阅读说明：本技术 一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水及其制备方法和应用 (Composite biological ink based on methacrylated hydrogel/nanoclay/acellular matrix and preparation method and application thereof ) 是由 张秀莉 庄甜甜 罗勇 于 2020-04-03 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水,所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液、光交联甲基丙烯酸化水凝胶以及纳米黏土。本发明还公开了所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法及应用。本发明的基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水,表征效果好,可打印性强,生物相容性好。(The invention discloses a composite biological ink based on methacrylated hydrogel/nanoclay/acellular matrix, which comprises the components of an acellular matrix solution, photo-crosslinked methacrylated hydrogel and nanoclay. The invention also discloses a preparation method and application of the methacrylic acid hydrogel/nano clay/acellular matrix-based composite biological ink. The composite biological ink based on the methacrylated hydrogel/nanoclay/acellular matrix has the advantages of good representation effect, strong printability and good biocompatibility.)

一种基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合 生物墨水及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物墨水技术领域，具体涉及一种用于体外细胞打印的高活性复合生物墨水及其制备方法与应用。

背景技术

3D生物打印是一种能在数字三维模式驱动下按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官的技术。近年来，3D打印技术和微流控技术的逐渐成熟，各式新型的器官组织芯片不断涌现，在筛选药物、推动个性化和精准化医疗快速发展方面具有重大的作用。既可以降低药物筛选的成本，也可以减少测试时间，节约人力和财力资源；更重要的是可以提高被测试对象的一致性，使实验结果更具有说服力。利用“生物墨水”作为打印材料，模拟天然的3D ECM，结合细胞以构建含有活性的组织或器官。虽然目前已研制出来的生物墨水非常类似于ECM的活性，但由于体外3D培养系统仍然缺乏促进细胞生长和维持细胞功能的合适天然生长因子，导致3D生物打印构建的组织活性相对原型具有较大的差距。因此使用天然生长因子对3D ECM进行模拟是当前3D生物打印实现高仿生性的当务之急。

具有复杂天然组成和仿生结构的脱细胞基质是生物墨水的首选。脱细胞基质是指将组织经过脱细胞工艺处理后，去除能够引起免疫排斥的抗原部分。具有良好的机械力学性能，良好的生物相容性，在体内起着支撑、连接细胞的作用，同时其三维空间的结构及生长因子有利于细胞的黏附和生长。

国内外对于脱细胞生物墨水的研究逐渐深入，2018年在Lab On A Chip上的一篇文章指出，基于肝脏脱细胞基质(DLM)的基本成分和明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)整合之后制成肿瘤芯片，形成3D微流控结构动态培养系统，实验结果表明肿瘤性能得到了改善，这与脱细胞基质提供了生长因子以及相关生物活性成分，更好的再现3D肝脏的天然肿瘤微环境有关。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种新型的用于细胞打印的高活性复合生物墨水，该生物墨水以脱细胞基质为生物活性成分，并加入纳米黏土，提高了可打印性能。

为了解决上述技术问题，本发明提供了一种用于细胞打印的基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水，所述复合生物墨水的组分包括脱细胞基质溶液(DECM)、光交联甲基丙烯酸化水凝胶(GelMA)以及纳米黏土(Nanoclay)。

进一步地，所述脱细胞基质溶液为脱细胞基质的胃蛋白酶溶液，其浓度优选为1-20mg/ml，更优选为1-10mg/ml。

本发明中，脱细胞基质可由动物或人的肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胰腺、心脏、肺、胃、脾、胆、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织经脱细胞工艺处理得到，具有良好的机械力学性能以及生物相容性，其三维的空间结构以及生长因子也有利于细胞的粘附和生长。甲基丙烯酸酐化水凝胶是由甲基丙烯酸酐(MA)与明胶(Gelatin)制备获得，是一种光敏性的生物水凝胶材料，具有优异的生物相容性，且可由紫外光或可见光激发固化反应，形成适于细胞生长与分化且有一定强度的三维结构。两种材料的结合可显著提高生物墨水的生物活性，但也降低了生物墨水的可打印性。

进一步地，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶的浓度为1％-50％。

纳米黏土具有分层结构，通过在体系中加入纳米黏土辅助打印，使得纳米黏土中的硅酸盐纳米片分散到水凝胶中，增强了生物墨水的机械强度。另外，纳米黏土具有凝胶引导的性质，其加入显著地提高了生物墨水的流变力学性能(储能模量)，使生物墨水的凝胶状态更好，保证了打印结构的形状保真度，并避免打印中不同层的生物墨水纤维的融合问题，有效提高了生物墨水的打印性能。进一步地，所述纳米粘土为以下种类中的任意一种或多种：膨润土、蒙脱石、高岭石、锂蒙脱石和埃洛石。更进一步地，所述纳米黏土为LaponiteXLG系列的蒙脱土纳米黏土。

进一步地，所述光交联甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质溶液的体积比为5:1～1:5，优选为1:1。

进一步地，所述纳米黏土的添加量为脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶总质量的1％～5％，优选为1％。

进一步地，所述复合生物墨水用于打印的细胞包括肝脏、肾脏、神经、脑、肠、胰腺、心脏、肺、胃、脾、胆、血管、肌肉、淋巴、耳朵、鼻子、眼等器官组织的细胞。

本发明另一方面提供了所述的基于甲基丙烯酸化水凝胶/纳米粘土/脱细胞基质的复合生物墨水的制备方法，包括：

S1、将脱细胞基质冻干、研磨，加入胃蛋白酶溶液溶解，制成脱细胞基质溶液；

S2、将得到的脱细胞基质溶液与光交联甲基丙烯酸化水凝胶混合，再加入纳米黏土，混合均匀，即得到所述复合生物墨水。

进一步地，步骤S1中，所述脱细胞基质是由解冻后的组织连接蠕动泵进行脱细胞灌注而得到的，所述脱细胞灌注具体依次包括：

(1)0.01mol/L PBS灌注1h；

(2)1％Triton X-100灌注1h；

(3)PBS冲洗15min后，0.1％SDS灌注30min；

(4)PBS冲洗15min后，80U/ml DNase、5U/ml RNase灌注30min；

(5)2％青霉素-链霉素、2.5μg/ml两性霉素B的PBS灌注30min。

进一步地，蠕动泵的灌注速率为10ml/min。

进一步地，制备脱细胞基质后，还需要对其进行表征，所述表征包括：扫描电镜SEM，HE染色，残留DNA浓度验证脱细胞过程。

进一步地，步骤S1中，所述胃蛋白酶溶液是由胃蛋白酶溶解于盐酸中得到的，浓度为0.5-10mg/mL，优选为1mg/mL。

进一步地，步骤S2中，还包括对制备的生物墨水进行可打印性和生物相容性的验证的步骤。

本发明还提供了所述的复合生物墨水在构建组织工程支架中的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明的制备方法简单易操大鼠，小鼠或新生鼠的肝脏、肾脏、胰腺、心脏、肺、胃、脾、血管、肌肉等其他组织作为脱细胞基质的来源。

(2)由于本发明在制备生物墨水的过程当中，加入了脱细胞基质和纳米黏土，所以制备出来的生物墨水表征效果好，可打印性强，生物相容性好。

(3)本发明制备的新型的用于细胞打印的高活性复合生物墨水，用于医疗或制药行业，将在一定程度上降低药物筛选成本，减少筛选测试时间，节约人力和财力资源，对于未来医疗事业的发展具有奠基作用。

附图说明

图1是1％的纳米粘土(Nanoclay)加入甲基丙烯酸化水凝胶与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成的生物墨水在喷头处的挤出形态及各支架的打印效果图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

实施例1

一、制备基于肝脏脱细胞基质的复合生物墨水

(1)肝脏准备：将留置针插入天然大鼠的肝门静脉，取出肝脏，-80℃冷冻12h；

(2)肝脏脱细胞基质的制备：肝脏常温解冻，连接蠕动泵进行灌注(灌注速率为10ml/min)①0.01mol/L PBS灌注1h；②1％Triton X-100灌注1h；PBS冲洗15min；③0.1％SDS灌注30min；PBS冲洗15min；④80U/ml DNase,5U/ml Rnase灌注30min；⑤含有2％青霉素-链霉素和2.5μg/ml两性霉素B的PBS灌注30min；当脱细胞基质出现完全半透明形态时，可将脱细胞基质进行冷冻干燥处理；

(3)肝脏脱细胞基质的表征：肝脏脱细胞基质经历冷冻干燥后，进行SEM检测，HE染色以及DNA含量等一系列表征，证明脱细胞较完全以后，可以进行下一步；

(4)①肝脏脱细胞基质溶液的制备：将肝脏脱细胞基质冻干12h，取冻干后的脱细胞基质进行剪碎、研磨，使其易于溶解，研磨至合适颗粒大小，溶于浓度为1mg/mL的胃蛋白酶中制成溶液；②肝脏脱细胞基质溶液的表征：检测溶液中胶原蛋白的浓度，以及溶液中GAG、生长因子HGF和bFGF的含量，确保检测的含量尽量与未脱细胞处理的天然肝脏对比，没有极为显著的变化，保证制成的生物墨水具有可提供肝原代细胞生长的生长因子；

(5)肝脏脱细胞基质生物墨水的制备：将肝脏脱细胞基质与明胶甲基丙烯酰胺(GelMA)1:1混合，并加入1％的纳米黏土，混合均匀，制成生物墨水。

二、生物墨水打印性能的检测

首先，利用AUTODESK 3DS MAX 2010软件设计一个10mm×10mm×1mm的长方体模型，用Repetier-Host切片软件对模型进行切片处理，将切片处理后的模型以G-code文件格式导入3D生物打印机中。按照表1的配比配制生物墨水，然后将配制好的生物墨水放置在3D生物打印机的打印喷头中，其中打印喷头直径为200μm，打印速度为7mm/s,底板及喷头温度设置为25℃，在材料逐层打印堆积成型后，将打印的结构暴露在紫外线下固化20s，产生稳定的支架。

表1不同配比的生物墨水

GelMA：DECM	GelMA(μl)	DECM(μl)	Nanoclay(g)
				1:0	1000	0	0.01
1:1	500	500	0.01
				1:2	333	667	0.01
1:3	250	750	0.01
				1:4	200	800	0.01

附图1示出了1％的nanoclay加入GelMA与脱细胞基质(DECM)不同的体积比中形成的生物墨水在喷头处的挤出形态及各支架的打印效果如下图所示。

从图1中可以看出，当GelMA：DECM的比例为1：0～1：3时，得到的生物墨水都显示出了良好的打印性能。当GelMA：DECM的比例上升至1:4时，生物墨水的打印性能出现明显的下降。

现有技术中，未加nanoclay时，生物墨水中GelMA：DECM最大比例为1：1，即DECM的上限为50％。本实施例中，通过在生物墨水中引入了1％的nanoclay，明显的提高生物墨水的打印性能，使得DECM的可打印含量增加至75％，有利于提高打印支架的生物活性。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。