阅读说明：本技术 青皮总黄酮和总生物碱的联合提取方法及其应用 (Combined extraction method and application of total flavonoids and total alkaloids in pericarpium citri reticulatae viride ) 是由 刘青 辛英祥 周利丹 王新亮 马毅刚 齐秋月 周艳 卢伊娜 于 2020-05-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种青皮总黄酮和总生物碱的联合提取方法及其应用；包括以下步骤：S1植物原料用酸水超声或加热提取,分别收集提取液和药渣；S2对步骤S1的提取液进行超滤纯化；S3将步骤S2的滤液浓缩至小体积,过滤,收集滤液,得青皮总生物碱；S4将步骤S1的药渣用醇溶剂超声或加热提取,收集提取液；S5对步骤S4的提取液进行超滤纯化；S6将步骤S5的滤液浓缩至小体积,并调节pH至2-4之间,过滤,收集固体,得青皮总黄酮。青皮总生物碱和总黄酮按照一定比例复配而成的青皮提取物,对介导皮肤疼痛、瘙痒的重要受体——瞬时感受器电位香草酸受体1有显著的拮抗作用,因而具有良好的镇痛功效,可用于抗过敏产品的制备。(The invention discloses a combined extraction method and application of total flavonoids and total alkaloids in pericarpium citri reticulatae viride; the method comprises the following steps: s1 ultrasonic or heating extracting the plant material with acid water, and collecting the extractive solution and residue respectively; s2, carrying out ultrafiltration purification on the extracting solution obtained in the step S1; s3, concentrating the filtrate obtained in the step S2 to a small volume, filtering, and collecting the filtrate to obtain pericarpium citri reticulatae viride total alkaloids; s4 extracting the residue of step S1 with alcohol solvent under ultrasound or heating, and collecting extractive solution; s5, carrying out ultrafiltration purification on the extracting solution obtained in the step S4; s6 concentrating the filtrate obtained in step S5 to small volume, adjusting pH to 2-4, filtering, and collecting solid to obtain pericarpium Citri Reticulatae viride total flavone. The green tangerine peel extract compounded by the green tangerine peel total alkaloids and the total flavonoids according to a certain proportion has obvious antagonism on an important receptor mediating skin pain and pruritus, namely an instantaneous receptor potential vanillic acid receptor 1, so that the green tangerine peel extract has good analgesic effect and can be used for preparing antiallergic products.)

青皮总黄酮和总生物碱的联合提取方法及其应用

技术领域

本发明属于中草药提取技术领域，涉及一种青皮总黄酮和总生物碱的联合提取方法及其应用；具体涉及一种青皮总生物碱和总黄酮的联合提取工艺及其在制备具有抗过敏功效的产品中的应用。

背景技术

全球有52％的消费者认为自己的皮肤为敏感性肌肤。敏感性肌肤是临床上常见的问题性皮肤：轻微的外界刺激即可使皮肤自我保护反应激活，引起皮肤刺痛、灼烧、瘙痒、泛红等症状。而灼烧感和刺痛感是瞬时感受器电位香草酸受体1(transient receptorpotential vanilloid 1,TRPV1,也称为辣椒素受体)过度表达的结果，TRPV1是一种可以高效介导Ca²⁺内流的阳离子通道，广泛分布于神经元、免疫细胞、多种脏器上皮细胞及角质形成细胞等细胞中，该受体可探测和整合诱发痛觉的化学和热刺激信号，它可以将化学、机械和热刺激信号转化为动作电位，并将这些信息上传到中枢最后使机体产生痛觉或不舒服的感受，近年来TRPV1通道蛋白已经成为开发新的镇痛药物的重要靶点，通过抑制Ca²⁺内流能够有效缓解疼痛。

近年来中药镇痛抗炎活性成分一直是药物研发的热点之一，学者对镇痛中药进行大量研究，发现了许多有效的中药镇痛成分，主要包括生物碱类、黄酮类、皂苷类、挥发油类等。青皮为柑橘(Citrus reticulata Blanco)的干燥幼果或未成熟果实的果皮，含有丰富的生物碱(辛弗林、N-甲基酪胺)和黄酮类(柚皮苷、橙皮苷和多甲氧基黄酮类)成分，有文献报道称青皮提取物为有效的Ca²⁺拮抗剂(TRPV1抑制相关)，由此可推断青皮提取物对敏感性肌肤具有一定的缓解作用。我国柑橘种植面积广阔，青皮资源丰富，因而成为具有工业化生产价值的原料，目前对青皮有效成分的研究常常是单一类成分的提取、分离，如青皮总黄酮的提取。中药中各类成分对整体药效往往都起着一定的作用，我们常常单独分离研究一种成分而忽视了彼此之间的协同效应。因此，在本发明中我们将总生物碱和总黄酮按照一定的配比作用于TRPV1细胞镇痛模型上，得到了比单一青皮总黄酮、单一总生物碱镇痛效果更好的组合物。

青皮药材除了黄酮和生物碱类成分，还含有蛋白质、果胶和多糖等物质，这些物质也会被提取出来存在于粗提液中。为了得到较纯的总黄酮和总生物碱类物质，需要将上述杂质除去。现有的提取青皮、枳实、枳壳黄酮和生物碱的方法多是采用乙醇提取或是水煎煮，再经树脂吸附、萃取或离子交换纯化，如专利文件CN01106994公开的方法，先采用石油醚脱脂，稀碱溶液回流提取，再用树脂吸附，分步洗脱得到黄酮和生物碱。现有的方法都用到树脂柱层析，在工业生产中树脂柱层析、树脂再生处理需耗费大量的有机溶剂和酸、碱，既不环保又耗费工时。

发明内容

本发明的目的在于针对现有工艺的不足，先通过酸水提取生物碱、超滤除去大分子杂质、再浓缩过滤得到纯度较高的生物碱；药渣再用高浓度的醇提取，经过超滤、浓缩、调酸得到黄酮，不仅对药材进行了充分的利用，同时避免了在生产中使用树脂，使工艺简单省时，更加环保。本发明将总生物碱和总黄酮按照一定的比例复配并应用到TRPV1镇痛模型中，得到最佳的镇痛组合，应用于抗过敏产品的开发中。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明涉及一种青皮提取物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

S1、青皮药材用酸水超声或加热提取，分别收集提取液和药渣；

S2、步骤S1的提取液依次进行微滤、超滤，收集超滤滤液；

S3、将步骤S2的超滤滤液浓缩至小体积，过滤，收集滤液，滤液回收溶剂后得总生物碱；

S4、步骤S1的药渣用醇溶剂超声或加热提取，收集药渣提取液；

S5、步骤S4的药渣提取液依次进行微滤、超滤，收集药渣超滤滤液；

S6、蒸除步骤S5的药渣超滤滤液中的醇，溶液浓缩至小体积后调节pH至2-4，过滤，收集固体，水洗、干燥后得青皮总黄酮；

S7、将所述青皮总生物碱和青皮总黄酮按一定比例复配，得所述青皮提取物。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述酸水选自pH 2-5的甲酸、乙酸或盐酸水溶液；所述酸水的用量为药材干重的10-20倍。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述超声提取的温度为30-50℃，提取时间10-40分钟。

作为本发明的一个实施方案，步骤S1中，所述加热提取温度为40-60℃，提取次数1-2次，每次1-2小时。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2、S5中，微滤、超滤的目的在于除去提取液中的果胶、蛋白等大分子成分。超滤，一方面可以提高总生物碱/黄酮的纯度，另一方面可以提高产品在溶液中的稳定性。如果不去除大分子物质，产品溶液放置3-4周后会析出微量的沉淀，影响产品的应用。

作为本发明的一个实施方案，步骤S2和S5中，所述微滤为陶瓷膜或0.1μm的聚丙烯膜过滤；所述超滤滤膜的截留分子量为3K道尔顿；超滤后，提取液浓缩至原体积的1/2－1/3。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3和S6中，浓缩至小体积是指浓缩至原体积的1/10－1/15。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3和S6中，所述浓缩为60℃-65℃下进行减压浓缩。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，浓缩至小体积时，酸水提取出来的少量黄酮类物质达到过饱和而析出。酸水提取也会提取出少量的黄酮，如果直接将酸水浸提液浓缩至干，得到的生物碱杂质含量比较高。本发明先将酸水提取液浓缩至小体积，黄酮会在溶液中达到过饱和而析出，滤除固体后再把滤液浓缩至干，生物碱中的黄酮残留量会极大降低。

作为本发明的一个实施方案，步骤S3中，回收溶剂的方法可以是减压加热回收、喷雾干燥或冷冻干燥。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述的醇溶剂选自甲醇或乙醇的水溶液，醇的体积分数为50-95％；所述醇溶剂的用量为药材干重的5-20倍。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述超声提取的温度为30-50℃，提取时间10-30分钟。

作为本发明的一个实施方案，步骤S4中，所述加热提取温度为60-80℃，提取次数1-2次，每次0.5-2小时。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，浓缩至小体积，使醇溶剂提取出的少量生物碱溶解在酸水中，黄酮析出。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，调节pH的酸选自无机酸或有机酸，包括但不限于甲酸、乙酸、盐酸、硫酸、磷酸、柠檬酸、苹果酸。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，所述干燥为40℃-60℃真空干燥8-12h。

作为本发明的一个实施方案，步骤S6中，所述水洗是指用水冲洗固体中残留的酸，直至水洗液为中性。

作为本发明的一个实施方案，步骤S7中，所述青皮总生物碱和青皮总黄酮的重量比为0.1-5:1。

第二方面，本发明涉及一种青皮提取物，所述青皮提取物中青皮总生物碱和青皮总黄酮的重量比为0.1-5:1。优选地，重量比为0.5-2:1。

总生物碱和总黄酮的复配对钙离子内流的抑制率显著提升是发明人首次发现。结合本发明提取方法的优点，优选该青皮提取物是由上述制备方法制得。

第三方面，本发明涉及一种所述的青皮提取物在制备具有镇痛、止痒功效的产品中的应用。

作为本发明的一个实施方案，所述具有镇痛、止痒功效的产品包括抗过敏产品。所述抗过敏产品可应用在化妆品领域及医药领域。

作为本发明的一个实施方案，所述青皮提取物在具有抗过敏化妆品中的添加重量比例为0.2-1％。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：

1、本发明提供了一种青皮提取物的制备方法，提取过程中先用酸水提取青皮药材中的生物碱，再用高浓度醇对药渣进行总黄酮的提取，充分利用药材，避免了有效物质的浪费；

2、与常规方法相比，本发明所述的方法工艺简单，可实现工业化生产，不需要使用处理再生麻烦的树脂进行分离纯化，更加省时环保。

3、将总生物碱和总黄酮按照一定的比例复配并应用到TRPV1镇痛模型中，通过协同作用得到最佳的镇痛组合物。

附图说明

通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：

图1为本发明总生物碱部位的紫外图谱；

图2为辛弗林盐酸盐紫外图谱；

图3为本发明总黄酮部位紫外图谱；

图4为橙皮苷紫外图谱。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干调整和改进。这些都属于本发明的保护范围。在本发明中，若非特指，所有设备和原料均可从市场购得或是本行业常用的，下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域常规方法。

实施例1

青皮总生物碱和总黄酮的联合提取：

取干燥的片状青皮药材1kg，用10L去离子水室温下浸泡半小时后，用20％的盐酸调节水的pH至3，于40℃水浴中提取2h，得提取液约7.5L，提取液用陶瓷膜过滤后，在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为3K的纤维素滤膜进行超滤，收集滤过液约3.1L。将3.1L滤液于65℃下减压浓缩至0.3L左右后，用布氏漏斗过滤，收集滤液，冷冻干燥，得青皮总生物碱5g。本发明总生物碱部位的紫外图谱(图1)与辛弗林盐酸盐(图2)类似，确认获得总生物碱。

上述药渣用20L 70％的乙醇80℃下提取0.5h，过滤得提取液约18L。提取液用0.1μm的聚丙烯膜过滤后在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为3K的纤维素滤膜进行超滤，收集滤过液约8L，60℃下减压浓缩至0.55L左右，用20％盐酸调节pH至3.5，用布氏漏斗过滤收集固体，水洗固体至中性，于45℃真空干燥箱中干燥9h，得青皮总黄酮21.5g。橙皮苷是青皮里的主要黄酮类成分，本发明获得的总黄酮部位紫外图谱(图3)与橙皮苷(图4)非常接近，确认获得了总黄酮。

实施例2

青皮总生物碱和总黄酮的联合提取：

取干燥的片状青皮药材1kg，用20L去离子水室温下浸泡半小时后，用20％的盐酸调节水的pH至3.5，于60℃水浴中提取0.5h，得提取液约15.5L，提取液用陶瓷膜过滤后，在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为3K的纤维素滤膜进行超滤，收集滤过液约7L。将7L滤液于65℃下减压浓缩至0.5L左右后，用布氏漏斗过滤，收集滤液，冷冻干燥，得青皮总生物碱5.2g。

上述药渣用10L 80％的乙醇70℃下提取1h，过滤得提取液约8L。提取液用0.1μm的聚丙烯膜过滤后在Millipore Labscale TFF超滤系统上，用截留分子量为3K的纤维素滤膜进行超滤，收集滤过液约4L，60℃下减压浓缩至0.3L左右，用20％盐酸调节pH至3.5，用布氏漏斗过滤收集固体，水洗固体至中性，于45℃真空干燥箱中干燥10h，得青皮总黄酮20g。

实施例3

不同比例的青皮总生物碱和总黄酮对TRPV1的抑制作用测评

构建TRPV1高表达的HaCaT细胞株来验证上述含有总生物碱和总黄酮的青皮提取物的镇痛功效。将实施例1中的总生物碱和总黄酮分别按照1:0、10:1、5:1、2:1、1:1、1:2、1:5、1:10、0:1的比例复配，并配成浓度为10％的母液，再将母液稀释50倍，作为受试物。

将受试物、Fluo-8 AM于37℃下与细胞共孵育30min，再加入辣椒素溶液，37℃下孵育15min后检测荧光强度，通过荧光强度来计算受试物对细胞外钙离子内流的抑制程度，即对TRPV1的抑制程度。实验结果如表1。

结果表明，总生物碱和总黄酮的比例为2:1-1:2时，对钙离子内流的抑制率较高，总生物碱和总黄酮比为1:1时，对钙离子内流的抑制率可以达到100％。

表1不同比例的青皮总生物碱和总黄酮对细胞外钙离子内流的抑制作用

实施例4

不同浓度的青皮总生物碱和总黄酮对TRPV1的抑制作用测评

将实施例2中的总生物碱和总黄酮按照1:1的比例配成组合物，并将组合物配成浓度为10％的提取液。再将提取液稀释成0.1％、0.2％、0.5％、1％、2％、5％、10％的浓度，按照实施例3的方法，评价不同浓度的青皮提取液对TRPV1的抑制作用。结果如表2所示，1％的青皮提取液对钙离子内流的抑制率接近100％，浓度降低至0.2％时，对钙离子内流仍有较强的抑制率。因此，推荐实施例4中的青皮提取液在具有抗过敏功效的化妆品中的添加重量比例为0.2-1％。

表2不同浓度的青皮提取液对细胞外钙离子内流的抑制作用

提取液浓度

0.1％

0.2％

0.5％

1％

2％

5％

10％

钙离子内流抑制率

39.8％

72.3％

89.7％

98.8％

99.9％

100.5％

100.3％

本发明具体应用途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式。应当指出，以上实施例仅用于说明本发明，而并不用于限制本发明的保护范围。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进，这些改进也应视为本发明的保护范围。