阅读说明：本技术 枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用 (Application of total phenols extract of immature bitter orange in preparation of intestinal tract protection medicine ) 是由 刘元艳 刘林林 陈友文 李晨曦 刘蕊 宋钰蓉 刘广知 李文 曹志文 于柳春阳 于 2020-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物新用途技术领域,具体涉及到枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用,所述枳实总酚提取物的制备方法为：取枳实粉碎后用,10倍量50％乙醇浸泡30分钟,然后将混合物回流提取1.5小时,重复三次,过80目筛后合并三次提取液,在真空旋转蒸发器中回收乙醇,水提物在真空旋转蒸发器中混合浓缩,在真空烘箱中干燥,得到枳实总酚提取物；所述肠道保护具体为：上调疣微菌科、乳酸菌科、普雷沃氏菌科的生长,抑制毛螺菌科、拟杆菌科、紫单胞菌科和肠杆菌科的生长,保护肠道屏障完整性。与现有技术相比,本发明更精准地针对了具体疾病,使患者在检查出所属病因后,能更明确、快捷选择枳实总酚提取物制剂进行治疗。(The invention belongs to the technical field of new application of medicines, and particularly relates to application of a total phenol extract of immature bitter oranges in preparation of an intestinal tract protection medicine, wherein the preparation method of the total phenol extract of immature bitter oranges comprises the following steps: crushing immature bitter oranges, soaking the crushed immature bitter oranges in 10 times of 50% ethanol for 30 minutes, then carrying out reflux extraction on the mixture for 1.5 hours, repeating the extraction for three times, sieving the mixture for 80 meshes, combining extracting solutions obtained in the three times, recovering the ethanol in a vacuum rotary evaporator, mixing and concentrating the water extract in the vacuum rotary evaporator, and drying the mixed water extract in a vacuum oven to obtain an immature bitter oranges total phenol extract; the intestinal protection is specifically as follows: up-regulating the growth of wart microbiaceae, lactobacillaceae, Prevoteriaceae, inhibiting the growth of pilospiraceae, Bacteroides, Porphyromonaceae and Enterobacteriaceae, and protecting the integrity of intestinal barrier. Compared with the prior art, the invention aims at specific diseases more accurately, so that patients can more clearly and quickly select the total phenol extract preparation of the immature bitter orange for treatment after the disease causes are detected.)

枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用

技术领域

本发明属于药物新用途技术领域，具体涉及到枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用。

背景技术

肠道菌群是一个复杂的、高度动态的微生物群落。它被认为是一个不可或缺的“代谢器官”，参与一些必要化合物的营养加工和生产，如短链脂肪酸和胆汁酸。另外，肠道菌群还助于胃肠道系统的成熟和免疫系统的形成。肠道菌群的组成不断受到遗传、年龄、性别、饮食、抗生素、环境等因素的影响。其中最重要一个因素，抗生素，它被广泛用于治疗和预防细菌感染。然而，越来越多的证据表明，抗生素对宿主的生理机能有不良影响，导致肠道菌群的结构改变，这种情况被称为“肠道菌群失调”。

广谱抗生素可以影响肠道菌群组成的总体丰度，导致多样性、均匀性和分类丰富度迅速下降。多项研究证据表明，氨苄西林、克林霉素和万古霉素等广谱抗生素的使用可导致肠道菌群的失调。菌群在维持肠道屏障完整性方面发挥着重要作用，这对肠道和全身疾病的稳态和功能至关重要。肠道屏障的完整性可以防止细菌内毒素从肠道转移到肝脏。紧密连接，如Zonula occludens 1(ZO-1)和Occludin，是将肠细胞紧密连接在一起并控制细胞的通透性。因此，紧密连接蛋白调节肠道屏障的完整性。抗生素除了改变肠道屏障功能外，还会改变肠道菌群的功能。

枳实，为芸香科植物酸橙Citrus aurantium L.及其栽培变种或甜橙C.sinensisOsbeck的干燥幼果。5～6月收集自落的果实，其味苦、辛、酸，性微寒，归脾、胃经。具有破气消积，化痰散痞的功效，主要用于治疗积滞内停，痞满胀痛，泻痢后重，大便不通，痰滞气阻，胸痹，结胸，脏器下垂等症状。枳实药材资源丰富，分布广泛，其产地主要有四川、江西、湖南、福建等地，以江西产酸橙为道地药材。枳实总酚提取物(Total phenolic extracts ofCitrus aurantium L.，TPE-CA)包括黄烷及其苷类、多甲氧基黄酮类，黄酮(醇)及其苷类，香豆素类，柠檬苦素类及花青素类等多酚类物质，对人体健康具有调节平衡、增强机体稳态等重要的治疗作用。

虽然枳实被报道具有健胃消食的功效，但健胃消食涉及的药理作用太泛。例如，治胃溃疡和胃梗阻的药物肯定是不能互用的，而且枳实也并非仅对胃病起作用。因此，对于要求精准医疗的药物来说，现有研究还不够深入。对枳实总酚提取物的健胃消食作用进行剖析，发现更精准的药理作用，有利于新药研发。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用。

本发明所述的枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用，所述枳实总酚提取物的制备方法为：取枳实粉碎后用，10倍量50％乙醇浸泡30分钟，然后将混合物回流提取1.5小时，重复三次，过80目筛后合并三次提取液，在真空旋转蒸发器中回收乙醇，水提物在真空旋转蒸发器中混合浓缩，在真空烘箱中干燥，得到枳实总酚提取物；所述肠道保护具体为：上调疣微菌科、乳酸菌科、普雷沃氏菌科的生长，抑制毛螺菌科、拟杆菌科、紫单胞菌科和肠杆菌科的生长，保护肠道屏障完整性。

本发明所述的枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用，所述肠道保护为对抗生素致肠道菌群的结构改变的纠正。

本发明所述的枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用，所述枳实总酚提取物按1g/ml的生药量计，包括成分如下：新橙皮苷97244453.52ng/ml、柚皮苷61045773.9ng/ml、橙皮苷20603969.1ng/ml、芸香柚皮苷17752304.46ng/ml、橘皮素3802648.92ng/ml、野漆树苷2631472.98ng/ml、木犀草素2591288.1ng/ml、川陈皮素2291214.3ng/ml、圣草次苷2166024.54ng/ml、芦丁852041.22ng/ml、地奥司明629279.22ng/ml、枸橘苷520566.96ng/ml、橙皮素340966.86ng/ml、柚皮素 261388.26ng/ml、甜橙黄酮256528.62ng/ml、5-去甲川陈皮素113856.18ng/ml、柠檬苦素97171.56ng/ml、诺米林50669.22ng/ml、香叶木素-7-O葡萄糖苷34483.38 ng/ml、芹菜苷19076.58ng/ml、花椒毒酚15009ng/ml、山奈苷9062.52ng/ml、香叶木素5558.46ng/ml、圣草酚4218.9ng/ml、滨蒿内酯4124.04ng/ml、异茴芹内酯 3898.14ng/ml。

与现有技术相比，本发明所述的枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用，更精准地针对了具体疾病，使患者在检查出所属病因后，能更明确、快捷选择枳实总酚提取物制剂进行治疗。

附图说明

图1：TPE-CA对抗生素诱导的肠道微生物群落组成的影响。空白组、抗生素组、TPE-CA组和益生菌组在门水平的相对丰度。

图2：TPE-CA对抗生素诱导的肠道微生物群落组成的影响。空白组、抗生素组、TPE-CA组和益生菌组在纲水平的相对丰度。

图3：TPE-CA对肠道屏障完整性的影响。A，空白组、抗生素组、TPE-CA组、益生菌组内毒素的表达水平。B，空白组、抗生素组、TPE-CA组、益生菌组ZO-1的表达水平。C，空白组、抗生素组、TPE-CA组、益生菌组Occludin的表达水平。与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。数据用均数±标准差表示，每组10只动物。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述的枳实总酚提取物在肠道保护药物制备上的应用做进一步说明，但是本发明的保护范围并不限于此。

实施例1

实验方法

TPE-CA的制备

取枳实400g粉碎后用，10倍量50％乙醇浸泡30分钟，然后将混合物回流提取1.5小时，重复三次。过80目筛后合并三次提取液，在真空旋转蒸发器中回收乙醇，水提物在真空旋转蒸发器中混合浓缩，在真空烘箱中干燥，得到132克干提物。制备的枳实总酚提取物(TPE-CA)样品在-20℃冰箱中保存。

RRLC-QqQ-MSⁿ分析枳实提取物TPE-CA成分，具体过程过参见在投文章。1g/ml 生药量所含的成分及含量具体为：新橙皮苷97244453.52ng/ml、柚皮苷61045773.9 ng/ml、橙皮苷20603969.1ng/ml、芸香柚皮苷17752304.46ng/ml、橘皮素3802648.92 ng/ml、野漆树苷2631472.98ng/ml、木犀草素2591288.1ng/ml、川陈皮素2291214.3ng/ml、圣草次苷2166024.54ng/ml、芦丁852041.22ng/ml、地奥司明629279.22ng/ml、枸橘苷 520566.96ng/ml、橙皮素340966.86ng/ml、柚皮素261388.26ng/ml、甜橙黄酮256528.62 ng/ml、5-去甲川陈皮素113856.18ng/ml、柠檬苦素97171.56ng/ml、诺米林50669.22 ng/ml、香叶木素-7-O葡萄糖苷34483.38ng/ml、芹菜苷19076.58ng/ml、花椒毒酚15009 ng/ml、山奈苷9062.52ng/ml、香叶木素5558.46ng/ml、圣草酚4218.9ng/ml、滨蒿内酯 4124.04ng/ml、异茴芹内酯3898.14ng/ml。

动物分组

健康雄性C57BL6小鼠40只(体重20±2g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。动物饲养在温控室(22～25℃)，自动控制12小时明暗交替循环(上午6.30-下午6.30)。这些老鼠被给予标准的实验室食物和水。根据《实验室动物的护理和使用指南》，开展了特定无致病性(SPF)级实验室。在适应性喂养一周后，将小鼠随机分为正常组，抗生素组、TPE-CA组、益生菌组，每组10只。正常组和抗生素组在实验结束前给予正常的食物和水；TPE-CA组通过灌胃给予TPE-CA 8.7g/kg浓度的提取物(26g/kg 原药)，每日一次，连续四周。益生菌组给予浓度为10⁹乳酸菌100uL，连续4周。在整个实验过程中，每周记录每只小鼠的体重，在实验期间每3天更换一次水。除正常组外，其它三组造模。造模方法：将链霉素，克林霉素和氨苄青霉素混合入无菌饮用水(1mg /mL)中，饮用含抗生素的水两周。在实验期间，每3天更换和/或补充一次水。通过微生物群丰度的变化和肠道通透性评价抗生素诱导的菌群失调。

动物取材

最后一次给药后当天禁食不禁水，收集粪便，第2天称重后腹腔注射10％水合氯醛进行麻醉，腹主动脉取血，收集于离心管中，10000rpm，4℃，离心15min，取血清，-80℃保存。取小鼠肝脏，回肠，盲肠内容物立即冷冻于液氮中，后置于-80℃冰箱保存。

肠道菌群群落分析

使用Power Soil DNA分离试剂盒(MoBio Laboratories，Carlsbad，CA)按照说明书对盲肠内容物(100mg)进行DNA提取，用0.8％琼脂糖凝胶检测基因组DNA的纯度和质量。在北京奥维森基因公司的Miseq平台上进行深度测序。运行后，使用Illumina analysisPipeline Version 2.6软件进行图像分析和误差估计。

血清内毒素检测

取无热原试管，加入100uL细菌内毒素检查用水、内毒素标准溶液，或供试品。再加入100uL鲎试剂溶液，混匀，盖上铝箔纸，37℃温育30min。温育结束，加入100uL 显色基质溶液，混匀，37℃温育6min。温育结束，加入500uL偶氮化试剂2溶液，混匀，加入500uL偶氮化试剂3溶液，混匀，静止5min，于545nm波长处读取吸光度值。

分析结果

TPE-CA对肠道菌群丰度组成的调节

使用高通量测序检测了肠道菌群丰度组成的变化。肠道菌群的丰度以分类学单位(OTUs)表示。在门的水平上，近95％的细菌属于10个门，其余的被分配给其他未分类的细菌。结果所示，与对照组相比，抗生素组拟杆菌门和变形杆菌门明显增多，而厚壁菌门和放线菌门明显减少(图1)。然而，经过TPE-CA和益生菌治疗后与抗生素组完全相反。在科水平上，与抗生素组相比，TPE-CA治疗组显著上调了疣微菌科、乳酸菌科、普雷沃氏菌科，显著抑制了毛螺菌科、拟杆菌科、紫单胞菌科和肠杆菌科的生长(图 2)。

TPE-CA对肠道屏障完整性的影响

肠道通透性作为肠道完整性改变的指标。已有研究表明，ZO-1和occludin在肠道通透性中起重要作用，内毒素也是的标志物之一。为了进一步研究肠道通透性，生化指标检测了血清中内毒素的含量，生物学指标检测相关的ZO-1、occludin蛋白含量。与空白组相比，抗生素组血清内毒素水平明显升高，说明抗生素治疗后肠道通透性增加(p< 0.01，图3A)。抗生素组ZO-1和occludin酶活性降低(p<0.01，图3B，图3C)，说明抗生素暴露后黏膜完整性受损。治疗4周后，TPE-CA或益生菌组可显著提高ZO-1、 occludin含量，显著降低内毒素含量。这些结果表明，TPE-CA对小鼠肠道屏障完整性有较强的保护作用。