阅读说明：本技术 一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法 (Method for producing methane by using cow dung and activated sludge co-inoculated reinforced straw stalks ) 是由 邓玉营 阮文权 于 2020-04-28 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法,取活性污泥和牛粪,驯化；添加双效缓冲液：NaHCO<Sub>3</Sub>缓冲液,K<Sub>2</Sub>HPO<Sub>4</Sub>·3H<Sub>2</Sub>O和KH<Sub>2</Sub>PO<Sub>4</Sub>缓冲液,使体系初始pH值在6.8～7.1之间变动；添加(NH<Sub>4</Sub>)<Sub>2</Sub>SO<Sub>4</Sub>和瘤胃液；体系在最终产甲烷反应过程中以产乙酸为主,pH维持在6.37～8.12之间。本发明利用牛粪和活性污泥共接种维持秸秆水解和产甲烷之间的平衡；接种物经过驯化,获得高效稳定的接种物；本发明选择合适的发酵条件,维持体系适宜的水解和产甲烷环境,解决秸秆厌氧发酵易受到中间产物VFAs抑制的问题；最终固液相不同功能菌群协同作用实现秸秆发酵产甲烷。(The invention discloses a method for producing methane by inoculating and strengthening straw stalks through cow dung and activated sludge together, which comprises the steps of taking the activated sludge and the cow dung and domesticating; adding a double-effect buffer solution: NaHCO 2 3 Buffer solution, K 2 HPO 4 ·3H 2 O and KH 2 PO 4 Buffering solution to make the initial pH value of the system change between 6.8 and 7.1; addition of (NH) 4 ) 2 SO 4 And rumen fluid; the system mainly produces acetic acid in the final methane production reaction process, and the pH value is maintained between 6.37 and 8.12. The invention maintains the balance between straw hydrolysis and methane production by using cow dung and activated sludge for co-inoculation; domesticating the inoculum to obtain a high-efficiency stable inoculum; the invention has the advantages ofProper fermentation conditions are selected, the proper hydrolysis and methanogenesis environment of the system is maintained, and the problem that the straw anaerobic fermentation is easily inhibited by intermediate products VFAs is solved; finally, the solid-liquid phase realizes the methane production by straw fermentation under the synergistic effect of different functional floras.)

一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法

技术领域

本发明属于环境工程中农业废弃物厌氧消化领域，涉及到一种用于稻草秸秆产甲烷接种物的制备方法，具体涉及一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法。

背景技术

我国每年稻草秸秆产量巨大。但现阶段由于利用水平较低，焚烧成为其主要去路，造成环境污染。厌氧发酵产甲烷是秸秆资源化的重要途径，沼渣沼液可以用于有机肥料还田，综合效益明显。

秸秆产甲烷与体系中微生物活性密切相关。如秸秆结构复杂，木质素与半纤维素基质包裹在结构外侧，阻止了纤维素被微生物吸附和降解，水解菌群的变化，会导致酶活性的差异，影响秸秆生物质结构的降解。因此，接种物中高效的水解菌有利于提高水解效率。稻草秸秆厌氧发酵产甲烷常用的接种物为污水处理厂的活性污泥，所含水解微生物不多，而且易导致体系中挥发性脂肪酸(VFAs)积累，抑制产甲烷过程。

发明内容

针对目前稻草秸秆产甲烷接种物效率不高的问题，本发明提出了一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种牛粪和活性污泥共接种强化稻草秸秆产甲烷的方法，其特征在于，所述方法包括如下：

(1)分别取活性污泥和牛粪，活性污泥和牛粪的质量分数比为6:1～3:1；

(2)在上述活性污泥和牛粪接种体系中，进行驯化，在室温条件下静置，待无气体产生为止；

(3)添加所述双效缓冲液：NaHCO₃缓冲液，K₂HPO₄·3H₂O和KH₂PO₄缓冲液，使体系初始pH值在6.8～7.1之间；

(4)添加(NH₄)₂SO₄补充氮源；添加瘤胃液补充水解微生物所需的营养元素，在高压灭菌锅中121℃灭菌15min使用；

(5)所述体系中固液相菌群协同作用在实现秸秆发酵产甲烷反应过程中以产乙酸为主，pH维持在6.37～8.12之间。

进一步地，所述体系中固液相菌群包括：固相上存在瘤胃球菌属(Ruminococcus)、纤维杆菌属(Fibrobacter)嗜乙酸型甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)和甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)；液相中存在氨基杆菌属(Aminobacterium)和互营单胞菌属(Syntrophomonas)。

进一步地，固相上瘤胃球菌属(Ruminococcus)、纤维杆菌属(Fibrobacter)、嗜乙酸型甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)、甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)之间的菌群数量比为(20～25)：(1～2)：(20～25)：(3～6)；液相中氨基杆菌属(Aminobacterium)和互营单胞菌属(Syntrophomonas)之间的菌群数量比为(7～8)：1。

进一步地，所述步骤(1)：牛粪取自牛养殖场，牛粪通过纱布滤掉固渣后在4℃环境下保存备用；所述活性污泥从厌氧反应器中取出，定时投加葡萄糖活化该污泥来提高产甲烷活性；所述活性污泥和牛粪的质量分数比为4:1。

进一步地，所述步骤(3)：所述NaHCO₃在所述体系中的终浓度为5.00～8.00g·L^-1；所述K₂HPO₄·3H₂O和KH₂PO₄缓冲液在所述体系中的终浓度分别为0.59～1.34g·L^-1和0.45～0.51g·L^-1；所述驯化后的接种体系在4℃环境中保存备用。更进一步地，所述NaHCO₃在所述体系中的终浓度5.00g·L^-1；所述K₂HPO₄·3H₂O和KH₂PO₄缓冲液在所述体系中的终浓度分别为1.34g·L^-1和0.51g·L^-1。

进一步地，所述步骤(4)：所述(NH₄)₂SO₄在体系中的终浓度为0.26～0.3g·L^-1；所述瘤胃液的制备方法为：从刚宰杀的奶牛瘤胃中取得，放入带盖容器中，5h内通过两层纱布过滤掉草料获得瘤胃液，在4℃环境中保存备用；所述瘤胃液的体积百分数为15％。更进一步地，所述(NH₄)₂SO₄在体系中的终浓度为0.26g·L^-1。

本发明能够解决如下问题：

(1)牛粪和和产甲烷活性污泥共接种制备接种物，维持秸秆水解和产甲烷之间的平衡，有利于反映秸秆真实的产甲烷潜力。

(2)接种物经过驯化，获得高效稳定的接种物，解决秸秆产甲烷测定无高效接种物的问题。

(3)选择合适的发酵条件，维持体系适宜的水解和产甲烷环境，解决秸秆厌氧发酵易受到中间产物VFAs抑制的问题。

(4)揭示发酵体系固液相菌群特征，揭示发酵产甲烷强化机制。

本发明方法中添加牛粪提高了水解菌群的比例，会导致酶活性的差异，影响秸秆生物质结构的降解。水解后产生的VFAs进入液相，通过互营氧化产生乙酸，能被嗜乙酸型甲烷菌所利用。此外最终固液相不同功能菌群协同作用实现秸秆发酵产甲烷。

附图说明

图1是牛粪添加体系和对照体系每天产甲烷的对比示意图；

图2是牛粪添加体系和对照体系发酵过程中单个VFA浓度和pH值的变化：(a)乙酸质量浓度；(b)丙酸质量浓度；(c)丁酸质量浓度；(d)pH值；

图3是牛粪添加体系和对照体系利用SEM观察到的稻秸残渣形态学特征：(a-1)和(a-2)为对照体系；(b-1)和(b-2)为牛粪添加体系。

具体实施方式

下面结合说明书附图和具体的实施例，对本发明作详细描述。

秸秆中纤维素、半纤维素及木质素等主要成分用A2000i纤维分析仪(ANKOM，美国)测定含量，残渣均需在干燥箱中65℃烘至恒重。在12 000r·min^-1下离心10分钟，所得上清用于指标分析，每个指标重复三次。VFAs使用GC-2010Plus气相色谱(岛津，日本)测定，pH值则通过DELTA 320pH计(梅特勒-托利多仪器，美国)测定。

沼液在800×g下离心15min，沉淀为固相样品；上清液继续在27,000×g下离心30min获得液相样品。使用PowerDNA试剂盒(Mo Bio，美国)分别提取初始接种物和固液相样品DNA，进行测序、菌群分析。

牛粪添加体系中，接种污泥、稻秸和牛粪的占整个体系的质量分数分别为8％、2％和2％(稻秸的用量质量分数在1％—4％范围内，优选的是，2％)，对照体系中只有活性污泥，不添加牛粪，其余和牛粪添加体系一致。实验在甲烷潜力测试系统(AMPTS，瑞典)上进行，有效体积为250mL，添加NaHCO₃终浓度5.00g·L^-1，K₂HPO₄·3H₂O和KH₂PO₄缓冲液，终浓度分别为1.34g·L^-1和0.51g·L^-1，使体系初始pH值在6.8～7.1之间变动。添加(NH₄)₂SO₄补充氮源，终浓度为0.26g·L^-1，添加15％的瘤胃液补充水解微生物所的营养元素，在高压灭菌锅中121℃灭菌15min使用。

1产甲烷分析

如图1所示，对照体系最高产甲烷量出现在第1d，为122.80mL·d^-1，然后迅速降低。牛粪添加体系有两个产甲烷峰，分别出现在第4d和第38d，最高产甲烷量达到了120.35mL·d^-1。通过计算，甲烷产率达到了269.32mL·g^-1VS，是对照体系的1.35倍。

2稻秸降解

牛粪添加体系的稻秸降解率为41.79％，高于对照体系的39.32％。稻秸原料中纤维素、半纤维和木质素含量分别为30.88％，24.34％和11.52％，发酵结束后，固渣中纤维素和半纤维素的降低率分别达到了53.97％，56.14％，和对照相比，半纤维素降解相差不大，而纤维素的水解明显高于对照体系，而木质素在整个过程中比例升高表明没有被利用，如下表所示。

表1稻秸降解过程中发酵参数的变化

3VFAs浓度和pH值的变化

单个VFAs的积累和消耗反映了发酵产酸与产甲烷之间的平衡。如图2所示，对照体系中乙酸浓度在第4d达到峰值3.69g·L^-1，随后逐渐降低。而牛粪添加体系中乙酸浓度分别在第4d，32d有两个峰值，质量浓度分别达到了4.95g·L^-1和3.89g·L^-1，36d后被完全利用。上述数据表明，牛粪添加体系以产乙酸发酵为主，短暂积累后通过嗜乙酸型产甲烷途径被消耗，其浓度与产甲烷活性紧密相关，该现象与其他秸秆发酵产甲烷的代谢类型一致。

牛粪添加体系在发酵开始阶段出现丙酸积累，最高质量浓度在12d达到了3.65g·L^-1，20d后浓度下降为0，而丁酸则在16d后浓度下降为0。对照体系中两种酸最高浓度分别达到了4.42g·L^-1和1.98g·L^-1。一般认为，丙酸和丁酸是厌氧体系中还原氢来不及被利用的产物，只有通过互营氧化作用才能克服热力学障碍，如果氧化菌生长缓慢，易导致体系的酸化。本研究牛粪添加体系中两种酸短暂积累导致了pH值在第20d时降至6.73，但体系的接种物中含有的互营氧化菌群利用了丙酸和丁酸，使得pH值在整个发酵过程中在范围内变动。

4功能微生物分析

4.1固相功能菌群

固相中来源于接种污泥及牛粪特定功能微生物的变化如表2所示，Clostridium是所有体系中的主要水解菌，来源于牛粪的高效纤维素水解菌Ruminococcus，Fibrobacter在体系中的相对丰度高于对照，这也解释了牛粪添加后稻秸纤维素水解酶活及降解率显著提高的现象。Lutispora及沉积杆菌属(Sedimentibacter)等属于多糖降解产乙酸菌，在牛粪添加体系中相对丰度的提高表明产乙酸代谢途径的强化，有利于产甲烷。牛粪添加体系中嗜乙酸型甲烷八叠球菌属(Methanosarcina)是主要类型，其次为来源于牛粪的甲烷短杆菌属(Methanobrevibacter)；而对照体系中Methanosaeta的相对丰度最高。

表2固相上特定功能细菌和甲烷菌属相对丰度的变化

如图3所示，利用SEM观察稻秸残渣也反映出协同作用，在牛粪添加体系中功能微生物与破碎的底物形成紧密结构，能够加快稻秸的降解，而在对照体系中没有观察到类似的形态特征。

4.2液相功能菌群

如表3所示，液相中Butyrivibrio，密螺旋体属(Treponema)，普氏菌属(Prevotella)等属于产酸微生物，对照体系中该类产酸菌属相对丰度较高，能积累丁酸、乳酸及琥珀酸积累，导致体系酸化抑制了产甲烷活性。来源于接种物的氧化菌能够和伴生菌形成互营氧化菌群，有利于降低VFAs的浓度。牛粪添加体系中氨基杆菌属(Aminobacterium)及丁酸型互营单胞菌属(Syntrophomonas)等相对丰度较高，能通过互营氧化作用降低丙酸和丁酸浓度。Syntrophobacter和Pelotomaculum等丙酸氧化菌主要存在于对照体系中。

表3液相上功能菌相对丰度的变化

Table 3 Changes in relative abundances of selected function bacteriain the liquid fraction

以上所述仅为本发明的优选例实施方式，并不构成对本发明保护范围的限定。任何在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的权利要求保护范围之内。