阅读说明：本技术 抗菌肽dn6nh2及其应用 (Antibacterial peptide DN6NH2And uses thereof ) 是由 王建华 王秀敏 王振龙 李婷 韩卉卉 毛若雨 杨娜 郝娅 马炫炫 于 2020-04-16 设计创作，主要内容包括：本发明涉及新型的抗菌肽DN6NH<Sub>2</Sub>及其应用。抗菌肽DN6NH<Sub>2</Sub>是在抗菌肽N6的C末端羧基经酰胺化修饰得到的,且除了甘氨酸之外,其余氨基酸均为D型氨基酸。抗菌肽DN6NH<Sub>2</Sub>可显著提高母体肽N6NH<Sub>2</Sub>对蛋白酶和血清的稳定性,对多重耐药维氏气单胞菌具有快速杀菌、无反弹的杀菌特点,同时兼具低细胞毒性和低溶血性。DN6NH<Sub>2</Sub>在体外能够抑制维氏气单胞菌生物被膜的形成；在体内它能够显著改善小鼠因感染维氏气单胞菌生物膜而引发的背部皮肤脓肿坏死现象,其效果优于母体肽和环丙沙星。实验结果表明,DN6NH<Sub>2</Sub>明显改善了N6NH<Sub>2</Sub>的酶解稳定性和生物活性。抗菌肽DN6NH<Sub>2</Sub>是极具应用价值的小分子多肽,具有广阔的应用前景。(The invention relates to a novel antibacterial peptide DN6NH 2 And applications thereof. Antibacterial peptide DN6NH 2 Is obtained by amidation modification of carboxyl at the C terminal of antibacterial peptide N6, and the other amino acids except glycine are D-type amino acids. Antibacterial peptide DN6NH 2 Can obviously improve the parent peptide N6NH 2 Has the characteristics of quick sterilization and no rebound sterilization on multiple drug-resistant Aeromonas veronii, and has low cytotoxicity and low hemolysis. DN6NH 2 Can inhibit the formation of aeromonas veronii biofilm in vitro; in vivo, the composition can obviously improve the phenomenon of back skin abscess necrosis of mice caused by infection of Aeromonas veronii biomembranes, and the effect is superior to that of parent peptide and ciprofloxacin. The experimental result shows that DN6NH 2 Obviously improves N6NH 2 Stabilization of enzymatic hydrolysisSex and biological activity. Antibacterial peptide DN6NH 2 Is a micromolecular polypeptide with great application value and has wide application prospect.)

抗菌肽DN6NH2及其应用

技术领域

本发明涉及生物医药领域，具体地说，涉及抗菌肽DN6NH₂及其应用。

背景技术

抗菌肽(AMPs)多为线性或环状结构的阳离子两亲性分子，其长度一般小于100 个氨基酸，几乎存在于所有的生物体中，是宿主先天免疫系统的组成部分。以天然抗菌肽作为模板合成的模拟肽数量已经达到数千条之多。它们已被证明具有广泛的生物活性(抗细菌、真菌、原生动物、病毒、寄生虫和肿瘤等)。与传统的抗生素相比，抗菌肽对病原菌具有多个作用靶点、低耐药性等特点，因此被认为是抗生素的理想替代品之一。抗菌肽除具有抗菌功能外，还能够抑制细菌生物膜形成、中和细菌内毒素；同时，还具有免疫调节、抑制细胞凋亡、促进血管生成和伤口愈合等功能，对人、动物的健康发挥着重要的作用。

维氏气单胞菌是一种人、畜和鱼共患病病原菌。相关研究报道指出，维氏气单胞菌是造成鱼类感染发病的重要致病源之一。它可以感染多种鱼类，临床症状主要表现为鱼体全身发黑，体表、鳍条严重出血，并形成溃疡灶；病情严重的鱼类鳃丝严重坏死，呈灰褐色腐烂，腹腔有大量淡黄色腹水。近年来由于抗生素的滥用致使维氏气单胞菌的耐药性不断增强，这对我国的国民健康及水产养殖业已构成潜在威胁。因此，迫切需要开发新型的抗菌药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的抗菌肽DN6NH₂及其应用。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种抗菌肽DN6NH₂，抗菌肽 DN6NH₂是在抗菌肽N6的C末端羧基经酰胺化修饰得到的，且除了甘氨酸之外，其余氨基酸均为D型氨基酸。

抗菌肽DN6NH₂的结构如下：

本发明的抗菌肽DN6NH₂为人工设计合成的活性多肽，包含21个氨基酸残基。抗菌肽DN6NH₂的分子量为2474.88Da，氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

第二方面，本发明提供含有抗菌肽DN6NH₂的广谱抗菌药物或组合物。

第三方面，本发明提供含有抗菌肽DN6NH₂的防腐剂或杀菌剂。

第四方面，本发明提供抗菌肽DN6NH₂的以下任一应用：

1)用于制备广谱抗菌药物或组合物；

2)用于制备防腐剂；

3)用于制备杀菌剂。

所述菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。

所述菌包括但不限于葡萄球菌属(Staphylococcus)、埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、气单胞菌属(Aeromonas)细菌。

优选地，所述菌包括猪葡萄球菌(Staphylococcus hyicus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichia coli)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphimurium)、鸡白痢沙门氏菌(Salmonella pullorum)、肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、维氏气单胞菌(Aeromonasveronii)等。

第五方面，本发明提供抗菌肽DN6NH₂在制备治疗或预防维氏气单胞菌及其生物膜引起的感染以及由其感染所致相关疾病的生物制品中的应用。

所述疾病包括由维氏气单胞菌产生的生物膜引起的皮下脓肿。

借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：

本发明提供的抗菌肽DN6NH₂可显著提高母体肽N6NH₂(抗菌肽N6的C末端羧基经酰胺化修饰得到，GFAWNVCVYRNGVRVCHRRAN-NH₂)对蛋白酶和血清的稳定性，对多重耐药维氏气单胞菌具有快速杀菌、无反弹的杀菌特点，同时兼具低细胞毒性和低溶血性。DN6NH₂在体外能够抑制维氏气单胞菌生物被膜的形成；在体内，它能够显著改善小鼠因感染维氏气单胞菌生物膜而引发的背部皮肤脓肿坏死现象，其效果优于母体肽和环丙沙星。实验结果表明，DN6NH₂明显改善了N6NH₂的酶解稳定性和生物活性。DN6NH₂分子量小，易于人工合成，是极具应用价值的小分子多肽，可用于制备新型抗菌剂，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1中抗菌肽DN6NH₂的质谱图。

图2为本发明实施例3中抗菌肽DN6NH₂对临床分离菌株维氏气单胞菌L1杀菌动力曲线。

图3为本发明实施例5中抗菌肽DN6NH₂的血清稳定性检测结果。

图4为本发明实施例6中抗菌肽DN6NH₂的细胞毒性测定结果。

图5为本发明实施例7中抗菌肽DN6NH₂的溶血性测定结果。

图6为本发明实施例8中抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌初生膜的影响。

图7为本发明实施例9中抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌成熟膜的影响。

图8为本发明实施例10中抗菌肽DN6NH₂对小鼠体内维氏气单胞菌数量的影响。

图9为本发明实施例11中抗菌肽DN6NH₂对小鼠体内生物膜的疗效。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。

实施例1抗菌肽DN6NH₂的设计与合成

(1)以N6NH₂母体肽序列为基础，对抗菌肽N6NH₂中除了甘氨酸以外的其它氨基酸替换成D型氨基酸获得D型N6NH₂，以提高抗菌肽对蛋白酶的稳定性。

(2)抗菌肽合成采用固相合成法，通过十二通道半自动多肽合成仪进行合成。反向高效液相色谱C18柱测定合成肽纯度(>90％)，ESI-MS质谱确认衍生肽DN6NH₂的分子量为2474.88Da，DN6NH₂的质谱图如图1所示。

实施例2抗菌肽DN6NH₂的抑菌实验

实施例中的病原菌均来自于中国兽医微生物菌种保藏管理中心(CVCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、美国模式培养物集存库(ATCC)及临床分离株系，具体菌株如表1所示。

抗菌肽的最小抑菌浓度(MIC，minimum inhibitory concentration)的测定参照临床和实验室标准协会(CLSI，Clinical and Laboratory Standards Institute)制定的方法 (WIEGAND等，Agar and broth dilution methods to determine the minimalinhibitory concentration(MIC)of antimicrobial substances.Nature protocols,2008,3(2):163-175)，根据具体情况略有改动，操作细节如下：

将受试菌株的单菌落挑至MHB液体培养基中，37℃ 250rpm振荡过夜培养活化后，转接至MHB液体培养基中培养至对数生长期，然后制备成10⁵CFU/ml的菌液，加入96孔无菌细胞培养板内，每孔90μl。用PBS通过2倍倍比稀释法对抗菌肽进行稀释，每孔10μl抗菌肽，使其终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、 0.125和0.0625μg/ml，阴性对照组为PBS的受试菌液，空白对照组为无菌MH培养基。每个处理三个平行样。将培养板置于37℃恒温培养箱孵育16～18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，能够完全抑制细菌生长的最低浓度即为抗菌肽对受试菌株的MIC值。如出现跳孔或平行样间结果不一致情况，则重新测试。

结果如表1所示，抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌的MIC值为1.62～25.86μM，对大肠杆菌、沙门氏菌的MIC值为0.81～6.46μM；对铜绿假单胞菌的MIC值为3.23μM；对金黄色葡萄球菌、猪葡萄球菌的MIC值为1.62～6.46μM，这说明DN6NH₂具有广谱抗菌性能。DN6NH₂与母体肽N6NH₂对革兰氏阴性菌的抑菌效果相当；DN6NH₂对革兰氏阳性菌的抑菌效果优于母体肽N6NH₂。

表1抗菌肽DN6NH₂的MIC值测定

注：a为中国农业科学院南口试验基地加州鲈鱼肝组织临床分离株系；b为天津猪场临床分离株系；维氏气单胞菌L1分别对亚胺培南、美罗培南、四环素、甲氧苄氨嘧啶等抗生素呈现耐药性，对环丙沙星、诺氟沙星、氧氟沙星等喹诺酮类抗生素高度敏感。

实施例3抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌L1的体外杀菌动力学测定

挑取维氏气单胞菌L1单菌落接种于MHB液体培养基，过夜培养，然后以1％转接于10ml新鲜的MHB液体培养基中，培养至对数期(37℃，250rpm)，稀释菌液至 1×10⁵CFU/ml，备用。取适量上述菌液，分别加入抗菌肽溶液，使其终浓度分别为 1×MIC、2×MIC和4×MIC，同时设置等体积的PBS和2×MIC终浓度的环丙沙星(CIP) 分别作为阴性和阳性对照，放置摇床中培养(37℃，250rpm)。随后，在0、0.5、1、 2、4、6、8、10、20和24h时间点分别取100μl菌液样品，按照梯度稀释后涂固体琼脂平板，37℃倒置培养16～18h，菌落计数，绘制时间-杀菌曲线。

结果如图2所示，DN6NH₂的抗菌效果具有时间与浓度依赖性。其中2×MIC DN6NH₂在1h内将维氏气单胞菌L1全部杀死；相比较，2×MIC N6NH₂在8h内才杀死全部细菌，2×MIC环丙沙星在2h后就开始反弹，未能杀死细菌，这说明DN6NH₂的杀菌效率优于N6NH₂和环丙沙星。

实施例4抗菌肽DN6NH₂的蛋白酶解稳定性测定

选用胃蛋白酶(3000U/mg，pH 2.0，华美生物)、胰蛋白酶(250U/mg，pH 8.0，华美生物)和蛋白酶K(40mAU/mg，pH 7.0，华美生物)分别与抗菌肽的冻干粉按 1:10(w/w)的比例溶解于上述酶对应的最适缓冲液中，37℃静置孵育3h，取10μl加入90μl对数期(1×10⁵CFU/ml)维氏气单胞菌L1菌液中，使抗菌肽的终浓度为 128～0.0625μg/ml；取对应的缓冲液作为对照，37℃恒温培养箱孵育16～18h，直至阴性对照孔出现肉眼可见的明显浑浊菌液，观察经不同蛋白酶处理后肽的MIC改变情况。

结果如表2所示，DN6NH₂经胃蛋白酶(Pepsin)、胰蛋白酶(Trypsin)和蛋白酶 K(Proteinase K)处理后，其MIC值未发生改变；母体肽N6NH₂经胰蛋白酶和蛋白酶 K处理后，均失去抑菌活性，说明通过D型氨基酸替换修饰可明显提高母体肽N6NH₂抵抗蛋白酶的能力，显著提高了抗菌肽的临床应用价值。

表2抗菌肽DN6NH₂的蛋白酶稳定性测定

实施例5抗菌肽DN6NH₂的血清稳定性测定

将抗菌肽溶液加入小鼠血清中(37℃)进行孵育，分别孵育0、30、60、120、 270和360min后取样，通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)方法检测血清中残留的抗菌肽含量。

结果如图3所示，抗菌肽的血清稳定性与孵育时间成反比，将抗菌肽在小鼠血清中孵育6h后，发现DN6NH₂、N6NH₂的肽含量分别为84.25％和41.93％，这表明DN6NH₂在血清中的稳定性明显高于其母体肽N6NH₂。

实施例6抗菌肽DN6NH₂的细胞毒性测定

将RAW 264.7细胞培养于含有10％胎牛血清的DMEM培养基中，在37℃、5％CO₂及饱和湿度条件下的培养箱中培养。细胞生长到对数期时，先用0.25％胰酶消化单层细胞，再用含10％小牛血清的DMEM培养基重悬细胞，以5×10⁴个/ml密度接种于96孔板中，每孔100μl；设置3～5个副孔，放入CO₂恒温培养箱中培养24h后移除培养基；用PBS清洗两遍后，每孔按浓度梯度加入100μl浓度为0.5、1、2、4、8、16、32、64 和128μg/ml的抗菌肽溶液。不含有抗菌肽的细胞作为阳性对照，不含抗菌肽和细胞的作为阴性对照。将细胞继续孵育24h后，吸取孔内培养基，用PBS洗两遍，每孔中加入20μl浓度为5mg/ml的MTT，放到培养箱继续培养4h。轻轻吸弃MTT液，加入150 μl DMSO，微量振荡器振荡10min后，待孔底结晶完全溶解，酶标仪570nm波长处测各孔吸光度(OD值)。根据如下公式计算细胞增殖抑制指数(IR)：

存活率(％)＝OD_抗菌肽/OD_阴性对照×100％

结果如图4所示，浓度＜64μg/ml时几乎没有细胞毒性，在浓度为128μg/ml时，DN6NH₂和N6NH₂的细胞存活率分别为87.33％和94.38％，说明它们在低浓度时对动物正常组织细胞几乎没有毒害作用。

实施例7抗菌肽DN6NH₂的溶血性测定

取6周龄SPF级的ICR雌鼠，眼球取血，使用肝素钠抗凝管收集。采集的血液于4℃、1500rpm离心10min，用10mM PBS(pH7.3)重复洗涤红细胞三次，至上清无色透明，并稀释成8％的红细胞悬浮液。将抗菌肽溶解于无菌0.9％生理盐水中，配置成浓度为512μg/ml的母液，并按2倍倍比稀释至终浓度为2μg/ml。将100μl红细胞悬浮液与不同梯度浓度的抗菌肽溶液分别加入到96孔板中，使红细胞终浓度为4％。将混合液至于37℃恒温培养箱静置孵育1h，随后在4℃、1500rpm条件下离心5min，将上清吸取至96孔板中，使用酶标仪在540nm下检测紫外吸光值。生理盐水和0.1％Triton X-100分别作为0％和100％溶血率的对照组。溶血程度计算公式如下：

溶血率(％)＝[(Abs540 nm_抗菌肽-Abs540 nm_生理盐水)/(Abs540 nm _{0.1％Triton X-100}-Abs540 nm_生理盐水)]×100％

结果如图5所示，浓度在1～256μg/ml范围内的DN6NH₂和N6NH₂对血红细胞几乎没有影响；在256μg/ml浓度下，DN6NH₂和N6NH₂溶血率分别为1.45％和0.24％，这说明新型抗菌肽DN6NH₂和母体肽N6NH₂几乎没有溶血性，作为静脉注射药物使用时是安全的。

实施例8抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌L1初生膜影响的测定

将维氏气单胞菌L1稀释于TSB培养基中(浓度为1×10⁸CFU/ml)，并在96孔板中进行培养(每孔200μl菌液)，随后加入2倍稀释的DN6NH₂、N6NH₂和环丙沙星，使之终浓度分别为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC和16×MIC。未加抗菌物质的孔为阴性对照孔，新鲜TSB培养基孔为空白对照孔。将培养板放入37℃培养箱中培养24h后，用移液枪将每孔中的上清小心吸弃，之后PBS清洗3次，自然晾干。随后每孔加入200μl 2.5％戊二醛固定液，90min后弃掉固定液，再用PBS洗两次。用 0.1％结晶紫100μl染色15min，用蒸馏水冲去染液，室温干燥，最后用200μl 95％乙醇溶解30min，测定每个孔在波长为570nm时的OD值。

结果如图6所示，用16×MIC抗菌肽处理后，维氏气单胞菌L1的初生膜分别降低到28.67％(DN6NH₂)和42.41％(N6NH₂)，表明DN6NH₂抑制早期膜形成的能力高于母体肽，但是略低于抗生素(19.25％)。这表明DN6NH₂能够明显地抑制维氏气单胞菌L1初生膜的形成。

实施例9抗菌肽DN6NH₂对维氏气单胞菌L1成熟膜影响的测定

将维氏气单胞菌L1稀释于TSB培养基中浓度为1×10⁸CFU/ml，并在96孔板中进行培养,在37℃培养箱培养24h形成成熟生物膜后，再加入连续2倍稀释的DN6NH₂、 N6NH₂和环丙沙星，使之终浓度分别为0.5×MIC、1×MIC、2×MIC、4×MIC、8×MIC 和16×MIC，未加抗菌物质的孔为阴性对照孔，新鲜TSB培养基孔为空白对照孔，随后继续在37℃培养箱培养24h。孵育结束后用移液枪将每孔中的上清小心吸弃，之后 PBS清洗3次，自然晾干。随后每孔加入200μl 2.5％戊二醛固定液，固定90min后弃掉固定液，再用PBS洗两次。用0.1％结晶紫100μl染色15min，用蒸馏水冲去染液，室温干燥，最后用200μl 95％乙醇溶解30min，测定每个孔在波长为570nm时的OD 值。

结果如图7所示，用16×MIC DN6NH₂与N6NH₂处理维氏气单胞菌L1成熟膜后，维氏气单胞菌L1的成熟膜分别降低到8.10％(DN6NH₂)和8.43％(N6NH₂)。用16×MIC 的环丙沙星处理后，维氏气单胞菌L1的成熟膜降低至10.12％。这表明DN6NH₂能够抑制维氏气单胞菌L1的成熟生物膜，其效果优于母体肽和环丙沙星。

实施例10抗菌肽DN6NH₂对小鼠体内维氏气单胞菌量的影响

利用ICR雌性小鼠(SPF级，20g)构建体内生物膜模型：首先用异氟烷将小鼠麻醉后，将孵育好维氏气单胞菌L1生物膜的导管植入到小鼠背部两侧，并用缝合针将伤口缝合，感染24h后作为体内生物模型。随后，将小鼠分为四个处理组，每组6 只小鼠，通过小鼠背部分别注射5μmol/kg DN6NH₂、N6NH₂与环丙沙星；攻菌未治疗组作为阴性对照，植入无菌导管组作为空白对照(CK)。7天后将小鼠麻醉处死，采集小鼠背部中的导管，在无菌PBS中进行充分震荡，通过菌落计数法评价抗菌肽 DN6NH₂对小鼠体内维氏气单胞菌量的影响。

结果如图8所示，用5μmol/kg DN6NH₂处理后，导管中的细菌细胞数比阴性对照组减少了约4个数量级，DN6NH₂、N6NH₂、环丙沙星处理组均与阴性对照组出现了显著性差异，而且DN6NH₂的杀菌效果优于N6NH₂，环丙沙星的杀菌效果最差。这些结果表明，抗菌肽DN6NH₂不仅能够抑制生物膜的形成，而且可以杀灭小鼠体内的维氏气单胞菌，其效果优于母体肽和环丙沙星。

实施例11抗菌肽DN6NH₂对小鼠体内生物膜的疗效

利用ICR雌性小鼠(SPF级，20g)构建体内生物膜模型和药物治疗处理同实施例10。7天后将小鼠麻醉处死，将获取的皮肤组织用4％多聚甲醛进行固定，将上述固定的皮肤组织用蒸馏水冲洗10～20min，用以除去多聚甲醛，然后选用乙醇进行梯度脱水，随后用1:1的无水乙醇和二甲苯混合液处理30min，再用二甲苯作用30min用以透明化，将透明剂包裹着的组织进行浸蜡，-20℃冷却，待石蜡凝固后将组织埋在蜡块里。用切片机将上述蜡块进行切片，控制厚度约为4μm，将自然展平的切片放置在载玻片上，于烘箱中60℃烘烤15～30min；将载片依次放入二甲苯-无水乙醇-96％乙醇-90％乙醇-80％乙醇-70％乙醇进行不同时间的脱蜡处理，再用蒸馏水进行水洗、伊红染色，最后进行系列脱水。选用中性树胶封片，于35～38℃烘箱中烘干。将制备好的载玻片放置在OLYMPUS BX43显微镜下，分别以100和200的放大倍数下观察小鼠皮肤形态。

结果如图9所示，空白对照(CK)组的小鼠皮肤组织未见异常，说明无菌导管的植入不会对小鼠皮肤组织产生影响；植入维氏气单胞菌L1生物膜导管的阴性对照组中表皮内淋巴细胞浸润，局部部位出现明显的炎症，表皮细胞间连接缺损明显，局部可见轻度汗腺、皮脂腺炎症，表皮下纤维组织轻度增生，并且炎症范围相对较大，出现深部软组织炎症，这说明维氏气单胞菌生物膜严重破坏了小鼠的皮肤组织。用抗菌肽DN6NH₂治疗后，小鼠背部皮肤状况出现明显改善，表皮内只有少量淋巴细胞浸润(表皮内轻微炎症)，炎症只局限于表皮下真皮组织，未见深部软组织炎症；经过N6NH₂治疗后，小鼠背部皮肤状况也出现改善，表皮内只见少量淋巴细胞浸润(表皮内轻微炎症)，局部表皮细胞间连接缺损，炎症局限于表皮下真皮组织，未见深部软组织炎症；在环丙沙星治疗组中，小鼠背部皮肤同样出现改善，表皮内只见少量淋巴细胞浸润(表皮内轻微炎症)，局部表皮细胞间连接缺损，表皮下纤维组织轻度增生，炎症局限于表皮下真皮组织，未见深部软组织炎症。因此，对于维氏气单胞菌生物膜的体内实验，DN6NH₂不仅具有较好的杀菌效果，而且能够明显改善小鼠背部皮肤炎症状况，其效果优于母体肽和抗生素。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列表

<110> 中国农业科学院饲料研究所

<120> 抗菌肽DN6NH2及其应用

<130> KHP201111121.0

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Phe Ala Trp Asn Val Cys Val Tyr Arg Asn Gly Val Arg Val Cys

1 5 10 15

His Arg Arg Ala Asn

20