阅读说明：本技术 一种用于小麦赤霉病防治的有机肥及其制备方法 (Organic fertilizer for preventing and treating wheat scab and preparation method thereof ) 是由 王翔 赵建荣 程嘉蓉 杨洪杏 鲍文梅 张�浩 周椿富 程嘉慧 曹胜飞 韩振 项进 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种用于小麦赤霉病防治的有机肥及其制备方法,制备该有机肥的原料为小麦秸秆60份,沼渣30份,微生物菌群悬液2份,肥料增效剂0.2份,尿素6份；制备过程中使用的微生物菌群悬液是从染病秸秆中分离出微生物菌群后经扩大培养得到的,对禾谷镰刀菌有抑制作用,较单一菌株而言环境适应能力更强；施用后可改善土壤理化性质,利于农田的可持续发展利用；本发明公开的有机肥属于绿色无公害的肥料,原料来源广泛、分离获取和发酵成本低,以该微生物肥料取代农药对小麦赤霉病进行防治,可减少农药和化肥使用量,起到改善环境和降低成本的作用。(The invention discloses an organic fertilizer for preventing and treating wheat scab and a preparation method thereof, wherein raw materials for preparing the organic fertilizer comprise 60 parts of wheat straws, 30 parts of biogas residues, 2 parts of microbial flora suspension, 0.2 part of a fertilizer synergist and 6 parts of urea; the microbial flora suspension used in the preparation process is obtained by separating microbial flora from infected straws and then carrying out expanded culture, has an inhibiting effect on fusarium graminearum, and has stronger environmental adaptability compared with a single strain; after the fertilizer is applied, the physical and chemical properties of soil can be improved, and the sustainable development and utilization of farmlands are facilitated; the organic fertilizer disclosed by the invention belongs to a green pollution-free fertilizer, the raw material source is wide, the separation and acquisition and fermentation costs are low, the microbial fertilizer is used for replacing pesticides to prevent and control wheat scab, the use amount of the pesticides and the chemical fertilizer can be reduced, and the effects of improving the environment and reducing the cost are achieved.)

一种用于小麦赤霉病防治的有机肥及其制备方法

技术领域

本发明属于生物有机肥制备领域，具体涉及一种用于小麦赤霉病防治的有机肥及其制备方法。

背景技术

小麦是一种在世界各地广泛种植的禾本科植物，富含淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质等，作为三大谷物之一，几乎全作食用，小麦的颖果可以制作馒头、面包，作为发酵材料可以用来制造啤酒、白酒等，是主要的粮食作物。

小麦赤霉病(Fusarium head blight，FHB)，又名红头瘴、烂麦头、麦穗枯、红麦头，是对小麦生产威胁最大的真菌病害之一，主要集中于我国长江中、下游地区和华南冬麦区及东北春麦区。近年来在黄河流域及其附近区域也时有发生，逐渐向北扩展蔓延。小麦赤霉病是一种典型的气候型病害，多发生在穗期多雨、气候潮湿的地区，具有周期性流行的特点。在我国，禾谷镰孢菌占小麦赤霉病病原菌的94.5％。小麦赤霉病使小麦的产量和品质下降，严重影响食品安全。该病菌为害小麦后，可产生多种真菌毒素。其中以脱氧雪腐镰刀菌烯醇(DON)毒性最强。这些毒素会污染面粉，并可在食物链中长期存留，产生致癌物质。因此，小麦赤霉病已成为世界高度关注的一类病害。

防治小麦赤霉病较为关键的措施是适时、适量地在小麦扬花期间进行喷药。目前，对小麦赤霉病的防治仍主要依赖于化学防治。生产上防治该病的化学药物以多菌灵及其复配剂为主。药剂品种单一一直都是化学防治存在的问题，随着其长期的使用，靶标菌产生了极严重的抗药性；此外，由于用量较大，在农产品，如水果、蔬菜、粮食、油料和中药材等中很容易检测到多菌灵的残留。多菌灵对动物的繁殖能力、胚胎发育和免疫系统，对植物的根系发育，以及对土壤微生物数量和微生物的脱氢酶活性、磷酸酶活性等都有一定的影响。

由于农药的不断施用，病原菌的抗药性逐渐增强，过量农药残留导致环境污染问题日益严重；另外，为了增加植物生长过程中所需的养分，通常会在植物生长期内施用肥料，小麦的肥料以化肥为主，但是，化肥只能提供作物无机养分，长期施用会对土壤造成不良影响，使土壤“越种越馋”，养分不平衡，土壤理化性质的恶性改变将不利于农业的可持续性发展。

因此，生物防治技术开始逐渐引起重视，对生物防治手段的研究也日益增多；近年来，利用病原菌的拮抗菌防治小麦赤霉病的研究得到较多的关注。

在此基础上，本研究期望能够获得一种新型生物有机肥，使其在能够提供小麦生长所需养分的同时能够有较好的小麦赤霉病防效，长期施用后对土壤的理化性质能有所改善，使农田能得到长久的高效利用，保证绿色农业的可持续发展。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术中的不足，提供一种用于小麦赤霉病防治的有机肥，制备该有机肥的微生物菌群悬液是从染病秸秆中分离出微生物菌群后经扩大培养所得，对禾谷镰刀菌有抑制作用，较单一菌株而言环境适应能力更强；施用后可改善土壤理化性质，利于农田的可持续发展利用。

本发明的具体技术方案如下所述：

本发明提出一种用于小麦赤霉病防治的有机肥，包括以下重量份数的多个组分：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，肥料增效剂0.2份，尿素6份。

进一步地，所述肥料增效剂为复硝酚钠。

一种用于小麦赤霉病防治的有机肥的制备方法，具体包含以下步骤：

vi.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5mm左右的碎渣，并添加尿素调节碳氮比为25～30:1；

vii.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

viii.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

ix.接着进行发酵，温度控制在55～60℃，发酵3天，熟化10天；

x.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加对应重量份数的复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

进一步地，所述微生物菌群悬液的制备方法为

S1秸秆原料预处理：取被小麦赤霉病侵染的秸秆，粉碎至粉末状，自然风干，备用；

S2微生物菌群的分离：将100mL无菌的无机盐培养基装至规格为250mL的三角瓶中，将秸秆按液体体积5％的量加入三角瓶中，于30℃摇床中进行初代培养，将菌群悬液按液体体积10％的量转移至新鲜的100mL无菌的无机盐培养基中，继续培养48h，按上述方法传代培养5次获得微生物菌群；

S3制备发酵液：在500L的发酵罐中装入400L的无机盐培养基，121℃，0.1MPa灭菌30min，冷却至室温；

S4菌群的扩大培养：将处理后的秸秆按液体体积5％的量加入发酵罐中，将上述传代培养5代的微生物菌群种子液按液体体积10％的量加入发酵罐中，在设定的发酵条件下培养60-72h，获得微生物菌剂菌悬液。

进一步地，步骤S2中初代培养时摇床的转速为160-180rpm，培养时间为45-55h。

进一步地，步骤S4中的发酵条件是培养温度为30-35℃，搅拌速率为200-220rpm，通气量为1:0.4。

进一步地，步骤S4中获得的菌悬液中的有效活菌数为5×10⁸个/mL。

进一步地，步骤S2中获得的微生物菌群中主要包含细菌和放线菌两大类组分，已鉴定到属的细菌组分中又包含芽孢杆菌，假单胞菌，泛菌，双歧杆菌，醋酸杆菌，乳酸杆菌，寡养单胞菌，克雷白氏杆菌，柠檬酸杆菌和黄杆菌。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1.利用本发明公开的用于小麦赤霉病防治的有机肥施用于田间后，对禾谷镰刀菌有较好的拮抗作用，能有效防治小麦赤霉病；

2.本发明公开的有机肥主材料为小麦秸秆与沼渣，并添加了肥料增效剂，营养物质均衡，促进小麦吸收，提高产量，秸秆发酵腐熟后无须添加功能菌株，省时省力，节约成本；

3.本发明公开的有机肥能对土壤改良起到较大的促进作用，保证土壤活力，有利于农业的可持续性发展；

4.本发明公开的有机肥属于绿色无公害的肥料，原料来源广泛、分离获取和发酵成本低，以微生物肥料取代农药对小麦赤霉病进行防治，可减少农药和化肥使用量，改善环境，降低成本。

附图说明

图1为本发明实施例一中获得的不同微生物在菌群中的比例分配圆饼图；

图2为本发明实施例十一中获得的三个处理组的发酵堆肥中的营养成分及酶活性对比数据统计图；

图3为本发明实施例十一中获得的禾谷镰刀菌检测引物的特异性验证图谱；

图4为本发明实施例十一中获得的三个处理中的禾谷镰刀菌数量及DON毒素含量对比数据统计图；

图5A为本发明实施例十一中获得的对照组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱；

图5B为本发明实施例十一中获得的添加贝佳有机肥发酵菌剂的实验组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱；

图5C为本发明实施例十一中获得的添加本发明制备的微生物发酵菌剂的实验组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱。

图6为本发明实施例十二中获得的有机肥对小麦赤霉病发病率及小麦千粒重的影响的统计图；

图7为本发明实施例十二中获得的有机肥对染病小麦生长状况的影响图；

图8为本发明实施例十二中获得的有机肥对土壤理化性质的影响的统计图。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改和替换，均属于本发明的范围。

本发明所需培养基和缓冲液：

基础盐培养基(g/L)：NH₄NO₃ 1.0，KH₂PO₄ 0.5，K₂HPO₄·3H₂O 1.5，NaCl 1.0，MgSO₄·7H₂O 0.2，调节pH至7.0，121℃，灭菌30min；

PDA培养基(马铃薯葡萄糖琼脂培养基)：将200g土豆洗净并去皮，切成1cm小块，沸水煮30min，四层纱布过滤后，向滤液中加入10g葡萄糖(固体另添加15g琼脂)，充分溶解后，补充蒸馏水至1L，115℃，灭菌25min；

绿豆培养基：绿豆30g，绿豆洗净后加水煮至开花，用纱布过滤，自然pH，蒸馏水将滤液补充至1L，121℃，灭菌15min；

磷酸缓冲液：称取45.23g磷酸氢二钠和8.07g柠檬酸，用水溶解并定容至1L，调节pH至6.0。

实施例一：用于小麦赤霉病防治的微生物菌群悬液的制备

1.秸秆原料预处理：染病秸秆采自江苏省南京市小麦田，粉碎至粉末状，自然风干，备用；

2.微生物菌群的分离：将100mL无菌的无机盐培养基装至规格为250mL的三角瓶中，将秸秆按液体体积5％的量加入三角瓶中，30℃摇床，180rpm培养48h，将菌群悬液按液体体积10％的量转移至新鲜的100mL无菌的无机盐培养基中，继续培养48h，按上述方法传代培养5次；

3.制备发酵液：在500L的发酵罐中装入400L的无机盐培养基，121℃，0.1MPa灭菌30min，冷却至室温；

4.菌群的扩大培养：将处理后的秸秆按液体体积5％的量加入发酵罐中，将上述传代培养5代的微生物菌群种子液按液体体积10％的量加入发酵罐中，于30℃、220rpm的搅拌速率，通气量为1:0.4的条件下，培养65h，获得微生物发酵菌剂菌悬液，菌悬液中的有效活菌数达到5×10⁸个/mL。

用强力水体DNA提取试剂盒(DNA Isolation Kit，MOBIO)提取步骤2获得的菌群悬液的水样总DNA，测定样品中菌群的组成结构(委托北京诺禾致源科技股份有限公司完成)，检测结果如图1所示。从图1中可以看出本发明中获得的微生物菌群的主要组分为细菌和放线菌，在鉴定到属的细菌组分中，主要包括芽孢杆菌，假单胞菌，泛菌，双歧杆菌，醋酸杆菌，乳酸杆菌，寡养单胞菌，克雷白氏杆菌，柠檬酸杆菌和黄杆菌。

实施例二、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

其中，沼渣是沼气残渣发酵后剩余的固形物质，用途十分广泛，一是沼渣富含有机质、腐殖质、微量营养元素、多种氨基酸、酶类和有益微生物。质地疏松、酸碱度适中，能起到很好的改良土壤的作用。二是沼渣含有氮、磷、钾等元素，能满足作物生长的需要。三是沼渣中仍含有较多的沼液，其固体物含量在20％以下，其中部分未分解的原料和新生的微生物菌体，施入农田会继续发酵，释放肥分。在这里可以为小麦的生长提供足够的营养；复硝酚钠可以提高小麦对营养物质的吸收能力；尿素可以调节秸秆发酵时的碳氮比。

具体的制备步骤为：

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为20:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在50℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例三、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为20:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在55℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例四、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为20:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在60℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例五、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为25:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在50℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例六、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为25:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在55℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例七、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为25:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在60℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例八、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为30:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在50℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例九、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为30:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在55℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例十、有机肥的制备

本发明制备的有机肥中各组分的重量份数为：小麦秸秆60份，沼渣30份，微生物菌群悬液2份，复硝酚钠0.2份，尿素6份；

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径5毫米左右的碎渣，并添加指定重量份数的尿素，调节碳氮比为30:1；

2.将微生物菌群悬液按重量份数均匀、逐层喷洒至秸秆中，控制湿度在60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手，翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.然后进行发酵，温度控制在60℃，发酵3天，熟化10天；

5.将沼渣按重量份数加入上述物料中，搅拌均匀，再添加复硝酚钠，搅拌均匀，造粒得到粒径2mm的防治小麦赤霉病的生物有机肥。

实施例十一、微生物菌群悬液的相关性能测试

1.禾谷镰刀菌孢子液的制备

将活化的禾谷镰刀菌转接至PDA平板，25℃，培养5天，挑取菌丝接入绿豆培养基中，25℃，180rpm，摇床培养5天，纱布过滤，滤液7000rpm离心10min，沉淀用无菌水重悬，浓度为10⁵个/mL，置于冰箱中备用。

2.小麦染病秸秆发酵

1)实验设置：共设置三组处理，包含一个对照组(秸秆自然发酵)和两个实验组(分别用本发明制备的微生物发酵菌群悬液与贝佳有机肥发酵菌剂处理染病秸秆)，对比相同发酵时间内秸秆发酵腐熟的程度，发酵后堆肥中粗蛋白、粗纤维、粗脂肪、粗灰分、钙含量、磷含量、α-淀粉酶、蛋白酶及纤维素酶活力，发酵结束后堆肥中的禾谷镰刀菌的数量、DON毒素的含量等指标，确定微生物发酵菌剂在发酵染病秸秆过程中的作用。

2)具体实验操作如下：

贝佳有机肥发酵菌剂的活化：将1kg菌种，1kg红糖加入18kg井水中，搅拌均匀，无需密封容器，放置72h，有酸甜味即可，得到菌悬液的有效活菌数为5×10⁸个/mL。

1.将小麦染病秸秆晾晒后粉碎至粒径为5毫米左右的碎渣，并添加尿素调节碳氮比为25:1；

2.将活化好的发酵菌剂或者扩大培养后的微生物发酵菌悬液均匀、逐层喷洒至秸秆中，对照组用自来水喷施，控制湿度在50-60％范围内(手一攥成一团，轻轻扔到地上能散开)，堆成边长为1.5米的方堆，覆盖塑料膜，不可密封，保持透气性良好；

3.当温度升高到50℃，感觉轻微烫手时翻堆一次，当温度再升高到50℃时再翻堆一次；

4.后期发酵温度控制在60℃，发酵3天，熟化10天。

3)腐熟程度的比较：不同处理组经过3天发酵以及10天的熟化，对照组(自然发酵)的秸秆手感较硬，无明显变化，添加贝佳有机肥发酵菌剂的实验组的发酵物料颜色变深，手感略微松软，可闻到轻微的酸味，而添加本发明中的微生物发酵菌剂处理后，在相同的时间内，秸秆颜色变成黑褐色，手感松软有弹性，手握易成粉末状，有曲香而不臭，说明该实验组的秸秆发酵充分，这也说明本发明制备的微生物发酵菌悬液在同等条件下可加快秸秆的发酵。

3.堆肥中营养成分及酶活性的测定

1)营养成分的测定方法：

粗蛋白的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6432-1994饲料中粗蛋白的测定方法进行。

粗纤维的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6434-2006饲料中粗纤维的测定方法进行。

粗脂肪的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6433-2006饲料中粗脂肪的测定方法进行。

粗灰分的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6438-2007饲料中粗灰分的测定方法进行。

钙含量的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6436-2002饲料中钙含量的测定方法进行。

磷含量的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中磷含量的测定方法进行。

2)酶活性的测定方法：

从每个处理组中称取堆肥5.0g，设置3个平行，加入50mL磷酸缓冲液，5000rpm离心30min，上清液为待测液。

α-淀粉酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中α-淀粉酶活性的测定方法进行。

蛋白酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中蛋白酶活性的测定方法进行。

纤维素酶活性的测定采用中华人民共和国国家标准方法GB/T 6437-2002饲料中纤维素酶活性的测定方法进行。

图2为三个处理组的发酵堆肥中的营养成分及酶活性对比数据统计图，从图中可以看出不同处理下其营养成分差别较大。添加微生物菌群悬液的处理相较于对照组和添加市场常规秸秆发酵菌剂的处理而言，添加本发明制备的微生物菌群悬液的处理中的粗蛋白、粗脂肪、钙和磷含量都显著升高，粗纤维以及粗灰分显著降低。对于酶活性而言，与秸秆发酵相关的α-淀粉酶、蛋白酶以及纤维素酶的活性菌显著提高，这与2中观察到的三个处理组的腐熟程度的对比结果相符，说明本发明公开的微生物发酵菌剂确可加快秸秆的发酵速度。

4.堆肥中禾谷镰刀菌的定量测定及DON毒素的检测

1)禾谷镰刀菌的定量测定

禾谷镰刀菌检测特异引物：Fg16F:CTCCGGATATGTTGCGTCAA；Fg16R:GGTAGGTATCCGACATGGCAA。利用荧光定量PCR制备标准曲线，即禾谷镰刀菌标准品拷贝数的lg数与达到阈值时的循环数Ct之间的关系。随即用强力植物DNA提取试剂盒(DNA Isolation Kit，MOBIO)提取发酵腐熟后的秸秆样品DNA，通过与标准曲线中Ct值的比较，定量检测禾谷镰刀菌：

反应体系(20μL)如下所示：

荧光定量PCR的程序设置如下：

图3为禾谷镰刀菌检测引物的特异性验证图谱即荧光定量PCR溶解曲线，从图中可以看出多次获得的溶解曲线均只有一个特征峰，说明该引物的特异性良好，可通过荧光定量PCR技术定量检测禾谷镰刀菌，结果可靠。

2)DON毒素的检测方法

称取25g样品于搅拌杯中，加入5g聚乙二醇(PEG 8000)和100mL纯水，盖上杯盖，高速搅拌2min。取下盖子，将提取物倒入槽纹滤纸上，用100mL烧杯收集滤液，滤液再经Whatman微纤维滤纸过滤。取5mL提取液，控制压力使液体以1滴/s的流速全部通过Don-test免疫亲和柱。用10mL纯水以2滴/s的流速淋洗亲和柱，弃去全部流出液。准确加入1.0mL甲醇，以1滴/s的流速洗脱，收集全部洗脱液于玻璃管中。取20μL净化液进行HPLC分析。根据峰保留时间定性，根据峰面积外标法定量。

高效液相色谱检测条件：色谱柱Symmetry C₁₈柱，4.6mm×150mm，粒度5μm；柱温40℃，流动相：乙腈：水(16:84，v/v)，流速0.8mL/min，进样量20μL，紫外检测器波长218nm。

三个处理组中的禾谷镰刀菌数量及DON毒素含量对比结果如图4所示，三个处理组堆肥中DON毒素的HPLC检测图谱如图5A、图5B和图5C所示，从图4、图5A、图5B和图5C中可以看出添加本发明制备的微生物菌群悬液处理的秸秆中的禾谷镰刀菌的数量以及DON毒素的含量显著低于其他两个处理组，说明本发明制备的微生物菌群悬液对禾谷镰刀菌具有较强的防控效果，在染病秸秆的处理问题上具有独特的优势。

实施例十二、有机肥对田间小麦赤霉病的防治效果及土壤改良效果的测试

共设置十组处理，包含一个对照组(施用普通肥料)和九个实验组(分别用本发明实施例二至实施例九中制备的有机肥料)，此次田间应用实验于2018年4-6月，实验地点在南京农业大学小麦实验基地，实验时期在小麦进入扬花期后，向种植土壤喷施禾谷镰刀菌孢子液，用量均为3mL/m²，30天后统计小麦赤霉病发病的病小穗率，小麦成熟后测定千粒重，确定最优发酵条件，同时测定施用最优发酵条件下形成的有机肥后土壤的含水量、容重、全氮、全磷、全钾和有机质含量。

土壤含水量采用称重法测定。

容重采用环刀法测定。

全氮采用凯氏定氮法测定。

全磷采用酸溶-钼锑抗比色法测定。

全钾采用氢氧化钠熔融法测定。

有机质采用重铬酸钾滴定法测定。

采用不同发酵条件制备的有机肥对小麦赤霉病的防控效果如图6所示，从图中可以看出实例二至十所制成的有机肥对小麦赤霉病均有明显的防控效果，其中以实施例六、七、九、十最为明显，对小麦赤霉病的防效分别为57.49％，56.75％，56.65％，58.22％，小麦的增产率分别能达到19.28％，20.27％，18.57％，21.22％。因此，该微生物菌群发酵小麦秸秆的碳氮比控制在25-30：1，发酵温度控制在55-60℃时，效果最佳。

图7为施加本发明实施例十制备的有机肥与施用普通肥料后麦穗生长情况的对比图，从图中可以看出施用本发明实施例十制备的有机肥的麦穗生长较为旺盛，没有表现出受小麦赤霉病侵染的病态，穗高且颗粒饱满紧实；而施加普通肥料的麦穗则表现出明显的病态，与施加有机肥的麦穗相比，穗矮且颗粒较小，直观反映本发明制备的有机肥具有较好的小麦赤霉病防控效果。

有机肥对土壤理化性质的影响结果如图8所示，从图中看出施加本发明实施例六、七、九、十制备的有机肥可以显著提高土壤有机质的含量，同时，土壤中全磷、全钾、全氮的含量也有所增加，土壤容重下降，表明该有机肥对土壤的改良起到很大的促进作用。

综上可知：该有机肥安全、绿色，对禾谷镰刀菌有较好的拮抗作用，同时可以加速小麦秸秆发酵。此外，本发明中有机肥主材料为小麦秸秆与沼渣，并添加了肥料增效剂，营养物质均衡，促进小麦吸收，提高产量，节约成本，保护环境。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征及优点。但是以上所述仅为本发明的具体实施例，本发明的技术特征并不局限于此，任何本领域的技术人员在不脱离本发明的技术方案下得出的其他实施方式均应涵盖在本发明的专利范围之中。