阅读说明：本技术 SiMYB30蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐逆性和产量中的应用 (Application of SiMYB30 protein and related biological material thereof in regulation and control of stress tolerance and yield of plants ) 是由 陈明 马有志 黎毛毛 张玥玮 唐文思 周永斌 徐兆师 陈隽 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了SiMYB30蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐逆性和产量中的应用。本发明通过采用最小表达框的转化方法,将仅含有启动子、目的基因SiMYB30和终止子的DNA片段侵染水稻愈伤组织,得到转SiMYB30水稻。实验证明：在低氮胁迫下,转SiMYB30水稻的产量相关性状(穗数、穗长、粒数、千粒重、稻草重、稻谷重等)及含氮量均高于野生型水稻。说明SiMYB30蛋白质具有调控植物耐逆性和产量相关性状的功能,尤其是提高植物的低氮耐性和产量,为培育耐逆和高产植物品种奠定基础。(The invention discloses application of SiMYB30 protein and related biological materials thereof in regulation and control of stress tolerance and yield of plants. According to the invention, by adopting a minimum expression frame transformation method, the rice callus is infected by the DNA fragment only containing the promoter, the target gene SiMYB30 and the terminator, so that the SiMYB 30-transgenic rice is obtained. Experiments prove that: under the low nitrogen stress, the yield-related traits (spike number, spike length, grain number, thousand grain weight, straw weight, rice grain weight and the like) and nitrogen content of SiMYB 30-transgenic rice are higher than those of wild rice. The SiMYB30 protein has the function of regulating and controlling the stress tolerance and yield-related traits of plants, particularly improves the low-nitrogen tolerance and yield of the plants, and lays a foundation for cultivating stress-tolerant and high-yield plant varieties.)

SiMYB30蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐逆性和产量 中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及SiMYB30蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐逆性和产量中的应用。

背景技术

逆境胁迫是影响植物生长、发育的障碍因子。在逆境胁迫下植物体内会产生一系列应答反应，伴随着许多生理生化及发育上的变化。明确植物对逆境的反应机制，将为抗逆基因工程研究和应用提供科学论据。目前，植物抗逆性研究已逐渐深入到细胞、分子水平，并与遗传学和遗传工程研究相结合，探索用生物技术来改进植物生长特性，其目的是提高植物对逆境的适应能力。

氮是一种在植物生长和发育中需求量最大的矿质营养元素，植物干物质和植株全氮中的含氮量分别为1.5％-2％和16％。元素氮对作物生长起着非常重要的作用，它是植物体内氨基酸的组成部分、是构成蛋白质的成分，也是植物进行光合作用起决定作用的叶绿素的组成部分。

20世纪下半叶，为了提高作物的生产率，主要高产作物对氮肥和其它营养的需求大幅提升，导致了全球氮肥用量提高了十倍。然而植物对氮肥的吸收利用远小于其施用量的一半，大部分的氮肥由于N₂和NH₃等气体的挥发以及硝化反硝化脱氮、淋溶等被浪费。而且氮肥现今已成为作物生产所需的最主要成本，还会在较大程度上影响农民的收入。因此如何让植物能更高效的利用氮肥成为了亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的是提供SiMYB30蛋白质及其相关的生物材料在调控植物耐逆性和/或植物产量相关性状中的应用。

为了实现上述目的，本发明首先提供了SiMYB30蛋白质的新用途。

本发明提供了SiMYB30蛋白质在调控植物耐逆性和/或植物产量相关性状中的应用；

所述SiMYB30蛋白质来源于谷子(Setaria italica)，为如下A1)或A2)或A3)或A4)任一所示蛋白质：

A1)由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

A2)在序列表中序列2所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白；

A3)将序列表中序列2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且功能相同的蛋白质；

A4)与A1)-A3)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且具有相同功能的蛋白质。

其中，序列表中序列2由318个氨基酸残基组成。

所述标签具体如表1所示。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL
HA	9	YPYDVPDYA

上述A1)-A4)任一所示的蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。

为了实现上述目的，本发明还提供了与SiMYB30蛋白质相关的生物材料的新用途。

本发明提供了与SiMYB30蛋白质相关的生物材料在调控植物耐逆性和/或植物产量相关性状中的应用；

所述生物材料为下述B1)-B10)中的任一种：

B1)编码SiMYB30蛋白质的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体；

B4)含有B2)所述表达盒的重组载体；

B5)含有B1)所述核酸分子的重组微生物；

B6)含有B2)所述表达盒的重组微生物；

B7)含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B8)含有B4)所述重组载体的重组微生物；

B9)含有B1)所述核酸分子的转基因细胞系；

B10)含有B2)所述表达盒的转基因细胞系。

上述应用中，B1)所述核酸分子为如下C1)-C4)中任一所示：

C1)序列表中序列1所示的DNA分子；

C2)序列表中序列3所示的DNA分子；

C3)与C1)或C2)限定的DNA分子序列至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性，且编码SiMYB30蛋白质的DNA分子；

C4)在严格条件下与C1)或C2)或C3)限定的DNA分子杂交，且编码SiMYB30蛋白质的DNA分子。

其中，序列表中序列1由957个核苷酸组成。

本领域普通技术人员可以很容易地采用已知的方法，例如定向进化和点突变的方法，对本发明的编码SiMYB30蛋白质的核苷酸序列进行突变。那些经过人工修饰的，具有编码SiMYB30蛋白质的核苷酸序列75％或者更高同一性的核苷酸，只要编码SiMYB30蛋白质且具有相同功能，均是衍生于本发明的核苷酸序列并且等同于本发明的序列。

这里使用的术语“同一性”指与天然核酸序列的序列相似性。“同一性”包括与本发明的编码序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列具有75％或更高，或85％或更高，或90％或更高，或95％或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或计算机软件进行评价。使用计算机软件，两个或多个序列之间的同一性可以用百分比(％)表示，其可以用来评价相关序列之间的同一性。

上述75％或75％以上同一性，可为80％、85％、90％或95％以上的同一性。

上述应用中，所述严格条件是在2×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×SSC，0.1％SDS的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min；或，0.1×SSPE(或0.1×SSC)、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

上述应用中，所述表达盒依次由启动子、上述SiMYB30蛋白质的编码基因和终止子组成。在本发明的具体实施例中，所述表达盒依次由ubiquitin组成型启动子、上述SiMYB30蛋白质的编码基因和终止子nos3’组成。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

所述重组载体是将上述核酸分子插入表达载体中，得到表达上述蛋白质的重组载体。使用所述核酸分子构建重组载体时，可在其转录起始核苷酸前加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用所述核酸分子构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。从转基因植物的安全性考虑，可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。在本发明的具体实施例中，所述重组载体为将序列1所示的SiMYB30基因片段克隆到载体LP047 1118-Bar-ubi-EDLL的Spe I和BamH I酶切位点间得到的重组载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。所述重组微生物为含有上述表达盒或上述重组载体的微生物。本发明的具体实施例中，所述重组微生物为含有上述表达盒的农杆菌EHA105。

本发明还提供了上述SiMYB30蛋白质或上述生物材料在培育耐逆性和/或产量提高的转基因植物中的应用。

本发明还提供了上述SiMYB30蛋白质或上述生物材料在植物育种中的应用。所述育种的目的为选育耐逆性高和/或产量高的植物。

进一步的，所述调控为提高。

更进一步的，所述耐逆性为低氮耐性。

所述调控植物耐逆性具体体现在：当植物中的SiMYB30蛋白质的含量和/或活性降低时，所述植物低氮耐性降低；当植物中的SiMYB30蛋白质的含量和/或活性提高时，所述植物低氮耐性提高。

所述植物产量相关性状包括干谷重和/或稻草干重和/或穗数和/或穗长和/或每穗实粒数和/或每穗总粒数和/或千粒重和/或稻谷重和/或稻草重。

所述调控植物产量相关性状具体体现在：当植物中的SiMYB30蛋白质的含量和/或活性降低时，所述植物干谷重和/或稻草干重和/或穗数和/或穗长和/或每穗实粒数和/或每穗总粒数和/或千粒重和/或稻谷重和/或稻草重减少；当植物中的SiMYB30蛋白质的含量和/或活性提高时，所述植物干谷重和/或稻草干重和/或穗数和/或穗长和/或每穗实粒数和/或每穗总粒数和/或千粒重和/或稻谷重和/或稻草重提高。

为实现上述目的，本发明最后提供了一种培育耐逆性和/或产量提高的转基因植物的方法。

本发明提供的培育耐逆性和/或产量提高的转基因植物的方法包括提高受体植物中SiMYB30蛋白质的含量和/或活性，得到转基因植物的步骤；所述转基因植物的耐逆性和/或产量高于所述受体植物。

进一步的，所述提高受体植物中SiMYB30蛋白质的含量和/或活性的方法为在受体植物中过表达SiMYB30蛋白质。所述过表达的方法为将SiMYB30蛋白质的编码基因导入受体植物。

更进一步的，所述SiMYB30蛋白质的编码基因的核苷酸序列为上述C1)-C4)中的任一种。在本发明的具体实施例中，所述SiMYB30蛋白质的编码基因通过上述表达盒导入受体植物。

所述耐逆性为低氮耐性。

所述转基因植物的耐逆性和/或产量高于所述受体植物体现在如下Y1)-Y11)中的任一种：

Y1)所述转基因植物的干谷重高于所述受体植物；

Y2)所述转基因植物的稻草干重高于所述受体植物；

Y3)所述转基因植物的穗数多于所述受体植物；

Y4)所述转基因植物的穗长长于所述受体植物；

Y5)所述转基因植物的每穗实粒数多于所述受体植物；

Y6)所述转基因植物的每穗总粒数多于所述受体植物；

Y7)所述转基因植物的千粒重高于所述受体植物；

Y8)所述转基因植物的稻草重高于所述受体植物；

Y9)所述转基因植物的稻谷重高于所述受体植物；

Y10)所述转基因植物的稻谷含氮量高于所述受体植物；

Y11)所述转基因植物的稻草含氮量高于所述受体植物。

上述任一所述应用或方法中，所述植物可为单子叶植物或双子叶植物。进一步的，所述单子叶植物可为禾本科植物。更进一步的，所述禾本科植物具体为水稻(如水稻品种Kitaake)或谷子(如谷子品种豫谷一号)。

本发明提供了一种与植物耐逆性和产量性状相关的SiMYB30蛋白，通过采用最小表达框的转化方法，将仅含有启动子、目的基因SiMYB30和终止子的DNA片段侵染水稻愈伤组织(转化片段中没有任何载体骨架序列，最大程度减少了由于载体骨架序列可能带来的安全风险)，得到转SiMYB30水稻。实验证明：在低氮胁迫下，转SiMYB30水稻的产量相关性状(穗数、穗长、粒数、千粒重、稻草重、稻谷重等)及含氮量均高于野生型水稻。说明SiMYB30蛋白质具有调控植物耐逆性和产量相关性状的功能，尤其是提高植物的低氮耐性和产量，为培育耐逆和高产植物品种奠定基础。

附图说明

图1为转SiMYB30水稻的分子鉴定。注：Marker：DL1000 Marker；阴性对照：Kitaake；阳性对照：SiMYB30质粒。*为P<0.05，表示差异显著。

图2为2018年田间数据整理。其中，CK为野生型水稻Kitaake；OE24为转SiMYB30水稻。

图3为2019年江西转SiMYB30水稻的低氮胁迫鉴定结果。图3A为低氮处理组(不施氮肥组)的田间表型。图3B为在低氮处理(不施氮肥组)和正常处理(施氮肥组)条件下各材料取3株后的表型图。其中，受体(Kitaake)为野生型水稻Kitaake；M29893/24为转SiMYB30水稻。

图4为2019年考种数据结果。图4A为正常处理组(施氮肥组)的考种数据结果。图4B为低氮处理组(不施氮肥组)的考种数据结果。其中，WT为野生型水稻Kitaake；OE24为转SiMYB30水稻。

图5为2019年生物产量测定结果。其中，WT为野生型水稻Kitaake；OE24为转SiMYB30水稻。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

下述实施例中的LP047 1118-Bar-ubi-EDLL表达载体记载于文献：宁蕾,王曙光,琚鹏举,柏星轩,葛林豪,齐欣,姜奇彦,孙现军,陈明,孙黛珍.过表达谷子SiANT1对水稻耐盐性的影响[J].中国农业科学,2018,51(10):1830-1841中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

下述实施例中的标记基因bar表达载体pSBAR记载于文献：苏瑞波.利用改进的最小表达框技术获得抗旱转基因小麦[D].内蒙古农业大学,2012.中，公众可从中国农业科学院作物科学研究所处获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、SiMYB30基因的获得

1、RNA提取

使用庄盟国际生物科技有限公司的RNA提取试剂盒(货号：ZP405K-1)提取两周大的谷子(谷子品种为豫谷一号)幼苗的总RNA，操作步骤按照说明书进行。

2、cDNA获得

取5μl提取的总RNA采用全式金生物技术有限公司的反转录试剂盒(货号：AT311-02)按照说明书进行反转录得到cDNA。

3、PCR扩增

使用KOYOTO公司的高保真酶KOD FX(货号：KFX-101)以2μl反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，得到PCR扩增产物(SiMYB30的编码序列)。引物序列如下：

F：5’-ATGGTGAGGCCACCGTGCTG-3’；

R：5’-CTAGAACGGGTAATCCATGG-3’。

4、PCR扩增产物检测与测序

对获得的PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，回收并纯化得到大小为957bp的DNA片段，反应结束后利用Takara胶回收试剂盒(货号：9760)并按照说明书对PCR产物进行回收，将回收后的产物送至奥科鼎盛生物科技有限公司进行测序，测序正确后使用全式金生物技术有限公司零背景克隆试剂盒(货号：CB501-01)按照说明书将SiMYB30的编码序列克隆到pBlunt载体(该载体由试剂盒自带)上，命名为pBlunt-SiMYB30。

测序结果表明：PCR扩增得到大小为957bp的扩增产物，将其命名为SiMYB30基因，其核苷酸序列如序列表中序列1所示，SiMYB30基因编码的SiMYB30蛋白的氨基酸序列如序列表中序列2所示。

实施例2、转SiMYB30水稻的获得及其耐逆性与产量相关性状分析

一、转SiMYB30水稻的获得

1、重组载体psSiMYB30的构建

利用Clotech公司的无缝克隆试剂盒(货号：639649)按照说明书步骤将序列1所示的SiMYB30基因片段克隆到载体LP047 1118-Bar-ubi-EDLL的Spe I和BamH I酶切位点间，得到重组载体psSiMYB30。

2、线性最小表达框的获得

(1)采用HindⅢ和EcoRⅠ双酶切步骤1得到的重组载体psSiMYB30，得到SiMYB30基因的线性最小表达框片段，SiMYB30基因的最小表达框线性片段依次由ubiquitin组成型启动子(1.8kb)、SiMYB30基因(957bp)和终止子nos3’(300bp)组成。

(2)用Hind III酶切标记基因bar表达载体pSBAR，得到bar基因的线性最小表达框片段，bar基因的线性最小表达框片段由玉米ubiquitin启动子、标记基因bar和终止子nos3’组成。

3、重组菌的获得

将步骤2中获得的SiMYB30基因的线性最小表达框片段和bar基因的线性最小表达框片段共同转化农杆菌EHA105(购于北京擎科新业生物技术有限公司)，得到重组菌。

4、转基因水稻的获得

通过农杆菌侵染法将重组菌转化到水稻品种Kitaake愈伤组织中，获得T0代转基因水稻。具体转化步骤如下：

取授粉后12～14天水稻未成熟胚，70％乙醇中浸泡1分钟，然后用10％的次氯酸钠消毒15分钟，经无菌水3～5次冲洗后，超净台上取出幼胚，接种于SD₂培养基(MS基本培养基(不含维生素)+2mg/L 2，4-D+1mg/L VB1+150mg/L Asn天冬酰胺+30g/L蔗糖+2.4g/L植物凝胶，pH＝5.8)上诱导幼胚愈伤组织7天，然后将诱导的愈伤组织转到高渗培养基(MS基本培养基+5mg/L 2,4-D+0.4mol/L甘露醇+3g/L植物凝胶)上高渗处理4～6小时，高渗处理后进行农杆菌侵染，侵染后的愈伤组织在高渗培养基上继续培养16～18小时，然后将侵染后的愈伤组织转到SD₂培养基上暗培养两星期，接着将愈伤组织放到含有2～3毫克/升的除草剂Bialaphos的选择培养基(在SD₂培养基的基础上添加2-3mg/L的除草剂Bialaphos，pH＝5.8)上进行愈伤组织筛选、分化和壮苗。

5、转基因水稻的鉴定

对步骤4中获得的T0代转基因植株进行PCR鉴定，PCR扩增得到大小为217bp的植株为阳性转SiMYB30水稻(图1)，共获得5株阳性转SiMYB30水稻，阳性率为2％。经过温室加代、筛选和鉴定，选择转SiMYB30水稻株系M29893/24(简称OE24)用于下述功能验证实验。

PCR鉴定的具体步骤如下：

1)采用SDS方法提取水稻叶片DNA：取100-500mg新鲜水稻叶片置于液氮中充分研磨，转移到50mL离心管中，加入15-20mL CTAB裂解液(0.1mM Tris-HCl(pH8.0)，0.02M EDTA(pH8.0)，1.5M NaCl，2％PVP-4，2％CTAB)，65℃水浴1-2h。加入等体积酚:氯仿:异戊醇(酚:氯仿:异戊醇体积比为25:24:1)，混匀，静置5-10min，12000rpm离心10min(如果转速不能达到则延长离心时间)。取1mL上清至2mL离心管中，加入2/3体积的异丙醇沉淀DNA，-20℃下静置0.5-1h，12000rpm离心5min，倒掉上清(注意不要将沉淀倒掉)。加入1mL无水乙醇洗涤，12000rpm离心5min，倒掉上清。加入70％乙醇洗涤一次，12000rpm离心5min，倒掉上清。用枪尖吸除管里的余液，通风橱吹干，加入适量ddH₂O溶解。

2)PCR扩增：以步骤1获得的DNA为模板，根据SiMYB30基因序列设计扩增部分序列的引物进行PCR扩增，引物序列如下：

F：5’-GTAACTTCACCGACCAGGAGG-3’；

R：5’-TCCCACTGGCCCTTGGAG-3’。

PCR条件如下：94℃变性5min；94℃50sec，62℃50sec，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。

PCR反应体系如表1所示。

表1、PCR反应体系

3)PCR产物检测：PCR产物通过0.8％的琼脂糖胶检测，紫外拍照。

二、转SiMYB30水稻的耐逆性与产量相关性状分析

以步骤一中获得的转SiMYB30水稻株系M29893/24(简称OE24)为试验材料，将野生型水稻Kitaake作为对照，分析SiMYB30在调控水稻低氮耐性和产量相关性状中的应用。

1、2018年试验分析方法与结果

试验地点：江西省高安市江西省农业科学院水稻研究所转基因试验基地。秧田管理与大田生产相同。各试验材料能够正常生长。

试验方法：试验设施氮肥和不施氮肥两个处理组，每个处理组设两个重复。每份材料栽6行，每行8兜，行株距5×6寸，单本栽插。试验面积4.0亩。每组具体处理方法如下：

施氮肥处理组(正常处理组)：从移栽到收获期，每亩施纯氮12公斤。氮肥施用时间分别为返青期(移栽后6天)、分蘖期(移栽后15天)、抽穗期。施用的氮肥为尿素。

不施氮肥处理组(低氮处理组)：从移栽到收获期，不施用氮肥。

试验结果：

在水稻成熟期分别测定各材料的干谷重和稻草干重。每个处理每份材料分别取8株，三次重复。

在水稻成熟期测定各材料的单株有效穗数。每个处理每份材料分别取3株进行室内考种，三次重复。

在水稻成熟期利用凯氏定氮法分别测定各材料的稻谷含氮量和稻草含氮量。每个处理每份材料分别取8株，三次重复。含氮量检测方法具体参考文献“杨亚丽,蔡顺林.流动分析法与凯氏定氮法测定植物全氮的比较[J].玉溪师范学院学报,2016,32(08):51-54.”和“戴宏林,吴小骏.用凯氏定氮法测定植物干样品中的氮含量[J].江苏农学院学报,1995(03):70.”中的方法。

结果表明：在不施氮肥的处理下，野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的干谷重平均值分别为112.79g和156.91g；野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻草干重平均值分别为104.60g和162.98g；野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的单株有效穗数平均值为分别为6.00和8.67；野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻谷含氮量平均值分别为1.19g和1.81g；野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻草含氮量平均值分别为0.75g和1.76g。

与野生型水稻Kitaake相比，转SiMYB30水稻株系OE24的干谷重、稻草干重、单株有效穗数、稻谷含氮量、稻草含氮量均高于野生型水稻kitakke(图2)。

2、2019年试验分析方法与结果

试验地点：江西省高安市江西省农业科学院水稻研究所转基因试验基地。秧田管理与大田生产相同。各试验材料能够正常生长。

试验方法：试验设施氮肥和不施氮肥两个处理组，每个处理组设两个重复。每份材料栽6行，每行8兜，行株距5×6寸，单本栽插。试验面积4.0亩。每组具体处理方法如下：

施氮肥处理组(正常处理组)：从移栽到收获期，每亩施纯氮12公斤。氮肥施用时间分别为返青期(移栽后6天)、分蘖期(移栽后15天)、抽穗期。施用的氮肥为尿素。

不施氮肥处理组(低氮处理组)：从移栽到收获期，不施用氮肥。

试验结果：

在水稻成熟期进行拍照。表型结果如图3所示。结果显示：与野生型水稻Kitaake相比，转SiMYB30水稻株系OE24生长更好一些，更加茂盛。

在水稻成熟期测定各材料的单株有效穗数、穗长、每穗实粒数、每穗总粒数、结实率和千粒重。每个处理每份材料分别取3株进行室内考种，三次重复。结果如表2、表3和图4所示。结果显示：在施氮肥、不施氮肥的处理下，转SiMYB30水稻株系OE24的穗数、穗长、每穗实粒数、每穗总粒数和千粒重等生物产量性状均高于野生型水稻kitakke。

在水稻成熟期测定各材料的稻草重和稻谷重。每个处理每份材料分别取20株，三次重复。结果如图表4、表5和图5所示。结果显示：在施氮肥处理下，野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻草重平均值分别为390g和470g，野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻谷重平均值分别为243.3g和346.7g；在不施氮肥处理下，野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻草重平均值分别为193.3g和253.3g，野生型水稻Kitaake和转SiMYB30水稻株系OE24的稻谷重平均值分别为173.3g和203.3g。在施氮肥、不施氮肥的处理下，转SiMYB30水稻株系OE24的稻草重、稻谷重均高于野生型水稻kitakke。

在水稻成熟期利用凯氏定氮法分别测定各材料的稻谷含氮量和稻草含氮量。每份材料每个处理分别取20株，三次重复。含氮量检测方法具体参考文献“杨亚丽,蔡顺林.流动分析法与凯氏定氮法测定植物全氮的比较[J].玉溪师范学院学报,2016,32(08):51-54.”和“戴宏林,吴小骏.用凯氏定氮法测定植物干样品中的氮含量[J].江苏农学院学报,1995(03):70.”中的方法。结果如表6所示。结果显示：在施氮肥与不施氮肥的处理下，转SiMYB30水稻株系OE24稻草中的含氮量均高于野生型水稻kitakke。

表2、施氮肥组结果

表3、不施氮肥组结果

表4、施氮肥组稻草重和稻谷重

表5、不施氮肥组稻草重和稻谷重

表6、施氮肥组和不施氮肥组的含氮量

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 中国农业科学院作物科学研究所

<120> SiMYB30蛋白质及其相关生物材料在调控植物耐逆性和产量中的应用

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 1

atggtgaggc caccgtgctg tgacaaggag ggcgtcaaga agggcccgtg gacgccggag 60

gaggacctcg tcctcgtctc ctacatccag gagcacggcc ccggcaactg gcgcgccgtc 120

ccgaccagaa ccgggctgat gcggtgcagc aagagctgcc ggctgcggtg gaccaactac 180

ctccgcccgg gcatcaagcg cggtaacttc accgaccagg aggagaagct tatcgtccac 240

ctccaagctc tcctcggcaa caggtgggcg gccatcgcgt cgtacctgcc ggagcggacg 300

gacaacgaca tcaagaacta ctggaacacg cacctcaagc gtaagctgca gagcggcggc 360

gaaggcgcgg ccaaaccgcc ggcgcacagg ccggcctcgt cctccaaggg ccagtgggag 420

aggcggctgc agacggacat cgacatggcg cgccgcgcgc ttcgcgaggc cctgacgccg 480

ctcggcgacc tgaagacgca gcagcacgac ggcgtcgacg cggccggcgc tggcaccggc 540

ggcggcgaca gcccggcgtc gagctcgtcg ggcgcgtcgc agtgttcccc ctcggcggcc 600

gcgccggggc cgtacgtcct gaccacggag aacatctcgc ggatgctgga cgggtgggcc 660

ggcggcagga aggtccgccg cggcggcagt gccggcccag gcacgcccgg cggggccgag 720

agcgcgtcca ccggatcctc ggacgcgtcg gaggtgtcgt acggtggcgc cgccgtcgcg 780

tcggcggcgc cggccacggc tgggaccctc tccgaatacg agacgaagcc ggccgtcgcg 840

gccccgcaga tgccgctgtc ggcgatcgag tcttggctgt tcgacgacga cagccacttc 900

caccaagtcc agaacgccag cttgcttgac gtgcccacca tggattaccc gttctag 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 2

Met Val Arg Pro Pro Cys Cys Asp Lys Glu Gly Val Lys Lys Gly Pro

1 5 10 15

Trp Thr Pro Glu Glu Asp Leu Val Leu Val Ser Tyr Ile Gln Glu His

20 25 30

Gly Pro Gly Asn Trp Arg Ala Val Pro Thr Arg Thr Gly Leu Met Arg

35 40 45

Cys Ser Lys Ser Cys Arg Leu Arg Trp Thr Asn Tyr Leu Arg Pro Gly

50 55 60

Ile Lys Arg Gly Asn Phe Thr Asp Gln Glu Glu Lys Leu Ile Val His

65 70 75 80

Leu Gln Ala Leu Leu Gly Asn Arg Trp Ala Ala Ile Ala Ser Tyr Leu

85 90 95

Pro Glu Arg Thr Asp Asn Asp Ile Lys Asn Tyr Trp Asn Thr His Leu

100 105 110

Lys Arg Lys Leu Gln Ser Gly Gly Glu Gly Ala Ala Lys Pro Pro Ala

115 120 125

His Arg Pro Ala Ser Ser Ser Lys Gly Gln Trp Glu Arg Arg Leu Gln

130 135 140

Thr Asp Ile Asp Met Ala Arg Arg Ala Leu Arg Glu Ala Leu Thr Pro

145 150 155 160

Leu Gly Asp Leu Lys Thr Gln Gln His Asp Gly Val Asp Ala Ala Gly

165 170 175

Ala Gly Thr Gly Gly Gly Asp Ser Pro Ala Ser Ser Ser Ser Gly Ala

180 185 190

Ser Gln Cys Ser Pro Ser Ala Ala Ala Pro Gly Pro Tyr Val Leu Thr

195 200 205

Thr Glu Asn Ile Ser Arg Met Leu Asp Gly Trp Ala Gly Gly Arg Lys

210 215 220

Val Arg Arg Gly Gly Ser Ala Gly Pro Gly Thr Pro Gly Gly Ala Glu

225 230 235 240

Ser Ala Ser Thr Gly Ser Ser Asp Ala Ser Glu Val Ser Tyr Gly Gly

245 250 255

Ala Ala Val Ala Ser Ala Ala Pro Ala Thr Ala Gly Thr Leu Ser Glu

260 265 270

Tyr Glu Thr Lys Pro Ala Val Ala Ala Pro Gln Met Pro Leu Ser Ala

275 280 285

Ile Glu Ser Trp Leu Phe Asp Asp Asp Ser His Phe His Gln Val Gln

290 295 300

Asn Ala Ser Leu Leu Asp Val Pro Thr Met Asp Tyr Pro Phe

305 310 315

<210> 3

<211> 1932

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 3

ccacacagca aaaggtcagc gctgttctgt ggccgcggcg gccaccgtta tataaacact 60

gctgcacctc tccccttgga cccttgtcct caagccacca ccaccaccac aacggcacaa 120

cagcaccgcg ccggcttctt ctagctcagt tgcttgcaac gagacacgca cagatccacc 180

tcggcctgac ggttcgcgct tgttcttgta cggcgccggt ggctagcagt tagccctttt 240

gttgttgccc accacctcag ttcactcaca tcacacgcga ggctcttttt tgtctgctga 300

gaaaggggtc tctctcttag cttggtgatc catcgatcga tcgatagacg gcgacgacga 360

caccatggtg aggccaccgt gctgtgacaa ggagggcgtc aagaagggcc cgtggacgcc 420

ggaggaggac ctcgtcctcg tctcctacat ccaggagcac ggccccggca actggcgcgc 480

cgtcccgacc agaaccggta tgtgcttagc tgcttgctta ggatggtcac cctcacccat 540

gccgccatgc gtgcgtgagg gagagagaat ctagcttaga tcgttgtacg gatgcgatct 600

ggattattct gaccggttcg atcggattcc gcgcgcaggg ctgatgcggt gcagcaagag 660

ctgccggctg cggtggacca actacctccg cccgggcatc aagcgcggta acttcaccga 720

ccaggaggag aagcttatcg tccacctcca agctctcctc ggcaacaggt acggagagat 780

tttgcgttgc ttcttgtatg gactatgggc tagctcgttt gtgtgagcag ggaggctcat 840

gggcatgtgg tttttgtgta ggtgggcggc catcgcgtcg tacctgccgg agcggacgga 900

caacgacatc aagaactact ggaacacgca cctcaagcgt aagctgcaga gcggcggcga 960

aggcgcggcc aaaccgccgg cgcacaggcc ggcctcgtcc tccaagggcc agtgggagag 1020

gcggctgcag acggacatcg acatggcgcg ccgcgcgctt cgcgaggccc tgacgccgct 1080

cggcgacctg aagacgcagc agcacgacgg cgtcgacgcg gccggcgctg gcaccggcgg 1140

cggcgacagc ccggcgtcga gctcgtcggg cgcgtcgcag tgttccccct cggcggccgc 1200

gccggggccg tacgtcctga ccacggagaa catctcgcgg atgctggacg ggtgggccgg 1260

cggcaggaag gtccgccgcg gcggcagtgc cggcccaggc acgcccggcg gggccgagag 1320

cgcgtccacc ggatcctcgg acgcgtcgga ggtgtcgtac ggtggcgccg ccgtcgcgtc 1380

ggcggcgccg gccacggctg ggaccctctc cgaatacgag acgaagccgg ccgtcgcggc 1440

cccgcagatg ccgctgtcgg cgatcgagtc ttggctgttc gacgacgaca gccacttcca 1500

ccaagtccag aacgccagct tgcttgacgt gcccaccatg gattacccgt tctagctata 1560

gctatagtgt gttcgagtga tgccgctcaa gctaatcact tcaaccaggg agtgtggtca 1620

cagcgccatc gcctaaagaa aactacatag atcctacagt atgtcagtga ctaatcggtt 1680

gttgcaagtt aagttagtcg cttgatctaa gtactttact taggatctgc atagttttca 1740

tttagatgat ttcaaagaac atagtagaag cactcctatg ttattatcct tactaagact 1800

gaatatgttc ttgggccttt tggttttagc atcttcagct acaactcaag tcgatcccct 1860

tgtgcaagtt gcatattgtg tgagagaaaa taacgccagt atgtcgcaaa cttgtcataa 1920

attgtattgc ta 1932