阅读说明：本技术 一种护肤组合物及其应用 (A kind of skin care compositions and its application ) 是由 许科辉 于 2019-08-09 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种护肤组合物,其原料包括小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和大麻叶。所述小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和大麻叶的重量之比为(2-5):(2-5):(0.5-2):(0.5-2)。本发明还公开了上述护肤组合物在制备护肤品方面的应用和由其制备的一种护肤品。本发明的护肤组合物具有良好的抗氧化、润养、强化皮肤屏障和提亮肤色的功效,同时具有显著的改善皮肤粗糙度、抗炎效果,使用后皮肤柔细平滑。制备方法工艺简单、提取效率高、产品安全性好。(The invention discloses a kind of skin care compositions, raw material includes chlorella, dendrobium candidum, Herba Cistanches and marihuana.The chlorella, dendrobium candidum, Herba Cistanches and marihuana weight ratio be (2-5): (2-5): (0.5-2): (0.5-2).The application and a kind of skin care item prepared therefrom that the invention also discloses above-mentioned skin care compositions in terms of preparing skin care item.Skin care compositions of the invention has effects that good anti-oxidant, profit supports, strengthens skin barrier and bright color, while tool is significantly improved skin roughness, antiphlogistic effects, soft and fine smooth using rear skin.Preparation method simple process, extraction efficiency are high, Product Safety is good.)

一种护肤组合物及其应用

技术领域

本发明涉及一种护肤组合物，以及该组合物在制备护肤品方面的应用。

背景技术

随着社会的不断发展与进步，人们越来越重视保养，使个人形象得到提升，个人形象的好坏可以从侧面影响一个人的自信，同时也能够给个人带来一定的动力，更好的跟周围的朋友相处；而护肤品，是指保护皮肤的产品，分为面膜、眼霜、面霜、精华素、洁面乳、原液等等，也正因为随着社会经济的不断进步和物质生活的丰富，护肤品，不再是过去只有富人才用的起的东西，护肤品走进了平常百姓家，每家每户都用着不同的护肤品，它给人们的精神、形象提升起到了极大的作用。

皮肤是由若干细胞层组成，它们覆盖并保护构成其结构骨架的角蛋白和胶原纤维蛋白。其最外层称为角质层，人们已经知道它们由被8nm厚层包围的25nm蛋白束组成。现在，人们已经认识到在角质层上保持适宜的水分梯度对于其功能来说较为重要。大部分的水来自于体内。如果皮肤周围空气中的湿度太低，则保留在角质层外层中的水分不足，从而完全使皮肤塑化。另一方面，皮肤外表存在太多的水分就会使角质层最终吸收3至5倍于其自身重量的结合水。这会使皮肤溶胀和起皱，并且导致水和可成为皮肤刺激物的其它极性分子对皮肤的渗透性增加2至3倍。

现有的护肤品，分为多种功能，有美白、保湿、去油、祛痘等等功能，但一款产品无法同时满足消费者对于抗氧化、提亮肤色等多个方面的需求，所以需要一款集抗氧化、润养、强化皮肤屏障并能提亮肤色的护肤品。

发明内容

本发明的目的在于根据现在人们对护肤品的功能需求，提供一种护肤组合物及其制备方法，以及该护肤组合物的应用，本发明的护肤组合物具有良好的抗氧化、润养、强化皮肤屏障和提亮肤色的功效，同时具有显著的改善皮肤粗糙度、抗炎效果，使用后皮肤柔细平滑。本发明护肤组合物的制备方法工艺简单、提取效率高、产品安全性好。同时，本发明的护肤组合物具有良好的成膜特性，润滑、亲肤，可用作护肤品的原料使用，可广泛应用于多种剂型的护肤品，如乳液、膏霜、护肤水、啫喱等中。

根据本发明的一个方面，提供了一种护肤组合物，其原料包括小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和***叶。

根据本发明的优选实施方式，所述小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和***叶的重量之比为(2-5):(2-5):(0.5-2):(0.5-2)。

根据本发明的优选实施方式，所述护肤组合物包括小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物的重量之比为(2-5):(2-5):(0.5-2):(0.5-2)，优选为(2.5-4.5):(2.5-4.5):(0.8-1.5):(0.8-1.5)。

根据本发明的优选实施方式，所述小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物均为水提物。

根据本发明的优选实施例，所述小球藻提取物的制备方法包括：

1)将小球藻原料与水混合，得到混合液；

2)将所述混合液进行均质处理，然后将其加热至45-85℃，保持1-5h；

3)对步骤2)得到的混合液进行过滤处理，滤液即为小球藻提取物。

根据本发明的一些实施例，所述步骤1)中小球藻原料的质量(g)与水的体积(mL)之比为1/(10-50)，优选为1/(10-45)，更优选为1/(15-40)，进一步优选为1/(20-35)。

本发明人研究发现，在制备提取物的过程中，小球藻与水的料液比对提取效果至关重要，若水的用量过多，则造成水资源的浪费，降低提取率；若水的用量过少，则活性成分不能充分溶出，提取率低。选择本发明的料液比可获得较好的提取效率。

根据本发明的优选实施方式，所述小球藻原料的粒径为80-120目，例如可通过粉碎过筛等方法对小球藻原料处理，得到符合粒径要求的小球藻原料。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤2)中均质处理的时间为5-15min。均质方法为本领域技术人员已知的，例如可通过均质机进行均质处理。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热至45-85℃，优选50-80℃，更优选55-75℃。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热后，保持1-5h，优选2-4h。

本发明人研究发现，在制备提取物的过程中，提取的温度和时间对提取效果至关重要，提取温度过低或者时间过短，则提取效率低，活性成分不能充分溶出；提取温度过高或者时间过长，则耗费资源、提高生产成本，同时导致活性成分变性。提取时间过长，特别是过夜处理，在湿热天气下更容易滋生微生物，除降低提取率外，还会给防腐带来负担。

选择本发明的提取的温度和时间，可获得较好的提取效率，在工业化生产中降低生产成本方面具有现实意义。

根据本发明的一个实施例，所述小球藻提取物的制备方法还包括：步骤3a)对所述滤液进行脱色处理，得到小球藻提取物。

在一些具体的实施例中，优选使用活性炭对所述滤液进行脱色处理。例如向滤液中加入0.5-1.5％的活性炭，在65-85℃的温度下脱色30-150min，然后过滤，得到的滤液即为脱色后的小球藻提取物。

根据本发明的优选实施例，所述小球藻为南极小球藻。其为蛋白核小球藻的一种，来源为南极冰原水生长的小球藻。

根据本发明的一些实施方式，所述铁皮石斛提取物的制备方法包括：

1)将铁皮石斛原料与水混合，得到混合液；

2)将所述混合液进行均质处理，然后将其加热至45-85℃，保持1-5h；

3)对步骤2)得到的混合液进行过滤处理，滤液即为铁皮石斛提取物。

根据本发明的一些实施例，所述步骤1)中铁皮石斛原料的质量(g)与水的体积(mL)之比为1/(10-50)，优选为1/(10-45)，更优选为1/(15-40)，进一步优选为1/(20-35)。

本发明人研究发现，在制备铁皮石斛提取物的过程中，铁皮石斛与水的料液比对提取效果至关重要，若水的用量过多，则造成水资源的浪费，降低提取率；若水的用量过少，则活性成分不能充分溶出，提取率低。选择本发明的料液比可获得较好的提取效率。

根据本发明的优选实施方式，所述铁皮石斛原料的粒径为80-100目，例如可通过粉碎过筛等方法对铁皮石斛原料处理，得到符合粒径要求的铁皮石斛原料。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤2)中均质处理的时间为5-15min。均质方法为本领域技术人员已知的，例如可通过均质机进行均质处理。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热至45-85℃，优选50-80℃，更优选55-75℃。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热后，保持1-5h，优选2-4h。

本发明人研究发现，在制备提取物的过程中，提取的温度和时间对提取效果至关重要，提取温度过低或者时间过短，则提取效率低，活性成分不能充分溶出；提取温度过高或者时间过长，则耗费资源、提高生产成本，同时导致活性成分变性。提取时间过长，特别是过夜处理，在湿热天气下更容易滋生微生物，除降低提取率外，还会给防腐带来负担。

选择本发明的提取的温度和时间，可获得较好的提取效率，在工业化生产中降低生产成本方面具有现实意义。

根据本发明的一个实施例，所述铁皮石斛提取物的制备方法还包括：步骤3a)对所述滤液进行脱色处理，得到铁皮石斛提取物。

在一些具体的实施例中，优选使用活性炭对所述滤液进行脱色处理。例如向滤液中加入0.5-1.5％的活性炭，在65-85℃的温度下脱色45-90min，然后过滤，得到的滤液即为脱色后的铁皮石斛提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述肉苁蓉提取物的制备方法包括：

1)将肉苁蓉原料与水混合，得到混合液；

2)将所述混合液进行均质处理，然后将其加热至45-85℃，保持1-5h；

3)对步骤2)得到的混合液进行过滤处理，滤液即为肉苁蓉提取物。

根据本发明的一些实施例，所述步骤1)中肉苁蓉原料的质量(g)与水的体积(mL)之比为1/(10-50)，优选为1/(10-45)，更优选为1/(15-40)，进一步优选为1/(20-35)。

本发明人研究发现，在制备肉苁蓉提取物的过程中，肉苁蓉与水的料液比对提取效果至关重要，若水的用量过多，则造成水资源的浪费，降低提取率；若水的用量过少，则活性成分不能充分溶出，提取率低。选择本发明的料液比可获得较好的提取效率。

根据本发明的优选实施方式，所述肉苁蓉原料的粒径为40-60目，例如可通过粉碎过筛等方法对肉苁蓉原料处理，得到符合粒径要求的肉苁蓉原料。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤2)中均质处理的时间为5-15min。均质方法为本领域技术人员已知的，例如可通过均质机进行均质处理。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热至45-85℃，优选50-80℃，更优选55-75℃。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热后，保持1-5h，优选2-4h。

本发明人研究发现，在制备提取物的过程中，提取的温度和时间对提取效果至关重要，提取温度过低或者时间过短，则提取效率低，活性成分不能充分溶出；提取温度过高或者时间过长，则耗费资源、提高生产成本，同时导致活性成分变性。提取时间过长，特别是过夜处理，在湿热天气下更容易滋生微生物，除降低提取率外，还会给防腐带来负担。

选择本发明的提取的温度和时间，可获得较好的提取效率，在工业化生产中降低生产成本方面具有现实意义。

根据本发明的一个实施例，所述肉苁蓉提取物的制备方法还包括：步骤3a)对所述滤液进行脱色处理，得到肉苁蓉提取物。

在一些具体的实施例中，优选使用活性炭对所述滤液进行脱色处理。例如向滤液中加入0.5-1.5％的活性炭，在65-85℃的温度下脱色45-90min，然后过滤，得到的滤液即为脱色后的肉苁蓉提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述***叶提取物的制备方法包括：

1)将***叶原料与水混合，得到混合液；

2)将所述混合液进行均质处理，然后将其加热至45-85℃，保持1-5h；

3)对步骤2)得到的混合液进行过滤处理，滤液即为***叶提取物。

根据本发明的一些实施例，所述步骤1)中***叶原料的质量(g)与水的体积(mL)之比为1/(10-50)，优选为1/(10-45)，更优选为1/(15-40)，进一步优选为1/(20-35)。

本发明人研究发现，在制备***叶提取物的过程中，***叶与水的料液比对提取效果至关重要，若水的用量过多，则造成水资源的浪费，降低提取率；若水的用量过少，则活性成分不能充分溶出，提取率低。选择本发明的料液比可获得较好的提取效率。

根据本发明的优选实施方式，所述***叶原料的粒径为24-40目，例如可通过粉碎过筛等方法对***叶原料处理，得到符合粒径要求的***叶原料。

根据本发明的优选实施方式，所述步骤2)中均质处理的时间为5-15min。均质方法为本领域技术人员已知的，例如可通过均质机进行均质处理。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热至45-85℃，优选50-80℃，更优选55-75℃。

根据本发明的优选实施方式，步骤2)中将所述混合液加热后，保持1-5h，优选2-4h。

本发明人研究发现，在制备提取物的过程中，提取的温度和时间对提取效果至关重要，提取温度过低或者时间过短，则提取效率低，活性成分不能充分溶出；提取温度过高或者时间过长，则耗费资源、提高生产成本，同时导致活性成分变性。提取时间过长，特别是过夜处理，在湿热天气下更容易滋生微生物，除降低提取率外，还会给防腐带来负担。

选择本发明的提取的温度和时间，可获得较好的提取效率，在工业化生产中降低生产成本方面具有现实意义。

根据本发明的一个实施例，所述***叶提取物的制备方法还包括：步骤3a)对所述滤液进行脱色处理，得到***叶提取物。

在一些具体的实施例中，优选使用活性炭对所述滤液进行脱色处理。例如向滤液中加入0.5-1.5％的活性炭，在65-85℃的温度下脱色45-90min，然后过滤，得到的滤液即为脱色后的***叶提取物。

根据本发明的一些实施方式，所述组合物还包括甘油和防腐剂，以所述护肤组合物的质量为100％计，所述甘油的质量含量为10-40％，所述防腐剂的质量含量为0.5-2.0％。

根据本发明的优选实施方式，所述防腐剂为多元醇防腐剂，优选包括丁二醇、1,2-戊二醇、1,2-己二醇和辛甘醇中的至少一种。

根据本发明的一些实施方式，所述护肤组合物可通过如下方法制备：

1)分别制备小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物；

2)将上述小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物与甘油和防腐剂混合，灭菌，即得。

根据本发明的优选实施例，所述小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物的制备方法如上所述。

根据本发明的优选实施方式，所述灭菌处理为在80-95℃下处理20-40min，优选在85-95℃下处理30min。

根据本发明的一些实施方式，所述护肤组合物还可通过如下方法制备：

A)将小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和***叶的混合原料与水混合，得到混合液；

B)将所述混合液进行均质处理，然后将其加热至45-85℃，保持1-5h；

C)对步骤B)得到的混合液进行过滤处理，得到滤液；

E)将滤液与甘油和防腐剂混合，灭菌，即得。

根据本发明的优选实施方式，步骤A)中小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和***叶原料的重量之比为(2-5):(2-5):(0.5-2):(0.5-2)。

根据本发明的一些实施例，所述混合原料的质量(g)与水的体积(mL)之比为1/(10-50)，优选为1/(10-45)，更优选为1/(15-40)，进一步优选为1/(20-35)。

根据本发明的优选实施方式，所述方法还包括：步骤D)对步骤C)的滤液进行脱色处理，得到脱色后的滤液。

根据本发明的优选实施方式，所述灭菌处理为在80-95℃下处理20-40min，优选在85-95℃下处理30min。

根据本发明的另一个方面，提供了上述护肤组合物在制备护肤品方面的应用。本发明的护肤组合物可应用于多种剂型的护肤品，如乳液、膏霜、护肤水、啫喱等中。

根据本发明的另一个方面，提供了一种护肤品，包括根据本发明上个方面提供的护肤组合物。

本发明的优点和有益技术效果包括：

1、本发明护肤组合物的原料南极小球藻有助于促进细胞活力、抵抗自由基，具有较好的抗氧化效果；铁皮石斛有助于促进肌肤水通道蛋白表达；肉苁蓉有助于提升肌肤的免疫力和抵御力；***叶有助于肌肤细胞的排浊，提升肌肤亮度。

2、本发明采用特殊的方法制备各原料提取物，进而制备护肤组合物，不使用有机溶剂，方法简便安全，且提取效率高。

3、本发明的护肤组合物具有良好的抗氧化、润养、强化皮肤屏障和提亮肤色的功效，同时具有显著的改善皮肤粗糙度、抗炎效果，使用后皮肤柔细平滑，同时具有良好的成膜特性，润滑、亲肤，可用作护肤品的原料使用。

4、制备工艺简单，更有利用工业化生产。

附图说明

图1为给药实施例6的护肤组合物的细胞的AQP3蛋白表达情况图；

图2为实施例6的护肤组合物对透明质酸酶的抑制功效图；

图3为采用实施例6的护肤组合物制备的护肤品对皮肤屏障损伤的修复效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例，对本发明做进一步详细说明：

下述实施例中使用的南极小球藻购自青岛旭能生物工程有限责任公司，呈深绿色细分状物质；铁皮石斛购自普洱达润石斛种植有限公司，呈扁圆柱形的段，有深纵沟或纵棱，有的可见棕褐色的节，切面黄白色至黄褐色，有多数散在的筋脉点，表面金黄色、绿黄色或棕黄色，带有少量紫色细纹；肉苁蓉购自豪州市承辉药业销售有限公司，成扁圆柱形，稍弯曲，表面棕褐色或灰棕色至黑色，密被覆瓦状排列的肉质鳞叶，断面棕褐色，体重，质硬，略带柔性，不易折断；***叶，购于豪州市承辉药业销售有限公司，叶掌状全裂，裂片披针形或线状披针形，先端渐尖，基部狭楔形，表面深绿，微被糙毛，背面幼时密被灰白色贴状毛后变无毛，边缘具向内弯的粗锯齿，密被灰白色贴伏毛。

按照如下方法对护肤组合物进行自由基清除率测定：

衰老是一个复杂的过程，其中自由基学说就是公认的抗衰老学说之一。而清除ABTS自由基是分析抗氧化剂的一种常规方式。试验中用清除率表示受试物清除自由基的能力，清除率越大，则表示其抗氧化能力越强。

具体试验方法：

取0.0192gABTS加入5.00mL去离子水溶解，混匀，制备成7mmol·L^-1的ABTS储备液。称取0.1892g过硫酸钾，加入5.000mL去离子水溶解，混匀，制备成140mmol·L^-1的储备液。将一定量的7mmol·L^-1的ABTS和140mmol·L^-1的过硫酸钾混合，在室温避光下静置一段时间后，形成ABTS自由基储备液。取一定量的ABTS自由基储备液，用50％乙醇稀释，使最终测试阴性对照吸光值为0.70±0.02。

将受试的护肤组合物用50％乙醇稀释成质量浓度为2.0％的测试液。将测试液、ABTS自由基储备液依次加入，涡旋混匀，置于酶标仪避光孵育，每间隔20min，用酶标仪在波长734nm处测定其吸光值。按式(1)计算ABTS自由基清除率。

式(1)中：A为测试液与ABTS溶液混合后OD值，B为50％乙醇与ABTS溶液混合后OD值，C为50％乙醇与测试液混合后OD值。

实施例1-35

1)将一定量的南极小球藻、铁皮石斛、肉苁蓉和***叶原料加入一定体积的水中，得到混合液；

2)对所述混合液进行均质处理5-15min；

3)将所述混合液加热至45-85℃，保持1-5h进行提取；

4)对步骤3)得到的混合液进行过滤处理，然后加入1％的活性炭进行脱色60-80min；

5)脱色后的滤液与甘油和防腐剂混合，85-95℃下灭菌处理30min，即得到护肤组合物；其中组合物中甘油的含量为25％，防腐剂1,2-戊二醇的含量为1％。

按照上述方法测定步骤5)制得的护肤组合物的自由基清除率数据，实施例中的工艺数据和结果见表1。

实施例36

1、南极小球藻提取物的制备：

1)将3g南极小球藻加入到90mL水中，得到混合液；

2)对所述混合液进行均质处理10min；

3)将所述混合液加热至80℃，保持3h进行提取；

4)对步骤3)得到的混合液进行过滤处理，然后加入1％的活性炭进行脱色处理60-80min，脱色后的滤液即为南极小球藻提取物。

2、铁皮石斛提取物的制备：

1)将4g铁皮石斛加入到120mL水中，得到混合液；

2)对所述混合液进行均质处理10min；

3)将所述混合液加热至80℃，保持3h进行提取；

4)对步骤3)得到的混合液进行过滤处理，然后加入1％的活性炭进行脱色处理60-80min，脱色后的滤液即为铁皮石斛提取物。

3、肉苁蓉提取物的制备：

1)将1.5g肉苁蓉加入到45mL水中，得到混合液；

2)对所述混合液进行均质处理10min；

3)将所述混合液加热至80℃，保持3h进行提取；

4)对步骤3)得到的混合液进行过滤处理，然后加入1％的活性炭进行脱色处理60-80min，脱色后的滤液即为肉苁蓉提取物。

4、***叶提取物的制备：

1)将1.5g***叶加入到45mL水中，得到混合液；

2)对所述混合液进行均质处理10min；

3)将所述混合液加热至80℃，保持3h进行提取；

4)对步骤3)得到的混合液进行过滤处理，然后加入1％的活性炭进行脱色处理60-80min，脱色后的滤液即为***叶提取物。

5、将上述小球藻提取物、铁皮石斛提取物、肉苁蓉提取物和***叶提取物与一定量的甘油和防腐剂混合，85-95℃下灭菌处理30min，即得到本发明护肤组合物；其中组合物中甘油的含量为25％，防腐剂1,2-戊二醇的含量为1％。

测定制得的护肤组合物的自由基清除率数据，实施例中的工艺数据和结果见表1。

实施例37

同实施例1，但是用40％的乙醇水溶液替换步骤1)中的水，数据和测定结果见表1。

表1

促进角质形成细胞水通道蛋白AQP3表达试验

实验原理：

AQP3是一种细胞膜上的跨膜转运蛋白，是人类皮肤中最主要的一种水通道蛋白亚型，它属于水-甘油通道蛋白亚家族。在皮肤的生理过程中，AQP3可以转运水、甘油到达表皮，对表皮的屏障作用及保水作用有重要意义。

采用免疫荧光法，评估护肤组合物对角质形成细胞合成AQP3能力的影响。免疫荧光法是利用抗原和抗体结合的原料，对角质形成细胞AQP3进行荧光标记，生成的荧光强度与目标蛋白的合成量成正比。

实验方法：

(1)基于角质形成细胞的MTT检测

样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度设置8个复孔，实验设置溶剂对照孔和调零孔，采用MTT细胞活性检测方法，筛选样品在角质形成细胞中的最大安全剂量。

细胞接种：取对数生长期细胞消化后接种至96孔板。

样品配制：将实施例6的护肤组合物配制成不同给药剂量的样品，各样品的浓度分别为2000ppm、1000ppm、500ppm、250ppm、125ppm、62.5ppm、31.3ppm、15.6ppm。

给药：待细胞铺板率达到40％时，开始给药。

培养：给药完成后，将培养板放置在37℃、5％的CO₂培养箱中培养。

检测：细胞孵育培养24h后，弃掉上清，加入事先配好的MTT，37℃避光孵育。4h后弃掉上清，每孔加150μL二甲基亚砜，酶标仪490nm读取OD值。

计算：根据读取的OD值计算细胞活力。

计算公式：

(2)基于角质形成细胞的免疫荧光检测

接种：以3*10⁴个/孔的细胞接种密度接种至含有盖玻片的24孔板中，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜。

配液：将实例6中的组合物，配置成浓度500ppm(根据MTT检测试验所得)的待测液。

给药：待24孔板中细胞铺板率达到30％时，给药待测液。

收样：孵育培养结束后，弃掉培养液PBS清洗3次，4％多聚甲醛室温固定30min，4℃冰箱保存。

免疫荧光检测：对细胞进行通透、封闭等操作后，AQP3抗体按照1:500的工作浓度进行孵育，进行免疫荧光染色。

拍照：激光共聚焦显微镜40倍镜下拍照。

实验结果：

试验采用荧光显微镜拍照，其中绿色荧光部分显示的是AQP3蛋白表达情况，试验结果见图1。结果表明(图1)，实施例6的护肤组合物可以有效的提高角质形成细胞水通道蛋白AQP3的表达。

透明质酸酶抑制试验

透明质酸酶是炎症反应的参与者，与炎症、过敏有强相关性，抑制透明质酸酶活性在一定程度上可反映物质的抗炎活性。采用抑制透明质酸酶试验，考察样品对透明质酸酶活性的抑制作用。

透明质酸酶(HAase)能水解透明质酸中的β-N-乙酰葡糖胺与D-葡糖醛酸之间的1,4-糖苷键，而得到β-N-乙酰葡糖胺，后者在碱性条件下可以与乙酰丙酮缩合生成生色原，生色原与对二甲氨基苯甲醛在浓盐酸乙醇中生色。通过测试加入待测物前后的吸光值变化来计算抑制率。

具体方法：

按表2向试管中加入CaCl₂、透明质酸酶、样品、透明质酸钠、NaOH、硼酸钠、p-DMAB充分震荡，于30℃放置30min，转移至96孔板中，在582nm处测吸光值。

表2待测液组成

添加试剂	A组	B组	C组	D组
					0.1mLCaCl2	+	+	+	+
0.5mL透明质酸酶	+	-	+	-
					0.5mL样品	-	-	+	+
0.5mL甘草酸二钾	-	-	+	+
					0.5mL透明质酸钠	+	+	+	+
0.1mLNaOH	+	+	+	+
					0.5mL硼酸钠	+	+	+	+
1.0mLp-DMAB	+	+	+	+

备注：“+”为此项添加，“-”为此项不添加，但用醋缓代替

利用所测吸光度值，计算出抑制率，抗敏活性计算公式为：

式中：A——A组对照溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)

B——B组对照空白溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)

C——C组试样溶液OD值

D——D组试样空白溶液OD值(用醋酸缓冲溶液代替酶液)

试验考察了实施例6的护肤组合物(用醋酸缓冲液稀释成质量浓度分别为0.5％、1.0％的溶液)对透明质酸酶活性的影响，结果见图2。试验中抑制率表示样品对透明质酸酶的抑制能力，抑制率越高表示其抗敏抗炎效果越好。由图2可知，本发明的护肤组合物具有显著的抑制透明质酸酶的能力，说明其具有较好的抗敏抗炎活性，作用于肌肤一定程度上可舒缓肌肤炎症损伤。

人体试用评价实验

按照表3的配方，将实施例1-37制备的护肤组合物分别配制成待测样品(编号依次为1-37号待测样品)。

表3待测样品配方及制备工艺

测试前经专业人员培训过的年龄在30～50周岁的健康女性受试者185名，分成37组，每组5人。所有受试者均无皮肤或系统性疾患史，且受试期间不涂抹任何与实验无关的药物或者化妆品。测试方法为，早晚洁面后，每组分别取适量1-37号待测样品施用在人体皮肤表面。

(1)采用VisioScan VC98图像分析仪，在第0、1、2、4周分别测试受试者涂抹护肤品的部位皮肤的鳞屑指数，计算得到第1、2、4周时的皮肤鳞屑指数变化率，结果见表4。

(2)采用皮肤色差测试探头Colorimeter CL400及多功能皮肤测试系统MultiProbe Adapter MPA9分别在第0、1、2、4周测试受试者涂抹护肤品的部位的亮白度ITA值，结果见表4。

表4

8h水分散失试验(评价炎症肌肤损伤修复)

试验原理：

经表皮失水率(Transepidermal Water Loss，TEWL)，又称透皮失水率，是指水分从真皮层经表皮层，在单位时间内流失水分的速度。TEWL是评估皮肤屏障功能好坏的一个重要标志，在国际上已得到广泛认可。皮肤屏障功能一旦受损，皮肤中的水分将从松散的细胞缝隙中逸出，皮肤就会出现干燥、脱屑、过敏、对外界刺激不耐受等一系列问题。皮肤屏障功能越好，TEWL值越低，反之亦然。在化妆品研制过程中，可通过测试从皮肤表面水分流失率来评价皮肤的屏障功能。

实验仪器：皮肤水分散失测试仪AquaFlux(AF200，BIOX，英国)。

测试方法：

(1)选用15名志愿者，分为测试组(涂抹表4中编号6的待测样品)、对照组(涂抹配方基质，该配方基质除了不加入实施例6的护肤组合物，水的添加量为96.88％外，其余与待测样品相同)、空白对照组(不涂抹任何样品)，每组5人；

(2)通过建立刺激损伤模型(将0.025mL 1％SDS置于斑贴器内，贴敷24h后除去)，观测致损程度；

(3)用SDS造成刺激损伤模型后，每天早晚两次在皮损区域涂抹测试样品，连续使用5天；通过对使用前、使用1天、2天、3天、5天、7天后皮肤的皮肤损伤部位经皮水分散失量，评价测试样品对皮肤屏障损伤的修复效果。说明：使用样品后，TEWL值降低越多，说明样品对肌肤屏障的修复效果越好。

水分散失变化率计算如下，该数值降低越多，说明屏障修复效果越显著。TEWL变化率的计算公式如下：

式中：T₀为未涂抹样品时皮肤基底数据采集值；T_n为样品组各时间点数据采集值。

试验结果如图3所示，试验结果采用t检验，*表示样品组与配方基质对照组有显著性差异(P＜0.05)，n＝15；图中显示的经皮水分散失变化率(％)＝(使用后水分散失含量-使用前水分散失量)/使用前水分散失量*100％。

连续7天使用含5％的实施例6的护肤组合物的待测样品后，经皮水分散失量降低42％，高于基质对照的变化率(28％)和空白对照的变化率(33％)，表明5％护肤组合物可以有效修复皮肤屏障，其对肌肤屏障的修复率与空白对照(肌肤自然修复)相比，具有显著性提高((*)P<0.05)。

应当注意的是，以上所述的实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明的任何限制。通过参照典型实施例对本发明进行了描述，但应当理解为其中所用的词语为描述性和解释性词汇，而不是限定性词汇。可以按规定在本发明权利要求的范围内对本发明作出修改，以及在不背离本发明的范围和精神内对本发明进行修订。尽管其中描述的本发明涉及特定的方法、材料和实施例，但是并不意味着本发明限于其中公开的特定例，相反，本发明可扩展至其他所有具有相同功能的方法和应用。