阅读说明：本技术 一种识别和检测草酸的荧光分子探针及其制备方法和应用 (Fluorescent molecular probe for identifying and detecting oxalic acid and preparation method and application thereof ) 是由 贾丽华 郭祥峰 高昕 杨瑞 赵振龙 张宇 于 2020-05-06 设计创作，主要内容包括：一种识别和检测草酸的荧光分子探针及其制备方法和应用,明涉及识别和检测草酸的探针及其制备方法和应用。本发明是要解决现有的利用荧光法识别和检测草酸的荧光探针无法实现定量检测,而且选择性差、易受其它有机酸干扰的技术问题。本发明的荧光分子探针的结构式为：<Image he="739" wi="536" file="DDA0002478475100000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>制法：一、水杨酸、浓硫酸、甲醇反应制备中间体I；二、中间体I与水合肼制备中间体Ⅱ；三、8-羟基喹哪啶、二氧化硒、1,4-二氧六环反应制备中间体Ⅲ；四、中间体Ⅲ与中间体Ⅱ反应得到中间体Ⅳ；五、向中间体Ⅳ与Fe<Sup>3+</Sup>反应,得到探针。它通过荧光增强对草酸进行识别和检测,选择性高且不受其它有机酸的干扰,检出限为1.3×10<Sup>-7</Sup>mol/L。可用于环境、食品领域。(A fluorescent molecular probe for identifying and detecting oxalic acid and a preparation method and application thereof relate to a probe for identifying and detecting oxalic acid and a preparation method and application thereof. The invention aims to solve the technical problems that the existing fluorescent probe for identifying and detecting oxalic acid by using a fluorescence method cannot realize quantitative detection, has poor selectivity and is easy to be interfered by other organic acids. The structural formula of the fluorescent molecular probe is as follows: the preparation method comprises the following steps: firstly, salicylic acid, concentrated sulfuric acid and methanol react to prepare an intermediate I; secondly, preparing an intermediate II by the intermediate I and hydrazine hydrate; reacting the tri-8-hydroxyquinaldine, selenium dioxide and 1, 4-dioxane to prepare an intermediate III; IV, intermediate III and IIIReacting the intermediate II to obtain an intermediate IV; fifthly, adding intermediate IV and Fe 3+ The oxalic acid is identified and detected through fluorescence enhancement, the selectivity is high, the oxalic acid is not interfered by other organic acids, and the detection limit is 1.3 × 10 ‑7 mol/L. Can be used in the fields of environment and food.)

一种识别和检测草酸的荧光分子探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及识别和检测草酸的探针及其制备方法和应用。

背景技术

草酸是一种常见有机二元羧酸，广泛存在于植物体内，尤其是在菠菜、苋菜、韭菜等蔬菜中含量较高。通过饮食摄入体内的草酸可与钙离子形成难溶于水的草酸钙，不仅影响人体钙的吸收，还会增加患肾结石等疾病的风险。目前，检测草酸的方法主要有滴定法、比色法和色谱法等。这些传统方法不仅操作复杂，而且存在灵敏度低或仪器价格高等不利因素。荧光分子探针作为一种新兴的检测手段，具有灵敏度高、成本低、操作简便等优点，受到了广泛关注。因此，开发一种利用荧光分子探针检测草酸的方法十分重要。如何春生、钱旭红等在《道尔顿会刊》(Dalton Transactions)的2011年的第40期第5卷第1034-1037 页发表的文章《基于炔烃共轭羧酰胺基喹啉的草酸比例荧光探针及活细胞成像》(Aratiometric fluorescent probe for oxalate based on alkyne-conjugatedcarboxamidoquinolines in aqueous solution and imaging in living cells)公开了一种利用荧光分子探针检测草酸的方法。但是这类分子探针是通过荧光猝灭识别和检测草酸，只能定性检测，而且选择性差、易受其它有机酸干扰。

发明内容

本发明是要解决现有的利用荧光法识别和检测草酸的荧光探针无法实现定量检测，而且选择性差、易受其它有机酸干扰的技术问题，而提供一种识别和检测草酸的荧光分子探针及其制备方法和应用。

本发明的识别和检测草酸的荧光分子探针，其结构式为：

该荧光分子探针可通过荧光增强识别和检测草酸及其含量。

上述识别和检测草酸的荧光分子探针的制备方法，按照以下步骤进行：

一、将水杨酸与浓硫酸以摩尔比为1：(0.9～1.5)的比例加入至甲醇中，在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持12～18h；冷却至室温，旋蒸除去甲醇，用水多次洗涤；再用二氯甲烷萃取，用无水硫酸钠干燥，再经过硅胶柱色谱分离，得到中间体I；

二、将步骤一所得中间体I与水合肼以摩尔比为1：(2.5～4.5)的比例加入至乙醇中，再搅拌并加热至沸腾回流反应10.5～13.5h；将反应液旋干，再经过去离子水重结晶，得到中间体Ⅱ；

三、将8-羟基喹哪啶与二氧化硒以摩尔比为1：(1.5～2.5)的比例加入至1,4-二氧六环中，在温度为95～100℃且氮气保护条件下反应6～18h，冷却静置；过滤，将滤液旋干，再经过硅胶柱色谱分离，得到中间体Ⅲ；

四、将步骤三所得中间体Ⅲ与步骤二所得中间体Ⅱ以摩尔比为1：(1.2～2.5)的比例加入至乙醇中，搅拌并加热至沸腾回流反应3.5～4.5h，析出黄色固体，用乙醇洗涤，得到中间体Ⅳ；

五、将步骤四所得中间体Ⅳ加入有机溶剂中，室温下再加入与中间体Ⅳ等摩尔量的 Fe³⁺，得到识别和检测草酸的荧光分子探针。

上述识别和检测草酸的荧光分子探针的应用，是利用该荧光分子探针通过荧光增强对草酸进行识别和检测。

本发明的复合型识别和检测草酸的荧光探针可通过荧光增强检测雨水、废水以及植物中草酸及其含量进行检测，且不受其它有机酸的干扰，具有较高的选择性与灵敏度，探针对草酸的检出限(LOD)为1.3×10^-7mol/L。该类荧光探针可用于环境样品、食品以及其它领域草酸含量的检测，具有广泛的潜在应用价值。

附图说明

图1为实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针在加入有机酸和氨基酸前后的荧光光谱变化图；

图2为实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针在加入有机酸和氨基酸前后的荧光强度与其它有机酸或氨基酸对草酸识别的干扰柱形图；(图中字母代号分别与有机酸或氨基酸对应：(A)空白、(B)L-蛋氨酸、(C)L-色氨酸、(D)L-脯氨酸、(E)L-精氨酸、(F)L- 天冬氨酸、(G)L-苯丙氨酸、(H)L-苏氨酸、(I)L-丝氨酸、(J)L-赖氨酸、(K)L-缬氨酸、(L)L- 组氨酸、(M)L-酪氨酸、(N)L-白氨酸、(O)L-半胱氨酸、(P)L-谷氨酸、(Q)柠檬酸、(R)甲酸、(S)乙酸、(T)苯甲酸、(U)水杨酸、(V)酒石酸、(W)琥珀酸、(X)扁桃酸)；

图3为实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针对不同浓度的草酸的荧光光谱变化图；

图4为实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针对不同浓度的草酸的荧光强度的变化曲线图。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的识别和检测草酸的荧光分子探针，其结构式为：

该荧光分子探针可通过荧光增强识别和检测草酸含量。

具体实施方式二：具体实施方式一所述的识别和检测草酸的荧光分子探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、将水杨酸与浓硫酸以摩尔比为1：(0.9～1.5)的比例加入至甲醇中，在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持12～18h；冷却至室温，旋蒸除去甲醇，用水多次洗涤；再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥，再经过硅胶柱色谱分离，得到中间体I；

二、将步骤一所得中间体I与水合肼以摩尔比为1：(2.5～4.5)的比例加入至乙醇中，再搅拌并加热至沸腾回流反应10.5～13.5h；将反应液旋干，再经过去离子水重结晶，得到中间体Ⅱ；

三、将8-羟基喹哪啶与二氧化硒以摩尔比为1：(1.5～2.5)的比例加入至1,4-二氧六环中，在温度为95～100℃且氮气保护条件下反应6～18h，冷却静置；过滤，将滤液旋干，再经过硅胶柱色谱分离，得到中间体Ⅲ；

四、将步骤三所得中间体Ⅲ与步骤二所得中间体Ⅱ以摩尔比为1：(1.2～2.5)的比例加入至乙醇中，搅拌并加热至沸腾回流反应3.5～4.5h，析出黄色固体，用乙醇洗涤，得到中间体Ⅳ；

五、将步骤四所得中间体Ⅳ加入至有机溶剂中，室温下再加入与中间体Ⅳ等摩尔量的Fe³⁺，得到识别和检测草酸的荧光分子探针。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式二不同的是：步骤一中所述的浓硫酸的质量百分浓度≥98％；其它与具体实施方式二相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式二或三不同的是：步骤一中水杨酸与浓硫酸的摩尔比为1：1；其它与具体实施方式二或三相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式二至四之一不同的是：步骤一中在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持13h，其它与具体实施方式二至四之一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式二至五之一不同的是：步骤一中用水多次洗涤；其它与具体实施方式二至五之一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式二至六之一不同的是：步骤二中中间体 I与水合肼以摩尔比为1：3；其它与具体实施方式二至六之一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式二至七之一不同的是：步骤三中8-羟基喹哪啶与二氧化硒的摩尔比为1：2；其它与具体实施方式二至七之一相同。

具体实施方式九：本实施方式与具体实施方式二至八之一不同的是：步骤三中在温度为97℃且氮气保护条件下反应7h；其它与具体实施方式二至八之一相同。

具体实施方式十：本实施方式与具体实施方式二至九之一不同的是：步骤四中中间体Ⅲ与中间体Ⅱ的摩尔比为1：2；其它与具体实施方式二至九之一相同。

具体实施方式十一：本实施方式与具体实施方式二至十之一不同的是：步骤五中有机溶剂为DMSO(二甲基亚砜)、DMF(二甲基甲酰胺)、THF(四氢呋喃)、乙腈或其中几种的组合；其它与具体实施方式二至十之一相同。

具体实施方式十二：具体实施方式一所述的识别和检测草酸的荧光分子探针的应用，是利用该荧光分子探针通过荧光增强对草酸进行识别和检测。

具体实施方式十三：本实施方式与具体实施方式十二不同的是所述的草酸为雨水、废水、植物或食品中的草酸。其它与具体实施方式十二相同。

用以下的实施例验证本发明的有益效果：

实施例1：本实施例的识别和检测草酸的荧光分子探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、向250mL圆底烧瓶中依次加入15.0g(0.11mol)水杨酸、100mL甲醇、10mL 质量百分浓度为98％的浓硫酸，在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持13h。冷却至室温，旋蒸除去甲醇，用水多次洗涤；再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥过夜，用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体I；中间体I的产量7.623g，收率46％。中间体I的性状为液体，直接用于下一步合成。步骤一中直接利用水杨酸合成了中间体I，即

二、在250mL圆底烧瓶中依次加入7.436g(48.9mmol)中间体I、50mL无水乙醇以及15.02g(150mmol)质量百分浓度为50％的水合肼，再搅拌并加热至沸腾回流反应13 h。旋蒸除去乙醇，用去离子水重结晶，得到3.266g中间体Ⅱ；中间体Ⅱ的收率为45％，熔点：144.5～145.6℃，将中间体Ⅱ进行分析，结果如下：FTIR(KBr)v(cm^-1):3647,3320, 3262,3060,2773,2669,2584,1965,1926,1886,1809,1659,1587,1535,1495,1437,1359。步骤二中利用中间体I与50％水合肼合成了中间体Ⅱ，即

三、向250mL圆底烧瓶中加入150mL 1,4-二氧六环，加热至60℃，再加入4.177g(37.6mmol)二氧化硒；称取3.097g(19.5mmol)8-羟基喹哪啶溶解于10mL 1,4-二氧六环，缓慢滴入反应液。在温度为95℃且氮气保护条件下继续反应18h，冷却静置；过滤，将滤液旋干，产物用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体Ⅲ；中间体Ⅲ的产量为1.281g，收率40％，熔点：96.5～98.2℃，将中间体Ⅲ进行分析，结果如下：FTIR(KBr) v(cm^-1):3425,3372,3060,2838,1952,1704,1626,1594,1561,1495,1463。步骤三中利用8- 羟基喹哪啶与二氧化硒合成了中间体Ⅲ，即

四、向反应瓶中加入0.090g(0.50mmol)中间体Ⅲ、15mL无水乙醇及0.104g(0.68mmol)中间体Ⅱ，搅拌并加热至沸腾回流反应4h，反应混合物冷却静置，有浅黄色固体析出，用无水乙醇洗涤后烘干，得到中间体Ⅳ；中间体Ⅳ的产量0.092g，收率60％，熔点：258.2～261.5℃。将中间体Ⅳ进行结构分析，结果如下：¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆) δ(ppm):12.173(s,1H),11.615(s,1H),9.863(s,1H),8.636(s,1H),8.371(d,J＝4.5Hz,1H), 8.113(d,J＝4.2Hz,1H),7.886(d,J＝3.6Hz,1H),7.474(dd,J＝3.9Hz,3.3Hz,2H),7.430 (d,J＝3.9Hz,1H),7.145(d,J＝3.9Hz,1H),6.996(dd,J＝3.9Hz,3.6Hz,2H).¹³C NMR (150MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):165.50,159.19,153.93,152.02,148.99,138.63,137.14,134.36, 129.37,129.33,128.91,119.51,118.32,118.22,117.71,117.00,112.67.FTIR(KBr)v(cm^-1): 3743,3467,3407,3251,3052,2730,2588,1947,1646,1600,1535,1503,1463.ESI-MS m/z [M+H]⁺:Calcd.:308.1035,Found:308.1022。从分析结果可知，中间体Ⅳ的结构式为

五、配制100mL浓度为1.0×10^-5mol/L的中间体Ⅳ的DMSO溶液，然后在其中加入100μL浓度为0.010mol/L Fe³⁺水溶液，超声30min，静置，得到识别和检测草酸的荧光分子探针；该复合型草酸荧光分子探针已均匀分布在DMSO中，可直接对草酸含量进行检测。将复合型草酸荧光分子探针进行分析，结果如下：MS(ESI):m/z calcd for C₁₇H₁₇FeN₃O₄S⁺(M+Fe³⁺)439.0289,found 439.0267，从分析结果可知，中间体Ⅳ与Fe³⁺在DMSO溶液中形成了稳定的1：1配合物，即识别和检测草酸的荧光分子探针，其结构为

实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMSO 溶液中，分别加入常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、草酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、 L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，得到的荧光光谱图如图1所示，从图1可以看出，草酸对该探针的荧光光谱影响显著，其它常见有机酸和氨基酸对光谱没有明显影响。在空白溶液中，探针的荧光强度很弱，当草酸加入使探针荧光光谱500nm处的荧光增强。比较难得的是荧光响应的高选择性，在常见有机酸和氨基酸中探针单一荧光增强识别草酸。

实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMSO 溶液中，加入草酸，超声，静置，草酸水溶液的浓度为探针浓度的5倍，再分别加入其它常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、 L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，得到的荧光强度图如图 2所示，从图2可以看出，当其它有机酸或氨基酸与草酸共同存在时，探针的发射波长与荧光强度基本没有明显改变，识别与检测能力没有受到明显影响。结果表明，探针对草酸的响应不仅选择性好，而且抗干扰能力较强，是一个比较理想的高选择性荧光增强识别草酸的荧光分子探针。

实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMSO 溶液中，不断搅拌的条件下，加入草酸，草酸加入的浓度为0～38μmol/L，研究不同草酸浓度对探针荧光光谱的影响，得到的荧光光谱如图3所示，由图3可以看出，随着草酸浓度的增大，探针在荧光光谱中，发射波长为500nm，且荧光强度逐渐增强，当草酸浓度约为28μmol/L时，吸收强度与荧光强度均趋于平稳，不再有显著性变化。探针荧光强度与草酸浓度的关系曲线如图4所示，当草酸浓度在0～28μmol/L范围内，其荧光强度与草酸浓度呈现良好的线性关系，并根据标准线性关系，可以计算探针对草酸的检出限(LOD) 为1.3×10^{- 7}mol/L，由此可见本实施例制备的荧光探针可以定量检测草酸。

实施例1制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，对超纯水进行了草酸加标回收实验。分别移取0、0.3、0.5、0.7μL浓度为0.050mol/L草酸水溶液作为标样，再分别向其中加入3μL超纯水，最后加入探针DMSO溶液，测试荧光光谱。结合标准曲线，根据荧光强度计算回收率。实验结果如表1，草酸在超纯水中的加标回收率为99.7％～100.4％。说明采用该探针对草酸定量检测效果较好，可应用于实际样品溶液中草酸的定量检测。

表1为超纯水样品中探针检测草酸的加标回收率

a测定平均值(n＝3)

实施例2：本实施例的识别和检测草酸的荧光分子探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、向250mL圆底烧瓶中依次加入14.8g(0.11mol)水杨酸、90mL甲醇、11mL质量百分浓度为98％的浓硫酸，在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持15h。冷却至室温，旋蒸除去甲醇，用水多次洗涤；再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥过夜，用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体I；中间体I的产量7.954g，收率48％。中间体 I的性状为液体，直接用于下一步合成。步骤一中直接利用水杨酸合成了中间体I，即

二、在250mL圆底烧瓶中依次加入7.428g(48.8mmol)中间体I、50mL无水乙醇以及17.78g(178mmol)质量百分浓度为50％的水合肼，再搅拌并加热至沸腾回流反应12 h。旋蒸除去乙醇，用去离子水重结晶，得到3.411g中间体Ⅱ；中间体Ⅱ的收率为47％，熔点：144.5～145.6℃，将中间体Ⅱ进行分析，结果如下：FTIR(KBr)v(cm^-1):3647,3320, 3262,3060,2773,2669,2584,1965,1926,1886,1809,1659,1587,1535,1495,1437,1359。步骤二中利用中间体I与50％水合肼合成了中间体Ⅱ，即

三、向250mL圆底烧瓶中加入145mL 1,4-二氧六环，加热至60℃，再加入3.130g(28.2mmol)二氧化硒；称取3.094g(19.4mmol)8-羟基喹哪啶溶解于10mL 1,4-二氧六环，缓慢滴入反应液。在温度为97℃且氮气保护条件下继续反应约12h，冷却静置；过滤，将滤液旋干，产物用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体Ⅲ；中间体Ⅲ的产量为1.217g，收率38％，熔点：96.5～98.2℃，将中间体Ⅲ进行分析，结果如下：FTIR (KBr)v(cm^-1):3425,3372,3060,2838,1952,1704,1626,1594,1561,1495,1463。步骤三中利用8-羟基喹哪啶与二氧化硒合成了中间体Ⅲ，即

四、向反应瓶中加入0.095g(0.55mmol)中间体Ⅲ、15mL无水乙醇及0.119g(0.78mmol)中间体Ⅱ，搅拌并加热至沸腾回流反应4.5h，反应混合物冷却静置，有浅黄色固体析出，用无水乙醇洗涤后烘干，得到中间体Ⅳ；中间体Ⅳ的产量0.095g，收率62％，熔点：258.2～261.5℃。将中间体Ⅳ进行结构分析，结果如下：¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆) δ(ppm):12.173(s,1H),11.615(s,1H),9.863(s,1H),8.636(s,1H),8.371(d,J＝4.5Hz,1H), 8.113(d,J＝4.2Hz,1H),7.886(d,J＝3.6Hz,1H),7.474(dd,J＝3.9Hz,3.3Hz,2H),7.430 (d,J＝3.9Hz,1H),7.145(d,J＝3.9Hz,1H),6.996(dd,J＝3.9Hz,3.6Hz,2H).¹³C NMR (150MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):165.50,159.19,153.93,152.02,148.99,138.63,137.14,134.36, 129.37,129.33,128.91,119.51,118.32,118.22,117.71,117.00,112.67.FTIR(KBr)v(cm^-1): 3743,3467,3407,3251,3052,2730,2588,1947,1646,1600,1535,1503,1463.ESI-MS m/z [M+H]⁺:Calcd.:308.1035,Found:308.1022。从分析结果可知，中间体Ⅳ的结构式为

五、配制100mL浓度为1.0×10^-5mol/L的中间体Ⅳ的DMF溶液，然后在其中加入 100μL浓度为0.010mol/L Fe³⁺水溶液，超声30min，静置，得到识别和检测草酸的荧光分子探针；该复合型草酸荧光分子探针已均匀分布在DMF中，可直接对草酸含量进行检测。中间体Ⅳ与Fe³⁺在DMF溶液中形成了稳定的1：1配合物，即识别和检测草酸的荧光分子探针，其结构为

实施例2制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMF 溶液中，分别加入常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、草酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，草酸对该探针的荧光光谱影响显著，其它常见有机酸和氨基酸对光谱没有明显影响。在空白溶液中，探针的荧光强度很弱，当草酸加入使探针荧光光谱500nm处的荧光增强。在常见有机酸和氨基酸中探针单一荧光增强识别草酸。

实施例2制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMF 溶液中，加入草酸，超声，静置，草酸水溶液的浓度为探针浓度的5倍，再分别加入其它常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、 L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，当其它有机酸或氨基酸与草酸共同存在时，探针的发射波长与荧光强度基本没有明显改变，识别与检测能力没有受到明显影响。结果表明，探针对草酸的响应不仅选择性好，而且抗干扰能力较强，是一个比较理想的高选择性荧光增强识别草酸的荧光分子探针。

实施例2制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其DMF 溶液中，不断搅拌的条件下，加入草酸，草酸加入的浓度为0～38μmol/L，测试不同草酸浓度条件下探针的荧光光谱，结果显示，随着草酸浓度的增大，探针在荧光光谱中，发射波长为500nm，且荧光强度逐渐增强，当草酸浓度约为29μmol/L时，吸收强度与荧光强度均趋于平稳，不再有显著性变化。探针荧光强度与草酸浓度呈现良好的线性关系，并根据标准线性关系，可以计算探针对草酸的检出限(LOD)为1.32×10^-7mol/L，由此可见本实施例制备的荧光探针可以定量检测草酸。

实施例2制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，对自来水进行了草酸加标回收实验。分别移取0、0.3、0.5、0.7μL浓度为0.050mol/L草酸水溶液作为标样，再分别向其中加入3μL自来水，最后加入探针DMF溶液，测试荧光光谱。结合标准曲线，根据荧光强度计算回收率。实验结果如表2，草酸在在自来水中的加标回收率为98.2％～99.3％。说明采用该探针对草酸定量检测效果较好，可应用于实际样品溶液中草酸的定量检测。

表2为自来水样品中探针检测草酸的加标回收率

a测定平均值(n＝3)

实施例3：本实施例的识别和检测草酸的荧光分子探针的制备方法，按以下步骤进行：

一、向250mL圆底烧瓶中依次加入15.3g(0.11mol)水杨酸、80mL甲醇、12mL质量百分浓度为98％的浓硫酸，在氮气保护下搅拌并加热至沸腾回流保持13h。冷却至室温，旋蒸除去甲醇，用水多次洗涤；再用二氯甲烷萃取，无水硫酸钠干燥过夜，用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体I；中间体I的产量8.120g，收率49％。中间体 I的性状为液体，直接用于下一步合成。步骤一中直接利用水杨酸合成了中间体I，即

二、在250mL圆底烧瓶中依次加入7.430g(48.8mmol)中间体I、50mL无水乙醇以及20.38g(204mmol)质量百分浓度为50％的水合肼，再搅拌并加热至沸腾回流反应11 h。旋蒸除去乙醇，用去离子水重结晶，得到3.484g中间体Ⅱ；中间体Ⅱ的收率为48％，熔点：144.5～145.6℃，将中间体Ⅱ进行分析，结果如下：FTIR(KBr)v(cm^-1):3647,3320, 3262,3060,2773,2669,2584,1965,1926,1886,1809,1659,1587,1535,1495,1437,1359。步骤二中利用中间体I与50％水合肼合成了中间体Ⅱ，即

三、向250mL圆底烧瓶中加入160mL 1,4-二氧六环，加热至60℃，再加入5.217g(47.0mmol)二氧化硒；称取3.090g(19.4mmol)8-羟基喹哪啶溶解于10mL 1,4-二氧六环，缓慢滴入反应液。在温度为98℃且氮气保护条件下继续反应约8h，冷却静置；过滤，将滤液旋干，产物用二氯甲烷淋洗，过硅胶柱色谱分离，得到中间体Ⅲ；中间体Ⅲ的产量为1.345g，收率42％，熔点：96.5～98.2℃，将中间体Ⅲ进行分析，结果如下：FTIR(KBr) v(cm^-1):3425,3372,3060,2838,1952,1704,1626,1594,1561,1495,1463。步骤三中利用8- 羟基喹哪啶与二氧化硒合成了中间体Ⅲ，即

四、向反应瓶中加入0.093g(0.54mmol)中间体Ⅲ、15mL无水乙醇及0.159g(1.05mmol)中间体Ⅱ，搅拌并加热至沸腾回流反应3.5h，反应混合物冷却静置，有浅黄色固体析出，用无水乙醇洗涤后烘干，得到中间体Ⅳ；中间体Ⅳ的产量0.098g，收率64％，熔点：258.2～261.5℃。将中间体Ⅳ进行结构分析，结果如下：¹H NMR(600MHz,DMSO-d₆) δ(ppm):12.173(s,1H),11.615(s,1H),9.863(s,1H),8.636(s,1H),8.371(d,J＝4.5Hz,1H), 8.113(d,J＝4.2Hz,1H),7.886(d,J＝3.6Hz,1H),7.474(dd,J＝3.9Hz,3.3Hz,2H),7.430 (d,J＝3.9Hz,1H),7.145(d,J＝3.9Hz,1H),6.996(dd,J＝3.9Hz,3.6Hz,2H).¹³C NMR (150MHz,DMSO-d₆)δ(ppm):165.50,159.19,153.93,152.02,148.99,138.63,137.14,134.36, 129.37,129.33,128.91,119.51,118.32,118.22,117.71,117.00,112.67.FTIR(KBr)v(cm^-1): 3743,3467,3407,3251,3052,2730,2588,1947,1646,1600,1535,1503,1463.ESI-MS m/z [M+H]⁺:Calcd.:308.1035,Found:308.1022。从分析结果可知，中间体Ⅳ的结构式为

五、配制100mL浓度为1.0×10^-5mol/L的中间体Ⅳ的T溶液，然后在其中加入100μL浓度为0.010mol/L Fe³⁺水溶液，超声30min，静置，得到识别和检测草酸的荧光分子探针；该复合型草酸荧光分子探针已均匀分布在THF中，可直接对草酸含量进行检测。中间体Ⅳ与Fe³⁺在THF溶液中形成了稳定的1：1配合物，即识别和检测草酸的荧光分子探针，其结构为

实施例3制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其THF 溶液中，分别加入常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、草酸、L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、 L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，草酸对该探针的荧光光谱影响显著，其它常见有机酸和氨基酸对光谱没有明显影响。在空白溶液中，探针的荧光强度很弱，当草酸加入使探针荧光光谱500nm处的荧光增强。荧光响应具有高选择性，在常见有机酸和氨基酸中探针单一荧光增强识别草酸。

实施例3制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其THF 溶液中，加入草酸，超声，静置，草酸水溶液的浓度为探针浓度的5倍，再分别加入其它常见有机酸或氨基酸：甲酸、乙酸、苯甲酸、水杨酸、酒石酸、琥珀酸、扁桃酸、柠檬酸、 L-蛋氨酸、L-色氨酸、L-脯氨酸、L-精氨酸、L-天冬氨酸、L-苯丙氨酸、L-苏氨酸、L-丝氨酸、L-赖氨酸、L-缬氨酸、L-组氨酸、L-酪氨酸、L-白氨酸、L-半胱氨酸、L-谷氨酸。有机酸或氨基酸溶液的浓度为探针浓度的5倍，测定其荧光光谱，当其它有机酸或氨基酸与草酸共同存在时，探针的发射波长与荧光强度基本没有明显改变，识别与检测能力没有受到明显影响。结果表明，探针对草酸的响应不仅选择性好，而且抗干扰能力较强，是一个比较理想的高选择性荧光增强识别草酸的荧光分子探针。

实施例3制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，在其THF 溶液中，不断搅拌的条件下，加入草酸，草酸加入的浓度为0～38μmol/L，测试不同草酸浓度条件下探针的荧光光谱，结果显示随着草酸浓度的增大，探针在荧光光谱中，发射波长为500nm，且荧光强度逐渐增强，当草酸浓度约为30μmol/L时，吸收强度与荧光强度均趋于平稳，不再有显著性变化。探针荧光强度与草酸浓度呈现良好的线性关系，并根据标准线性关系，可以计算探针对草酸的检出限(LOD)为1.35×10^-7mol/L，由此可见本实施例制备的荧光探针可以定量检测草酸。

实施例3制备的识别和检测草酸的荧光分子探针的浓度为1.0×10^-5mol/L，对菠菜提取液进行了草酸加标回收实验。分别移取0、0.3、0.5、0.7μL浓度为0.050mol/L草酸水溶液作为标样，再分别向其中加入3μL菠菜提取液，最后加入探针THF溶液，测试荧光光谱。结合标准曲线，根据荧光强度计算回收率。实验结果如表3，草酸在菠菜提取液中的加标回收率为96.7％～98.6％。说明采用该探针对草酸定量检测效果较好，可应用于实际样品溶液中草酸的定量检测。

表3为菠菜提取液样品中探针检测草酸的加标回收率

a测定平均值(n＝3)。