阅读说明：本技术 一种海葡萄提取物的制备方法及其应用 (Preparation method and application of vitis amurensis extract ) 是由 王领 李萌月 原勤轩 张琳琳 刘佳伟 于 2020-03-03 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种海葡萄提取物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤：(a)将海葡萄用去离子水清洗后粉碎,然后加入去离子水、抗氧化剂加热搅拌提取；(b)冷却,粗过滤,精滤；(c)抽滤,滤液灭菌防腐；(d)醇沉,冷冻干燥得到海葡萄提取物。与现有技术相比,本发明提供的制备海葡萄提取物的方法,其提取分离操作简便,有效活性成分提取率高且最终制备出的产品纯度较高。本发明直接采用水作为溶剂,并在果胶酶或纤维素酶的酶解作用下,一是大大提高了海葡萄的提取率和有效成分的溶出率,二是提高了具有保湿抗衰老的有效成分含量。(The invention provides a preparation method of a sea grape extract, which is characterized by comprising the following steps: (a) cleaning and crushing the sea grape with deionized water, and then adding deionized water and an antioxidant, heating, stirring and extracting; (b) cooling, coarse filtering and fine filtering; (c) performing suction filtration, and sterilizing and preserving filtrate; (d) precipitating with ethanol, and freeze drying to obtain Vitis heyneana extract. Compared with the prior art, the method for preparing the sea grape extract has the advantages of simple and convenient extraction and separation operation, high extraction rate of effective active ingredients and higher purity of the finally prepared product. The invention directly adopts water as a solvent, and greatly improves the extraction rate of the sea grapes and the dissolution rate of active ingredients under the enzymolysis action of pectinase or cellulase, and improves the content of the active ingredients with the functions of moisturizing and resisting aging.)

一种海葡萄提取物的制备方法及其应用

技术领域

本发明涉及化妆品领域，更具体地说，涉及一种海葡萄提取物的制备方法。此外，本发明还涉及所述方法提取得到的海葡萄提取物的保湿抗衰老作用，具体涉及该海葡萄提取物在化妆品中的应用。

背景技术

抗衰老一直是化妆品行业中长期关注的焦点，延缓皮肤衰老，使皮肤变得更为水嫩是大部分人的追求目标之一。环境因素在一定程度上加速了我们皮肤衰老的速度，同时随着经济水平的提高以及人们对美的更高追求，使抗衰老作用的化妆品蓬勃发展。而健康皮肤的基本要素是光滑、充盈、富有弹性，随着年龄的增加，皮肤逐渐干燥、起皱、松弛，呈现老化的外观。这种衰老外观的病理机制主要分为两种，一种是皮肤水角质层含水量降低，另一种则是氧化应激引起的皮肤衰老和皮肤病的发生。所以抗衰老就要从补水与抗氧化的角度出发。因此，天然植物保湿抗衰老活性成分的出现填补了这方面的空白，受到市场和消费者的青睐。

海葡萄学名：长茎葡萄蕨藻，属于绿藻门、羽藻目、蕨藻科、蕨藻属。外观浑圆饱满，像一串串晶莹剔透的葡萄，具有独特的外形和口感，咬起来会有卜滋卜滋的声音，美丽的绿色小颗粒散发出海味的咸鲜芳香，有鱼子酱的神韵，被喻为植物中的“绿色鱼子酱”，其提取物可以作为化妆品原料广泛于配方之中。

现有的海葡萄提取工艺一般多使用乙醇等有机溶剂，例如中国台湾专利I484966，为一种将海葡萄粉以酒精进行粗萃，再依序以正己烷、乙酸己酯分离其中有效物质，并且其萃取的有效物质的功效为抑制癌症；韩国专利KR101252149使用有机溶剂萃取海葡萄，萃取物具有抗氧化、保湿的效果。以有机溶剂萃取海葡萄，将其添加到化妆品配方中可能会致敏，即使只有残留少量有机溶剂，萃取物对皮肤甚至人体均会造成危害。因此，不使用有机溶剂且萃取出具有保湿和延缓皮肤衰老作用的海葡萄提取物或活性成分成为本发明重点解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种具有保湿和延缓皮肤衰老作用的海葡萄提取物，本发明的海葡萄提取物按提供的方法制成，其主要成分为海葡萄多糖；提取得到的海葡萄提取物可作为功效原料用于保湿、延缓皮肤衰老的化妆品之中。

因此，本发明的一个目的是提供一种海葡萄提取物的制备方法，它能通过以下方法制备得到：

(a)将海葡萄用去离子水清洗后粉碎，然后加入去离子水、抗氧化剂加热搅拌提取；

(b)冷却，粗过滤，精滤；

(c)抽滤，滤液灭菌防腐；

(d)醇沉，冷冻干燥得到海葡萄提取物。

在本发明的一个实施例中，所述步骤(a)包括粉碎后加入果胶酶和/或纤维素酶，更为优选的为经去离子水稀释后的果胶酶和/或纤维素酶，其中型号为 XXL果胶酶作为果胶酶更优的选择。

在本发明的一个实施例中，所述步骤(a)中海葡萄与去离子水的质量比为1:(4-20)，抗氧化剂的质量为海葡萄质量的0.03％，所述果胶酶和/或纤维素酶用量为所述海葡萄质量的0.06％-0.15％，所述果胶酶和/或纤维素酶与去离子水按 1:(50-80)的质量比进行稀释；所述搅拌速度为50-100r/min，所述反应温度为40-60℃，所述反应时间为60-120min。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(a)中海葡萄与去离子水的质量比为1:4，所述抗氧化剂为D-抗坏血酸钠，所述果胶酶和/或纤维素酶用量为所述海葡萄质量的0.1％，所述果胶酶和/或纤维素酶与去离子水按1:60的质量比进行稀释；所述搅拌速度为60r/min，所述反应温度为60℃，所述反应时间为120min。

在本发明的一个实施例中，所述步骤(b)包括灭酶。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(b)中灭酶温度70-100℃，灭酶时间15-30min；所述冷却步骤的终温度为20-50℃；所述粗过滤所用纱布目数为60-200目；所述精滤所用滤板孔径为1-10μm。更为优选的，所述步骤(b)中灭酶温度85℃，灭酶时间20min；所述冷却步骤的终温度为30℃；所述粗过滤所用纱布目数为200 目；所述精滤所用滤板孔径为10μm。

在本发明的一个实施例中，所述步骤(c)中抽滤所用滤板孔径为0.1-1μm，所述灭菌温度85-95℃，灭菌时间为20-40min，所述防腐剂选自苯氧乙醇液体或PE9010，所述防腐剂用量为抽滤后海葡萄提取物滤液质量的0.8％。在本发明的一个优选实施例中，所述步骤(c)的冷却步骤的终温度为30℃；所述过滤所用滤板孔径为0.2-0.45μm，所述灭菌条件为灭菌温度90℃，灭菌时间为30 min。

在本发明的一个实施例中，所述步骤(d)中醇沉所用乙醇的质量分数为 70％-90％；醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h后，放置于冷冻干燥机中进行冻干粉制备。

本发明的另一目的在于提供一种利用上述海葡萄提取物的制备方法制备得到的海葡萄提取物。所述海葡萄提取物中的有效成分主要为多糖，海葡萄多糖具有保湿、抗皮肤老化、刺激胶原蛋白地生物合成、紧致皮肤、减少皱纹的作用。所述海葡萄提取物中多糖的含量为526-816mg/g。

本发明的又一目的在于提供按照本发明方法制备得到的海葡萄提取物的应用，尤其是在具有保湿、抗衰老作用的化妆品中的应用，如柔肤水、乳液、眼霜等。

与现有技术相比，本发明提供的制备海葡萄提取物的方法，其提取分离操作简便，有效活性成分提取率高且最终制备出的产品纯度较高，产品质量有很大的提高。本发明摒弃了传统的利用有机溶剂提取的方法，直接采用水作为溶剂，并在果胶酶或纤维素酶的酶解作用下，一是大大提高了海葡萄的提取率和有效成分的溶出率，二是提高了具有保湿抗衰老的有效成分含量，本发明所指的有效成分不同于用乙醇等有机溶剂提取得到的醇溶物质。

附图说明

图1为本发明提供的海葡萄提取物的生产工艺流程图。

图2为本发明提供的海葡萄提取物短效保湿实验结果图。

图3为本发明提供的海葡萄提取物皮肤弹性结果图。

图4为本发明提供的海葡萄提取物DPPH自由基清除结果图。

具体实施方式

下面结合具体的实施例进一步阐述本发明。但是，应该明白，这些实施例仅用于说明本发明而不构成对本发明范围的限制。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件。除非另有说明，所有的百分比和份数按重量计。

本发明中海葡萄的产地为海南，购于海南省近海养殖场；

果胶酶或纤维素酶购于诺维信(中国)生物技术有限公司；

PE9010购于德国舒美公司。

实施例1海葡萄提取物的制备

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为4的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.06％的纤维素酶和果胶酶的混合物，其中纤维素酶和果胶酶的混合物与去离子水按1:50的质量比进行稀释；于反应温度为40℃、搅拌速度为50r/min的速度搅拌提取120min；

(b)升温到70℃搅拌30min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到20℃，使用60目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为1μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为0.1μm的滤板过滤，透亮浅绿色液体；测定pH值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为4.7～6.2、固含量为0.55～1.1％、电导率为550～1010μs/cm²；之后于85℃下保温20min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为90％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

实施例2：海葡萄提取物的制备

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为20的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.15％的果胶酶，果胶酶与去离子水按1:60的质量比进行稀释；于反应温度为60℃、搅拌速度为100r/min 的速度搅拌提取60min；

(b)升温到100℃搅拌15min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到50℃，使用150目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为8μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为1μm的滤板过滤，得到透亮浅绿色液体；测定pH值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为4.6～6.3、固含量为0.59～0.98％、电导率为530～1000μs/cm²；之后于95℃下保温40min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为70％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

实施例3：海葡萄提取物的制备。

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为13的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.08％的纤维素酶，其中纤维素酶与去离子水按1:70的质量比进行稀释；于反应温度为45℃、搅拌速度为 80r/min的速度搅拌提取80min；

(b)升温到80℃搅拌25min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到40℃，使用100目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为5μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为0.2μm的滤板过滤，得到透亮浅绿色液体；测定pH 值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为4.5～6.0、固含量为0.6～1.05％、电导率为500～1000μs/cm²；之后于88℃下保温35min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为80％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

实施例4：海葡萄提取物的制备。

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为10的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.1％的果胶酶，其中果胶酶与去离子水按1:80的质量比进行稀释；于反应温度为50℃、搅拌速度为60r/min 的速度搅拌提取90min；

(b)升温到85℃搅拌20min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到30℃，使用200目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为10μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为0.45μm的滤板过滤，得到透亮浅绿色液体；测定pH 值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为4.5～5.8、固含量为0.7～1.0％、电导率为500～1000μs/cm²；之后于90℃下保温30min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为90％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

实施例5：海葡萄提取物的制备。

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为17的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.12％的纤维素酶，其中纤维素酶与去离子水按1:65的质量比进行稀释；于反应温度为55℃、搅拌速度为 90r/min的速度搅拌提取100min；

(b)升温到90℃搅拌18min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到35℃，使用180目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为7μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为0.35μm的滤板过滤，得到透亮浅绿色液体；测定pH 值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为5.0～6.5、固含量为0.65～0.95％、电导率为520～1000μs/cm²；之后于92℃下保温25min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为90％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

实施例6：海葡萄提取物的制备。

(a)称取清洗干净的海葡萄10kg，用去离子水清洗其表面置于胶体磨中，胶体磨稍微加去离子水磨碎之后，加入与海葡萄质量比为9的去离子水；加入海葡萄重0.03％的D-抗坏血酸钠，加入海葡萄重0.12％的果胶酶，其中果胶酶与去离子水按1:55的质量比进行稀释；于反应温度为53℃、搅拌速度为70r/min 的速度搅拌提取70min；

(b)升温到75℃搅拌27min进行灭酶；停止加热，水循环冷却到25℃，使用80目纱布粗滤；取滤液，使用滤板孔径为4μm的滤板精滤，得到淡绿色液体；

(c)使用滤板孔径为0.3μm的滤板过滤，得到透亮浅绿色液体；测定pH 值、固含量、电导率，测定结果为：pH值为4.8～6.4、固含量为0.62～0.99％、电导率为500～1000μs/cm²；之后于87℃下保温28min，灭菌；水浴降温至室温，加入海葡萄提取溶液质量的0.8％的苯氧乙醇液体防腐剂；

(d)使用质量分数为90％的乙醇进行醇沉，醇沉后的沉淀在-75℃冷冻24h 后，放置于冷冻干燥机中干燥24h，得到最终的海葡萄提取物。

对比例1

本实施例中除步骤(a)中不加纤维素酶和果胶酶的混合物外，其余提取步骤和方法均与实施例1相同。

对比例2

本实施例中除步骤(a)中不加纤维素酶，只加果胶酶外，其余提取步骤和方法均与实施例1相同。

对比例3

本实施例中除步骤(a)中不加果胶酶，只加纤维素酶外，其余提取步骤和方法均与实施例1相同。

采用苯酚—硫酸法测总糖含量，步骤如下：

1)标准曲线的绘制：

准确吸取1mg/mL葡萄糖标准溶液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL置于50mL 容量瓶定容。准确吸取该系列溶液各2.0mL(另取2.0mL去离子水做空白对照)，分别置于具塞刻度试管中，进行比色反应，可绘得标准曲线。

2)比色反应：

①取待测样(粗多糖用热水溶解定容于50mL容量瓶)2.0mL放入15mL具塞刻度试管中(以2.0mL去离子水做空白对照)，加1.0mL5％苯酚溶液，振荡混合均匀；

②加入5.0mL浓硫酸，混匀5min后，封管沸水浴1h；

③取出后冷却至室温，在490mm处测吸光值。

3)计算公式：

W＝(△A+0.0049)×V/0.0101

W：提取液中多糖含量(μg)

△A：反应液吸光值

V：待测液体积(mL)

4)海葡萄提取物多糖含量：

根据苯酚—硫酸法测总糖含量的葡萄糖标准曲线，标准曲线回归方程为：

Y＝0.0101X－0.0049，R2＝0.9999。

按照上述方法分别测定实施例1、对比例1-3制备的海葡萄提取物中多糖的含量如下表所示：

表1有无果胶酶或者纤维素酶对海葡萄提取物多糖含量的影响

果胶是存在于初生细胞壁和细胞间质中一类高分子多糖，起着“粘合”细胞的作用，当其降解时，会导致细胞分离。果胶酶能够瓦解植物细胞的细胞壁，使细胞内的有效成分如海葡萄多糖等成分更快的溶出，提高提取率；还可以起到澄清作用，降低粘度，使提取物澄清透亮。而纤维素酶是降解纤维素的一组酶系的总称，植物细胞壁的主要成分是纤维素，经过纤维素的酶解，使细胞壁更易破坏，有效成分更易溶出。从表1的数据中能够看出，加入果胶酶和/或纤维素酶进行酶解，能够大大提高海葡萄的提取率和有效成分的溶出率。

对比例4醇沉前后海葡萄提取物中多糖提取率的对比

以实施例1为例，利用上述苯酚—硫酸法测总糖含量的方法测定醇沉前后海葡萄提取物中多糖的含量，结果见表2.

表2不同浓度酒精醇沉对海葡萄提取物多糖含量的影响

从表2的实验数据中可以看出，醇沉作用可以更加有效的提高海葡萄提取物中多糖的含量，进而提高其在化妆品中保湿抗衰老的功效。

实施例7人体敏感试验

选取30位志愿者，男女各半，实验前，将志愿者左、右前臂分别用清水清洗干净，静坐在温度为20-22℃，相对湿度为50-60％的环境下，受试者未擦用任何化妆品的情况下进行皮肤敏感实验。

将受试者左前臂涂抹上述实施例1制备的海葡萄提取物，每半小时涂抹一次，共涂抹6次，涂抹面积为3×3cm²，右前臂作为空白对照不涂抹任何产品。

实验结果显示在30名受试者中，没有产生小红斑等情况，说明上述实施例制备的海葡萄提取物具有较佳的安全性。

以下海葡萄提取物性能测试均以实施例1制备得到的海葡萄提取物为样品进行试验。

实施例8人体保湿实验。

实验原理：人体保湿实验，由特定实验人群组成受试群体，测试受试者使用化妆品(以及化妆品功效成分)前后皮肤水分以及水分散失的变化，从而确定化妆品(或功效成分)的保湿功效。

实验方法：选年龄段在15岁到60岁志愿者，男女各15名。

(1)选择受试者左、右手臂依次循环标记：受试区域样品组和空白对照区域，其中样品组为2％的海葡萄提取物溶液、2％的透明质酸钠溶液、2％的银耳多糖溶液；

(2)技术人员使用皮肤含水量测试仪CorneometerCM825、取平均值，记为空白值。

(3)在受试者经清水清洗过的实验部位涂抹送检样品。

(4)受试者在连续使用化妆品一小时、两小时、四小时后，由技术人员使用皮肤含水量测试仪CorneometerCM825测量5次，取平均值。

(5)统计测得的数值，分析其皮肤水分含量变化规律。

受试者皮肤表面的平均水份含量百分比随时间的变化曲线如图2所示。结果表明，海葡萄提取物具有良好的长效保湿效果。也表明它具有良好的增强皮肤屏障功能的特性。

实施例9皮肤弹性试验

实验原理：皮肤弹性实验，由特定实验人群组成受试群体，测试受试者使用化妆品(以及化妆品功效成分)前后皮肤弹性的变化，从而确定化妆品(或功效成分)的抗衰老功效。

实验仪器：MPA580

实验条件：室温(25±1)℃、湿度(40±5)％、受试者90人，45人为女性， 45人为男性，30-50周岁。

实验方法：

a.测试前，90名受试者分成9组，每组10个人，并且性别年龄分布相同，每组使用添加海葡萄提取液的精华，受试者均用温水清洗脸部，30分钟后，开始测试；

b.选择受试者眼角外侧1cm处作为测试区；检测记录初始数据。

c.测试人员使用MPA580，对测试区域进行测试；

d.受试者每天早晚眼部眼角外侧1cm处肌肤均涂抹2±0.1mg/cm²的精华；

e.每周对受试者进行测试，连续检测5周，并记录测试数据；

f.将每周测得的测试数据取平均值R2、Q1，评估产品的祛皱效果。

由图3可知，测试周期内，R2、Q1值均为上升趋势，R2和Q1值越接近1，皮肤弹性越好，添加海葡萄提取液的精华具有较佳的祛皱延缓皮肤衰老的效果。

实施例10DPPH自由基清除实验

实验原理：DPPH·(1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基)在有机溶剂中是一种稳定的长寿命自由基，其孤对电子在517nm附近有强吸收(显深紫色)。当有清除剂存在时，孤对电子被配对，吸收消失或减弱，通过测定吸收减弱的程度，可评价自由基清除剂的活性。DPPH·法用以评价抗氧化剂抗氧化活性是一种快速、简便、灵敏可行的方法。

试剂配置：20mmol/L的DPPH溶液配置法：20mgDPPH溶液以无水乙醇定容至250ml得20mmol/L的DPPH溶液。

实验步骤：取0.5ml质量分数为1％、2％、3％、4％、5％海葡萄提取物溶液和1ml浓度为20mmol/L的DPPH溶液于比色管中，摇匀，反应10min。用无水乙醇作空白调零后，取1ml溶液于比色皿中，测定波长为517nm的吸光度值A 样品，取1ml浓度为20mmol/L的DPPH溶液于比色皿中，测定波长为517nm 的吸光度值A₀。

自由基清除率计算公式：清除率(％)＝(A₀－A_样品)/A₀×100％

由图4可知，随着浓度的上升，DPPH自由基清除率也上升，证明该提取物有较好的自由基清除能力。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。