阅读说明：本技术 一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法 (Heart-strengthening anti-fatigue polymer nano-particles and preparation method thereof ) 是由 汤佳鹏 葛彦 朱俐 胡亦雯 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法,将对甲苯磺酸和硼酸溶于DMF中制得复合催化剂；随后将DL-酒石酸、丹参素、咖啡酸、阿魏酸、二十八烷醇、CTAB分别依次加入甲苯中,油浴加热,搅拌至DL-酒石酸溶解后,滴加氯化亚砜,再滴加复合催化剂,加热回流,反应过程中分出多余水,直到没有多余的水产生时反应结束；反应结束后,减压除溶剂得到固体粉末,用乙酸乙酯回流带走残留溶剂,饱和NaHCO<Sub>3</Sub>水溶液和蒸馏水洗涤后离心,干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒。本发明强心抗疲劳聚合物纳米颗粒以DL-酒石酸和丹参素作为聚合中心,接枝咖啡酸、阿魏酸和二十八烷醇,具有长循环效果,能够一次大剂量给药,长期维持体内药物浓度,获得理想的缓释效果。(The invention discloses a cardiotonic anti-fatigue polymer nanoparticle and a preparation method thereof, wherein p-toluenesulfonic acid and boric acid are dissolved in DMF to prepare a composite catalyst; sequentially adding DL-tartaric acid, tanshinol, caffeic acid, ferulic acid, octacosanol and CTAB into toluene respectively, heating in an oil bath, stirring until the DL-tartaric acid is dissolved, dropwise adding thionyl chloride, dropwise adding a composite catalyst, heating and refluxing, and separating excessive water in the reaction process until no excessive water is generated, wherein the reaction is finished; after the reaction is finished, decompressing and removing the solvent to obtain solid powder, refluxing and taking away residual solvent by ethyl acetate, and taking saturated NaHCO 3 And washing the aqueous solution and the distilled water, centrifuging and drying to obtain the cardiotonic anti-fatigue polymer nanoparticles. The cardiotonic anti-fatigue polymer nanoparticle takes DL-tartaric acid and danshensu as polymerization centers, is grafted with caffeic acid, ferulic acid and octacosanol, has a long circulation effect, can be administered at a large dose once, maintains the in-vivo drug concentration for a long time, and obtains an ideal slow release effect.)

一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法

技术领域

本发明属于药物制剂领域，涉及一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法。

背景技术

心力衰竭简称心衰，是指由于心脏的收缩功能和(或)舒张功能发生障碍，不能将静脉回心血量充分排出心脏，导致静脉系统血液淤积，动脉系统血液灌注不足，从而引起心脏循环障碍症候群，此种障碍症候群集中表现为肺淤血、腔静脉淤血。心力衰竭并不是一个独立的疾病，而是心脏疾病发展的终末阶段，致残率及死亡率高，严重影响患者的生活质量和预后。

疲劳是一种主观不适感觉，但客观上会在同等条件下，失去其完成原来所从事的正常活动或工作能力。过度疲劳可能是心力衰竭的诱因之一。持续的疲劳可能是心衰的一个表现。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法，该强心抗疲劳聚合物纳米颗粒具有缓慢释放性能，能保持长时间药效。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒的制备方法，包括如下步骤：

S1.配制复合催化剂：将对甲苯磺酸和硼酸溶于DMF(二甲基甲酰胺)中制得复合催化剂；

S2.将DL-酒石酸、丹参素、咖啡酸、阿魏酸、二十八烷醇和CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)分别依次加入甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，先缓慢滴加氯化亚砜，然后缓慢滴加复合催化剂，加热回流，温度控制在130-140℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束，减压除溶剂得到固体粉末；

S3.将所述固体粉末在乙酸乙酯中回流3-4小时后减压除去乙酸乙酯，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤2-3次，然后再用蒸馏水洗涤1-2次，获得粗悬液；

S4.将步骤S3获得的粗悬液经离心收集上清液，喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒。

优选的，步骤S1中，对甲苯磺酸、硼酸与DMF的比例为(15.48-18.92)g:(5.56-6.80)g:50ml。

优选的，步骤S2中，所述DL-酒石酸、丹参素、咖啡酸、阿魏酸、二十八烷醇、CTAB和甲苯的用量比例为(13.5-16.5)g:(8.91-10.89)g:(8.1-9.9)g:(8.73-10.67)g:(18.49-22.60)g:(0.08-0.10)g:90ml。

优选的，步骤S2中，所述氯化亚砜加入量为每90ml甲苯加入0.9-1.1ml。

优选的，步骤S2中，所述复合催化剂加入量为每90ml甲苯加入5.6-6.8ml。

优选的，步骤S4中，所述离心的转速为10000-15000r/min。

优选的，步骤S4中，所述喷雾干燥进气温度为180-220℃，出口温度50-80℃，进料速率为5-10ml/s。

本发明还提供了一种上述制备方法制备得到的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒。

优选的，所述强心抗疲劳聚合物纳米颗粒的粒径分布为50-100nm。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

1、本发明利用对甲苯磺酸、硼酸和氯化亚砜三种催化剂催化酒石酸、丹参素、咖啡酸、阿魏酸和二十八烷醇之间的酯化反应，形成以酒石酸、丹参素为核心的共聚高分子纳米颗粒，粒径维持在50-100nm。该反应能获得粒径均一、分散较好的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒。

2、CTAB的加入能够促进反应物在反应介质中的溶解，促进酯化反应的进行，使反应最优化。

3、在体内，强心抗疲劳聚合物纳米颗粒在血浆酯酶的作用下能够被逐步降解，释放出活性分子丹参素、咖啡酸、阿魏酸和二十八烷醇。这些分子在一定浓度时，能够协同改善心功能和解除疲劳。

具体实施方式

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。

本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。

实施例1

(1)配制复合催化剂：将17.2g对甲苯磺酸和6.18g硼酸溶于50ml DMF中制得复合催化剂。

(2)将15gDL-酒石酸、9.9g丹参素、9g咖啡酸、9.7g阿魏酸、20.54g二十八烷醇、0.09g CTAB分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，先缓慢滴加1ml氯化亚砜，然后缓慢滴加6.25ml复合催化剂，加热回流，温度控制在135℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(3)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流3小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次，获得粗悬液。

(4)将步骤(3)获得的粗悬液经12000r/min离心收集上清液，在进口温度200℃、出口温度70℃，进料速率7ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒A。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为68nm，PDI指数为0.104。

实施例2

(1)配制复合催化剂：将15.48g对甲苯磺酸和6.8g硼酸溶于50ml DMF中制得复合催化剂。

(2)将13.5gDL-酒石酸、10.89g丹参素、8.1g咖啡酸、10.67g阿魏酸、18.49g二十八烷醇、0.1g CTAB分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，先缓慢滴加0.9ml氯化亚砜，然后缓慢滴加6.8ml复合催化剂，加热回流，温度控制在130℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(3)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流4小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤2次，用蒸馏水洗涤2次，获得粗悬液。

(4)将步骤(3)获得的粗悬液经10000r/min离心收集上清液，在进口温度220℃、出口温度50℃，进料速率10ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒B。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为100nm，PDI指数为0.201。

实施例3

(1)配制复合催化剂：将18.92g对甲苯磺酸和5.56g硼酸溶于50ml DMF中制得复合催化剂。

(2)将16.5gDL-酒石酸、8.91g丹参素、9.9g咖啡酸、8.73g阿魏酸、22.6g二十八烷醇、0.08g CTAB分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，先缓慢滴加1.1ml氯化亚砜，然后缓慢滴加5.6ml复合催化剂，加热回流，温度控制在140℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(3)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流3小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次，获得粗悬液。

(4)将步骤(3)获得的粗悬液经15000r/min离心收集上清液，在进口温度180℃、出口温度80℃，进料速率5ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒C。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为50nm，PDI指数为0.157。

对比例1(该制备方法中未配制复合催化剂)

(1)将15gDL-酒石酸、9.9g丹参素、9g咖啡酸、9.7g阿魏酸、20.54g二十八烷醇、0.09g CTAB分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，缓慢滴加1ml氯化亚砜，加热回流，温度控制在135℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(2)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流3小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次，获得粗悬液。

(3)将步骤(2)获得的粗悬液经12000r/min离心收集上清液，在进口温度200℃、出口温度70℃，进料速率7ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒D。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为21nm，PDI指数为0.504。

对比例2(该制备方法中甲苯中未加入DL-酒石酸)

(1)配制复合催化剂：将17.2g对甲苯磺酸和6.18g硼酸溶于50ml DMF中制得复合催化剂。

(2)将9.9g丹参素、9g咖啡酸、9.7g阿魏酸、20.54g二十八烷醇、0.09g CTAB分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，先缓慢滴加1ml氯化亚砜，然后缓慢滴加6.25ml复合催化剂，加热回流，温度控制在135℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(3)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流3小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次，获得粗悬液。

(4)将步骤(3)获得的粗悬液经12000r/min离心收集上清液，在进口温度200℃、出口温度70℃，进料速率7ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒E。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为12nm，PDI指数为0.631。

对比例3(该制备方法中甲苯中未加入CTAB)

(1)配制复合催化剂：将17.2g对甲苯磺酸和6.18g硼酸溶于50ml DMF中制得复合催化剂。

(2)将15gDL-酒石酸、9.9g丹参素、9g咖啡酸、9.7g阿魏酸、20.54g二十八烷醇分别依次加入90ml甲苯中，油浴加热，搅拌，当DL-酒石酸溶解后，先缓慢滴加1ml氯化亚砜，然后缓慢滴加6.25ml复合催化剂，加热回流，温度控制在135℃，反应过程中分出多余水，直到没有多余的水产生时反应结束。

(3)反应结束后，减压除溶剂得到固体粉末，再在乙酸乙酯中回流3小时，减压除去乙酸乙酯后，用饱和NaHCO₃水溶液洗涤3次，用蒸馏水洗涤1次，获得粗悬液。

(4)将步骤(3)获得的粗悬液经12000r/min离心收集上清液，在进口温度200℃、出口温度70℃，进料速率7ml/s条件下喷雾干燥制得强心抗疲劳聚合物纳米颗粒F。利用马尔文激光粒度仪对该颗粒进行测定，测得平均粒径为38nm，PDI指数为0.404。

测试例

药物对大鼠心功能的影响的测试：

实验动物：健康雄性8周龄清洁级SD大鼠100只，体质量为220±10g。

造模：采用阿霉素诱导心力衰竭(HF)大鼠模型。将注射用的盐酸阿霉素用注射用水配制成2g/L母液备用。心衰组第2、4d腹腔注射盐酸阿霉素1mg/kg，第6、8d注射盐酸阿霉素2mg/kg，第10、12d注射盐酸阿霉素3mg/kg，第14、16d注射盐酸阿霉素3mg/kg。对照组每次腹腔注射等容积的生理盐水。6周后大鼠心电图显示ST段抬高和左室射血分数(LVEF)＜50％，为心力衰竭大鼠造模成功。

分组及给药：大鼠在适应性喂养1周后，将造模成功的85只大鼠中随机取72只，并随机分为模型组、A、B、C、D、E、F组(每组分别给予对应的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒A、B、C、D、E、F，用药量为105mg/(kg·w))和卡托普利组(给予卡托普利药物，用药量为15mg/(kg·d))，每组9只；另随机选取未造模的9只大鼠作为正常对照组。造模成功后第2d开始以尾静脉注射方式给药，体积为2ml/kg，模型组和正常对照组给予同等量的注射用水，连续给药27d。

初次给药后第28d进行大鼠心功能检测。经彩色多普勒超声仪检测心动图，测定左室舒张末内径(LVEDd)，左室收缩末内径(LVEDs)和射血分数(EF)，结果见表1。同时，测定血浆醛固酮(ALD)、心钠肽(ANP)、血管紧张素II(AngII)水平。大鼠经腹主动脉采血，全血样本于室温放置2h后3000r/min离心10min，取血浆，于-80℃冰箱保存。采用放射免疫法测定血浆中ALD、ANP、AngII浓度，结果见表2。

表1各组大鼠血浆LVEDd、LVEDs和EF的测定结果

组别	动物数(只)	LVEDd(cm)	LVEDs(cm)	EF(％)
					正常对照组	9	0.60±0.95	0.38±0.19	80.37±4.87
模型组	9	0.85±0.98*	0.81±0.15*	41.32±9.09*
					卡托普利组	9	0.88±0.37	0.71±0.12<sup>Δ</sup>	50.33±10.34<sup>Δ</sup>
A	9	0.61±0.58<sup>ΔΔ</sup>	0.41±0.11<sup>ΔΔ</sup>	78.39±10.06<sup>ΔΔ</sup>
					B	9	0.69±0.84<sup>ΔΔ</sup>	0.48±0.09<sup>ΔΔ</sup>	72.81±8.99<sup>ΔΔ</sup>
C	9	0.67±0.70<sup>ΔΔ</sup>	0.51±0.15<sup>ΔΔ</sup>	75.90±15.67<sup>ΔΔ</sup>
					D	9	0.79±0.74<sup>Δ</sup>	0.70±0.23<sup>Δ</sup>	52.93±18.35<sup>Δ</sup>
E	9	0.82±0.81	0.69±0.14<sup>Δ</sup>	57.09±14.22<sup>Δ</sup>
					F	9	0.84±0.88	0.61±0.22<sup>Δ</sup>	68.38±11.01<sup>Δ</sup>

从表1可知，与正常对照组比较，模型组LVEDd和LVEDs显著增加，EF明显下降；实施例A、B、C组均能有效降低心衰大鼠的LVEDd和LVEDs，提高HF大鼠的EF；卡托普利组仅能改善HF大鼠的LVEDs和EF值，对LVEDd作用不明显。虽然对比例也具有一定的改善HF大鼠的LVEDd、LVEDs和EF值的作用，但没有实施例组的作用明显。这表明本发明实施例制备的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒改善HF大鼠心功能的作用优于卡托普利和对比例组。另外，A、B、C组每周仅给药1次，与卡托普利组每天给药相比，其给药次数大大减少。

表2各组大鼠血浆ALD、ANP和AngII的测定结果

组别	ALD(μg/L)	ANP(μg/L)	AngII(ng/L)
				正常对照组	40.2±9.0	329.4±32.5	81.3±10.3
模型组	88.1±10.2*	521.3±35.3*	162.4±21.7*
				卡托普利组	56.3±4.1<sup>Δ</sup>	410.0±30.6<sup>Δ</sup>	115.4±8.4<sup>Δ</sup>
A	41.6±8.3<sup>ΔΔ</sup>	335.1±29.8<sup>ΔΔ</sup>	81.5±10.6<sup>ΔΔ</sup>
				B	45.9±10.0<sup>ΔΔ</sup>	366.7±33.2<sup>ΔΔ</sup>	89.4±8.6<sup>ΔΔ</sup>
C	44.2±9.7<sup>ΔΔ</sup>	357.4±27.1<sup>ΔΔ</sup>	85.9±8.1<sup>ΔΔ</sup>
				D	56.1±9.5<sup>Δ</sup>	462.0±35.3<sup>Δ</sup>	130.9±20.6<sup>Δ</sup>
E	64.1±8.9<sup>Δ</sup>	421.3±29.3<sup>Δ</sup>	137.4±18.5<sup>Δ</sup>
				F	52.5±9.4<sup>Δ</sup>	401.3±28.5<sup>Δ</sup>	127.3±17.8<sup>Δ</sup>

从表2可知，与正常对照组比较，模型组大鼠血浆中ALD、ANP、AngII含量明显上升；实施例A、B、C组和卡托普利组血浆ALD、ANP、AngII水平均明显降低，且实施例3组效果比卡托普利组更好。虽然对比例也具有一定的改善HF大鼠的血浆ALD、ANP、AngII水平的作用，但没有实施例组的作用明显。这说明本发明实施例制备的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒能改善HF引起的血浆ALD、ANP、AngII水平升高，其程度优于卡托普利。另外，A、B、C组每周仅给药1次，与卡托普利组每天给药相比，其给药次数大大减少，归功于本发明实施例制备的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒具有优良的缓释性能，能够长期维持在体药效。

抗疲劳测试

实验动物：昆明种雄性小白鼠120只，体质量为25±2g。

分组与给药：将120只小鼠适应性喂养1w后，取105只随机分为7组：A、B、C、D、E、F组和正常对照组，每组15只，每次实验从对应组中随机抽取5只，分批实验。每组间体重无差异。实验组A、B、C、D、E、F分别以105mg/(kg·w)的强心抗疲劳聚合物纳米颗粒A、B、C、D、E、F尾静脉注射给药，体积为5ml/kg，正常对照组给予同等量的注射用水，给药时间点为第1、8、15、22d。

力竭游泳实验：末次给药7d后称量小鼠体重，然后在小鼠尾根部各负荷体重5％的铅丝，放入50cm×40cm×40cm水箱游泳，水温30±2℃。参照MCARDLE推荐的力竭判断标准，即小鼠头部沉入水中，经10s仍不能返回水面视为力竭。记录游泳开始时间至力竭的时间作为小鼠游泳时间，结果见表3。

小鼠血红蛋白测定：末次给药7d后，眼眶采血检测血红蛋白，结果见表4。

小鼠全血乳酸测定：末次给药7d后及负重游泳(体重的2％)30min后，分别眼眶采血检测全血乳酸，结果见表5。

表3小鼠力竭游泳时间结果

组别	动物数(只)	力竭游泳时间(s)
			正常对照组	5	735±304
A	5	3542±230<sup>ΔΔ</sup>
			B	5	3336±473<sup>ΔΔ</sup>
C	5	3195±618<sup>ΔΔ</sup>
			D	5	1146±404<sup>Δ</sup>
E	5	1272±731<sup>Δ</sup>
			F	5	2412±324<sup>Δ</sup>

从表3可知，实施例A、B、C组的小鼠力竭游泳时间远高于正常对照组小鼠，分别提高了约3.8倍(A组)、3.5倍(B组)、3.3倍(C组)。对比例D、E、F组的力竭游泳时间比正常对照组也有所提高，但效果不如实施例3组。

表4小鼠血红蛋白水平测定结果

从表4可知，实施例A、B、C组的小鼠血红蛋白水平均高于正常对照组小鼠。对比例D、E、F组的小鼠血红蛋白水平比正常对照组也有所提高，但效果不如实施例3组。

表5小鼠运动前后全血乳酸水平测定结果

组别	动物数(只)	运动前全血乳酸(mmol/L)	运动后全血乳酸(mmol/L)
				正常对照组	5	4.32±0.54	11.60±1.47
A	5	4.21±0.73	8.21±1.19<sup>Δ</sup>
				B	5	4.14±0.77	8.59±1.80<sup>Δ</sup>
C	5	4.31±0.58	8.83±1.73<sup>Δ</sup>
				D	5	4.45±0.32	10.19±1.64
E	5	4.50±0.69	10.24±1.25
				F	5	4.29±0.87	10.50±1.59

从表5可知，小鼠运动后全血乳酸水平均显著提高。与正常对照组相比，实施例A、B、C组的小鼠运动后全血乳酸水平的升高被显著抑制，对比例D、E、F组的小鼠运动后全血乳酸水平抑制程度较小。

本发明提供了一种强心抗疲劳聚合物纳米颗粒及其制备方法的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。