔血、血痢、崩漏、水火烫伤、痈肿疮毒。(《中国药典》2015版)目前地榆炭的药效报道主要是止血和烧烫伤的治疗，抑菌功效报道甚少，尚未见对红色毛癣菌等体股癣致病菌的抑菌报道，也未见用于体股癣预防或治疗的报道，古籍中也未见此类描述。

发明内容

本发明提供地榆炭在体股癣、手足癣防治中的应用。

同时提供地榆炭在制备防治体股癣、手足癣药物或日用品中的应用。

所述地榆炭为地榆炭粉末或提取物。

作为进一步改进，所述地榆炭提取物的提取溶剂为乙醇水溶液。

作为更进一步的改进，所述地榆炭提取物的提取溶剂为75％乙醇提取物。本发明还提供没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶醛中一个或多个成分在体股癣、手足癣防治中的应用。

以及没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶醛中一个或多个成分在制备防治体股癣、手足癣药物或日用品中的应用。

有益效果

本发明表明，地榆炭提取物能够显著抑制红色毛癣菌(ATCC MYA-4438)的生长，其最低抑菌浓度MIC达64μg/ml，与体股癣、手足癣常用中药苦参、土荆皮的效果相当，优于有抑菌报道的大黄、丁香、蛇床子、百部、黄芩、地肤子、绵马贯众等药材，也优于其炮制前的药材地榆。用目镜10倍，物镜40倍观察地榆炭给药后的菌群形态，给药地榆炭(0.5×MIC)后菌丝分隔开始变得模糊，有融合的趋势，药物影响了菌丝的生长，给药地榆炭(1×MIC)后，菌丝几乎没有分隔，生长受到显著抑制。继而使用含量为0.5％的地榆炭凝胶给药患者进行临床观察，临床疗效表明，用地榆炭凝胶治疗4周后，患者显愈率达96.15％，其中一半患者痊愈。

附图说明

以下将结合附图对本发明作进一步说明：

图1地榆炮制成地榆炭性状图

图2地榆炭提取物总离子流，A-负离子模式，B-正离子模式

图3地榆炭提取物中成分的相对含量分布

图4地榆炭给药红色毛癣菌显微镜观察结果，其中A：正常生长对照孔；B：给药地榆炭(0.5×MIC)后；C：给药地榆炭(1×MIC)后

具体实施方式

下面结合具体实施例进一步说明本发明的技术解决方案，不是对本技术方案的限制。

实施例1地榆炭抗红色毛癣菌活性的考察

采用微量液基稀释法测定地榆炭对红色毛癣菌的抑制作用，同时采用蛇床子、地肤子、皂角刺、土荆皮、白鲜皮、苦参等多种常用抑菌中药进行对照，同时采用地榆炭的原药材地榆进行对照，地榆炮制前后形状变化见图1。

1.菌株

Trichophyton rubrum ATCC MYA-4438购自美国模式培养物集存库(Americantype culture collection,ATCC)。

2.待测样品制备

分别取蛇床子、地肤子、皂角刺、土荆皮、白鲜皮、苦参、地榆、地榆炭药材粉末10g，加10倍量的乙醇水溶液，50℃浸泡过夜后，50℃超声1h，过滤，50℃旋蒸干燥至无液体流动，同温度下烘箱干燥48h，得待测样品。

其中乙醇水溶液优选75％乙醇溶液。

3.菌株活化

将冻存的红色毛癣菌甘油管划线接种PDA平板，置于35℃，～80％湿度条件下培养6天。

4.接种液准备

用5ml 0.9％NaCl溶液覆盖平板，用涂布器轻轻刮平板表面，获得孢子悬液。将此悬液稀释100倍后，使用显微镜及红细胞计数器进行计数。计数结果如下：47，57，44，54。则原液孢子浓度大约为505,000spores/ml。将此菌液800μl加至250ml测试培养基(RPMI 1640添加0.165M MOPS，pH 7.0)，获得接种液。

5.化合物检测板准备

实验当天，将待测样品先溶解于DMSO，再配置成51.2mg/ml母液；对照品氟康唑Fluconazole先溶解于DMSO，再配置成12.8mg/ml母液，其中DMSO浓度均控制在0.05％。

1)化合物母板准备

化合物在96-V孔板中进行11次2倍梯度稀释，得到100倍工作液：51.2，25.6，12.8，6.4，3.2，1.6，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0mg/ml。

Fluconazole在96-V孔板中进行11次2倍梯度稀释，得到100倍工作液：6.4，3.2，1.6，0.8，0.4，0.2，0.1，0.05，0.025，0.0125，0.00625，0mg/ml。

2)化合物子板准备

从化合物母板中转移2μl化合物工作液至加有培养基的96-U孔板，获得化合物检测板。三个平行。

6.化合物检测板接种

在化合物检测板中加入198μl各真菌接种液，最终获得MIC检测板。

7.MIC检测

将MIC检测板置于35℃，～80％湿度条件下，静置培养4天后读取MIC数值。MIC(Minimum Inhibitory Concentration)为最低抑菌浓度，是指在体外培养细菌18至24小时后能抑制培养基内病原菌生长的最低药物浓度，MIC是测量抗菌药物的抗菌活性大小的指标。MIC读取标准参照表1，结果如表2所示。

表1抗生素对测试真菌的MIC判断标准(参考CLSI M38)

CLSI对Trichophyton rubrum ATCC MYA-4438的参考MIC值为0.5-4μg/ml(培养4天)。

表2药材提取物对红色毛癣菌最小抑菌浓度(MIC)的测定

由结果可知，地榆炭对红色毛癣菌具显著的抑制作用，与防治体股癣、手足癣常用中药苦参、土荆皮的效果相当，而苦参、土荆皮均已作为君药开发为防治体股癣、手足癣的中药制剂。地榆炭的抑菌效果优于其他临床常用抑菌中药蛇床子、地肤子、皂角刺、白鲜皮，也同时优于其炮制前的药材地榆，地榆炭的该抑菌效果并未见报道。

实施例2地榆炭提取物的成分分析

实施例1中“2”项下制备地榆炭提取物，采用高效液相色谱-质谱联用进行成分分析，分析条件如下：

色谱条件：采用Agilent Poroshell 120EC-C18(2.1mm×50mm,2.7μm)色谱柱,柱温为30℃，以乙腈为流动相A，以水(含0.1％甲酸)为流动相B，按表3中进行梯度洗脱，流速为0.30mL/min，进样量为1μL。

表3流动相梯度洗脱程序

一级质谱条件：电喷雾离子化(ESI)正负离子模式，干燥气温度300℃，雾化气压力241.3kPa，毛细管出口电压100V，干燥气流量3L/min，毛细管电压3.5k V，质量扫描范围m/z100～600。

二级质谱条件：采用多反应监测(MRM)模式，毛细管电压为5500V(正离子模式)、-4500V(负离子模式)，脱溶剂温度为550℃，气帘气压力为241.3kPa，雾化器与干燥气的压力均为379.2kPa，离子源所用氮气纯度≥95％，碰撞气纯度≥99.999。

实验结果如下：地榆炭提取物正、负离子下的总离子流图见图2。通过搜集国内外相关文献和国内外数据库建立140个化学成分的数据库。根据化合物高分辨的相对分子质量、二级质谱碎片信息及参考文献，HPLC-Q/TOF-MS结果分析，地榆炭鉴定所得54个成分，没食子酸类化合物有20个，鞣花酸类化合物有9个，儿茶素类化合物有7个，三萜皂苷及其苷元类化合物有10个，其他类化合物有8个，其相对含量分布见图3，可见地榆炭中主要成分有4类，分别为没食子酸类，鞣花酸类，儿茶素类，三萜皂苷及其苷元类化合物；其中没食子酸类成分含量最高，经鉴定含量较高的有没食子酸、没食子酸甲酯、甲氧基没食子酸甲酯-5-O-硫酸酯、一没食子酰基-甲基葡萄糖苷、没食子酸乙酯。鞣花酸类和没食子酸类一样，都属于水解鞣质，相对含量较高的有鞣花酸、3,4'-O-二甲基鞣花酸、没食子酰鞣花酸。

实施例4地榆炭抗红色毛癣菌的机制研究

1.地榆炭抗红色毛癣菌物质基础的研究

采用微量液基稀释法测定地榆炭活性成分没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、儿茶素、鞣花酸、熊果酮酸、原儿茶醛的抗红色毛癣菌作用，样品配置及测定方法同实施例1，实验结果见表4。

表4地榆炭活性成分对红色毛癣菌的最小抑菌浓度

结果表明，地榆炭抗红色毛癣菌的主要物质基础可能是没食子酸、焦性没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、原儿茶醛；其中焦性没食子酸、没食子酸甲酯、原儿茶醛这3个成分在地榆炭中含量高于地榆中含量，这可能是地榆炮制后抗菌作用增强的内在机制。

2.地榆炭给药红色毛癣菌的显微镜观察

用目镜10倍，物镜40倍对测试完成的96孔板中1×MIC及0.5×MIC孔进行拍照。结果见图4，其中A为正常生长对照孔，可见菌丝有明显的分隔，给药地榆炭后(0.5×MIC)如B所示，菌丝分隔开始变得模糊，有融合的趋势，药物影响了菌丝的生长。在MIC处给药地榆炭(图C)，菌丝几乎没有分隔，生长受到了显著抑制。

实施例5地榆炭治疗足癣的疗效观察

根据《中国体癣和股癣诊疗指南》2018修订版所述，体股癣的治疗目标是清除病原菌，快速缓解症状，清除皮损，防止复发。疗效评定标准是红斑、丘疹、鳞屑完全消退，真菌镜检和/或培养为阴性，可视为痊愈。部分患者皮损消退后局部可留有暂时性色素沉着。

1.地榆炭凝胶的制备

卡波姆940凝胶1g撒于100mL水中溶胀过夜，三乙醇胺调节凝胶pH至5。取地榆炭75％乙醇提取物的干燥粉末0.5g(制备方法见实施例1中2项下)，用75％乙醇复溶至无沉淀，加入100g调配好的凝胶(卡波姆940)中，搅拌均匀后用旋转蒸发仪旋蒸至无醇味，用水补足凝胶至100g，混合均匀后得到含药量为0.5％的地榆炭凝胶。

2.一般资料

选取足癣患者52例，男23例，女29例，年龄18～48岁，平均(26.32±8.13)岁，平均病程(28.75±21.62)个月。

3.治疗方法

患处给予地榆炭凝胶外用。用法：每天晚上睡前取适量地榆炭凝胶，直接涂抹于患处皮肤，连续给药4周。

4.疗效评定标准

痊愈：临床症状、体症消失，真菌直接镜检结果呈阴性；

显效：自觉症状及皮损情况改善，真菌直接镜检结果呈阴性；

好转：自觉症状及皮损改善30％～70％，真菌直接镜检结果呈阴性或阳性；

无效：自觉症状及皮损改善不足或加重，真菌直接镜检与培养的结果呈阳性。

显愈率＝(痊愈病例数+显效病例数+好转病例数)/总病例数×100％。

5.临床疗效结果

临床疗效结果见表5，可见用地榆炭凝胶治疗4周后，显愈率达96.15％，其中一半患者痊愈。

表5患者临床疗效(例)