拮抗肽、其共聚物及纳米组装体、及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 拮抗肽、其共聚物及纳米组装体、及其制备方法和应用 (Antagonistic peptide, copolymer and nano assembly thereof, and preparation method and application thereof ) 是由 栾玉霞 姜悦 王宁宁 于 2020-03-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种拮抗肽、其共聚物及纳米组装体、及其制备方法和应用,该拮抗肽为PD-L1拮抗肽,其命名为M-APP,结构如下所示：<Image he="132" wi="700" file="DDA0002412840300000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>本发明以M-APP为原料制备得到结构清晰的共聚物IR780-M-APP,其可自组装形成纳米组装体,不仅解决了免疫治疗中免疫原性差的问题,提高了免疫拮抗肽的利用率,还可以通过协同光动力治疗,解决IR780水溶性差的问题,提高了光疗治疗的效果,增强了免疫治疗的疗效。(The invention provides an antagonistic peptide, a copolymer and a nano assembly thereof, and a preparation method and application thereof, wherein the antagonistic peptide is PD-L1 antagonistic peptide which is named as M-APP and has the following structure: the copolymer IR780-M-APP with a clear structure is prepared by taking M-APP as a raw material, and can be self-assembled to form a nano-assembly, so that the problem of poor immunogenicity in immunotherapy is solved, the utilization rate of immune antagonistic peptide is improved, the problem of poor IR780 water solubility can be solved by synergistic photodynamic therapy, the effect of phototherapy is improved, and the curative effect of immunotherapy is enhanced.)
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及拮抗肽、其共聚物及纳米组装体、及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
近年来研究表明，黑素瘤的发病率在全球范围内持续上升。近年来，我国发病率提高了5倍。黑色素瘤是一种侵袭性恶性肿瘤，由皮肤上的黑色素细胞引起，在皮肤外的部位很少发生。黑色素瘤的转移是治疗中的越来越多样化。然而，随着靶向治疗和免疫检查点抑制剂的引入，转移性黑色素瘤的治疗变得越来越复杂。临床上，黑色素瘤的治疗手段主要是切除手术、放疗和化疗等。由于切除方法很难切除所有的癌变细胞，所以预后复发的可能性较大。放射疗法存在敏感性的问题，并且现在很多化学治疗药物存在多药耐药性和毒副作用的问题。因此，如何进一步提高肿瘤的治疗效果，一直以来是备受关注的事情。据报道，癌症免疫联合治疗的治疗方式可以起到有效的治疗效果，尤其，合成多肽作为癌症候选药物有几个优点，较高的稳定性、较低的免疫原性、较好的器官或肿瘤穿透性。据报道PD-L1在许多类型的肿瘤细胞上都被高度上调，如黑色素瘤、卵巢癌和非小细胞肺癌，但是发明人发现，单独依靠免疫系统是无法完全杀伤恶性侵袭性肿瘤的，而且免疫治疗过程中没有足够的抗原也无法发挥理想的治疗效果。
IR780碘化物(IR780)是一种典型的近红外染料，光热与光动兼具的优良特性使它具备良好的临床应用前景，但是发明人发现IR780水溶性差，体内递送困难，是限制其广泛使用的因素，并且IR780作为光敏剂产生的单线态氧作用时间短、作用距离有限，很难达到理想的治疗效果。
发明内容
肿瘤微环境(Tumor Microenvironment，TME)内是一个复杂的系统，包括多种细胞类型、细胞分泌因子、周围基质，多种酶及特殊的物理因素如低pH、乏氧及间质液压力等，在肿瘤治疗方面发挥着重要的作用。发明人在研究中发现，将光疗与免疫检查点拮抗相结合能够显著提升肿瘤治疗效果。其中，光动力治疗通过激光照射直接杀死肿瘤细胞的同时释放肿瘤相关抗原，分泌产生的损伤相关分子模式，被一些受体识别，加速免疫效应因子的合成与释放，发挥免疫作用诱导机体免疫应答杀伤肿瘤。
为了解决现有技术中存在的不足，本发明采用光疗与免疫检查点拮抗相结合的方法提供了一种免疫检查点拮抗肽M-APP，以及该拮抗肽M-APP 和光疗药物(或光敏剂)的共聚物及其纳米组装体和制备方法，并提供了其制备方法和应用。所述拮抗肽M-APP和光疗药物(或光敏剂)的共聚物及其纳米组装体是肿瘤微环境响应的，能够应用于抗肿瘤的免疫治疗及光动力治疗中。
本发明的技术方案不仅解决了光疗药物比如IR780疏水性强在体内难以递送、在肿瘤部位难以有效积累、以及其产生的单线态氧作用时间短、作用距离有限、难以实现理想治疗效果的缺陷增强了光疗效果，而且通过化合物的特殊设计使得免疫检查点拮抗肽在到达TME后经断裂暴露出来与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，从而抑制肿瘤免疫逃逸过程，提高拮抗肽的体内免疫治疗的利用率，增强了拮抗肽免疫治疗的效果；显著提升了抗肿瘤效果。
具体地，本发明的技术方案如下所述：
在本发明的第一方面，本发明提供了一种免疫检查点拮抗肽，其命名为M-APP，结构如下所示：
M-APP的结构特点：M-APP由巯基丙酸、四个甲硫氨酸、MMP-2响应部分PLGLVG(-Pro-Leu-Gly-Leu-Val-Gly-)以及抗PD-L1肽DPPA-1 部分(-NYSKPTDRQYHF，分子简式为：-Asn–Tyr–Ser–Lys–Pro–Thr–Asp –Arg–Gln–Tyr–His–Phe-NH2)组成，分别发挥连接IR780、调节组装体结构、进行TEM的中MMP2酶响应断裂以及发挥免疫治疗作用。这样的设计有助于调控纳米组装体的形貌。M-APP在本发明中也称为PD-L1拮抗肽。
在本发明的第一方面，本发明提供了一种制备上述第一方面中所述的免疫检查点拮抗肽M-APP的方法，其包括：通过反应将巯基丙酸、四个甲硫氨酸、MMP-2响应部分PLGLVG(-Pro-Leu-Gly-Leu-Val-Gly-)以及抗PD-L1肽DPPA-1(-NYSKPTDRQYHF)连接起来，即得。本领域技术人员可根据本发明设计的M-APP的结构特点制备得到本发明的M-APP。
具体地，本发明提供一种较为优选的制备方法，具备包括：首先进行树脂溶胀，将10克Rink amide AM Resin(树脂取代度为0.35mmol/g)用 200ml二氯甲烷浸泡15分钟，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷。其次，去除氨基保护，加入200mL六氢吡啶/DMF溶液，使用氮气鼓动，室温反应2次，时间为5分钟和15分钟，反应结束后用DMF洗涤树脂。取少量树脂加入验色剂在100℃下共热3分钟，溶液及树脂颜色应为蓝色或者红色，即可认定反应完成。即可判断氨基Fmoc保护已经脱除。然后，进行缩合反应，加入2倍摩尔数的Fmoc-D-Phe-OH和HBTU，用200mL DMF溶解，加入 2倍摩尔数的DIEA，氮气鼓动，室温反应1小时，反应结束后用DMF洗涤树脂。
接下来，重复步骤2-3，依次连接各个保护氨基酸完成序列的合成，将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。将多肽从树脂上分离，加入150mL TFA裂解液，在恒温摇床中反应1-3h。温度15-40℃左右，转速120转/ 分钟。然后，析出粗品，滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，用离心机 (2500rpm)离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得粗品多肽。进一步纯化，将粗品溶解，使用0.45μm膜过滤后上样，用溶剂乙腈溶液和溶剂(0.1％三氟乙酸、99.9％纯水溶液)进行梯度洗脱，收集主峰溶液，主峰溶液合并即得精品肽液体，经HPLC检测，计算含量。不合格进行二次纯化。然后，用旋转蒸发仪浓缩，经减压浓缩去除残留有机溶剂和部分水份。最后，冻干，上述浓缩物放进冷冻干燥机进行冷冻干燥得冻干制品M-APP。
上述制备过程中所涉及的原料DPPA-1，其分子简式为： H-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe-NH2。DPPA-1可根据文献Chang,H.-N.,Liu,B.-Y.,Qi,Y.-K.,Zhou,Y.,Chen,Y.-P.,Pan,K. -M.,Li,W.-W.,Zhou,X.-M.,Ma,W.-W.,Fu,C.-Y.,Qi,Y.-M.,Liu,L. and Gao,Y.-F.(2015),Blocking of the PD-1/PD-L1 Interaction by a D-Peptide Antagonist for Cancer Immunotherapy.Angew.Chem.Int.Ed.,54: 11760-11764.doi:10.1002/anie.201506225合成，该文献以其原文全文合并引用到本发明中。
在本发明的第三方面，本发明提供了一种光敏剂-PD-L1拮抗肽共聚物，其命名为IR780-M-APP，其结构如下所示：
在本发明的第四方面，本发明提供了一种制备上述第三方面中所述共聚物IR780-M-APP的方法，其包括由IR780与M-APP进行氯代反应制得。
在本发明的一些实施方式中，所述方法包括IR780与M-APP混合后加入三乙胺，在惰性气体氛围下反应制得。
在本发明的一些实施方式中，所述IR780与M-APP分别溶解于溶剂后混合反应；IR780的溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、二氯甲烷 (CH2Cl2)、乙醇(EtOH)中的一种或多种；M-APP的溶剂选自N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、水(H2O)中的一种或多种。
在本发明的一些实施方式中，当IR780与M-APP的溶剂相同，均为 N,N-二甲基甲酰胺，本发明制备方法中所述的反应进行的更充分。
在本发明的实施方式中，要获得更优的产率，所述IR780、M-APP与三乙胺的摩尔比为1～10：0.5～2:15～25，尤其当该比例为5:1:20时，反应进行的更好，产率更高。
本发明所述反应在室温下即可进行，反应时间为10-48h，在该范围内时间越长，反应进行的越充分。
为了获得更纯净的IR780-M-APP，该实施方式的一种或多种实施例中，还可以进行纯化精制的过程，比如将反应后的物料去除溶剂后获得粗产品，采用甲醇将粗产品溶解后减压旋转蒸发提纯，提纯过程温度不宜过高。
在本发明的第五方面，本发明提供了一种纳米组装体，其由上述第三方面中所述的光敏剂-PD-L1拮抗肽共聚物IR780-M-APP自组装形成，记为IR780-M-APP NPs。
在本发明的第六方面，本发明提供了一种组合物或药物制剂，其含有上述第一方面中所述的免疫检查点拮抗肽M-APP或者含有上述第三方面中所述的光敏剂-PD-L1拮抗肽共聚物IR780-M-APP或者含有上述第五方面中所述的纳米组装体IR780-M-APP NPs；
或者，所述组合物或药物制剂中还可以进一步地含有至少一种药学上可接受的辅料。
所述药物制剂可以为液体制剂或固体制剂，比如注射剂或粉针剂，本领域技术人员可以根据需要选择合适的辅料或溶剂。
在本发明的第七方面，本发明提供了一种纳米制剂，其由上述第三方面中所述的IR780-M-APP自组装(self-assembly)形成，所述自组装即 IR780-M-APP自发形成有序结构或纳米聚集体(或也称纳米组装体)；或者，所述纳米制剂含有上述第五方面所述的纳米组装体IR780-M-APP NPs。
在本发明的一些实施方式中，所述纳米制剂为静脉注射剂。
在本发明的第八方面，本发明提供了一种制备纳米制剂的方法，其包括将上述第三方面中所述的IR780-M-APP化合物溶于有机溶剂中，超声下将水滴入上述IR780-M-APP的有机溶剂中，IR780-M-APP化合物自组装形成纳米聚集体，除去有机溶剂即得。
在本发明的一些实施方式中，所述有机溶剂选自甲醇、乙醇、二甲亚砜中的一种或多种，由于甲醇沸点相对较低，有利于减压旋蒸除去，故优选为甲醇。
在本发明的一些实施方式中，IR780-M-APP与有机溶剂的质量体积比为1:0.1-0.5，尤其当该比例为1:0.25，均匀性效果更好。
在本发明的第九方面，本发明提供了上述第一方面中所述的免疫检查点拮抗肽M-APP在制备免疫治疗药物中的应用。
在本发明的一些实施方式中，所述免疫治疗药物为PD-L1拮抗药物。
多种肿瘤细胞比如黑色素瘤细胞、卵巢癌细胞、肺癌细胞等中的PD-L1 均被高度上调，TME中的金属基质蛋白酶2(MMP2)高表达，本发明的光敏剂-PD-L1拮抗肽组装体(IR780-M-APP NPs)在MMP2作用下，其结构中的敏感键会断裂释放出LAG-APP，与肿瘤细胞表面的PD-L1结合从而发挥免疫治疗作用。
在本发明的第十方面，本发明提供了上述第一方面中所述的免疫检查点拮抗肽M-APP或上述第三方面中所述的光敏剂-PD-L1拮抗肽共聚物 IR780-M-APP或者上述第五方面中所述的纳米组装体IR780-M-APP NPs 或者上述第六方面中所述的组合物或药物制剂在制备光动力治疗药物中的应用，所述光动力治疗药物为光动力抗肿瘤药物。
本发明的IR780-M-APP NPs具有EPR效应，能够蓄积于肿瘤部位， IR780-M-APPNPs到达肿瘤部位后，在MMP2酶的作用下与DPPA-1连接的MMP2响应氨基酸序列PLGLVG处断裂形成LAG-APP，暴露出的PD-L1 拮抗肽活性部分APP与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，进而抑制肿瘤自身的免疫过程，提高拮抗肽在体内免疫治疗的利用率，增强拮抗肽的免疫治疗效果；同时，断裂后剩余部分经内吞作用进入肿瘤细胞，在激光作用下发挥光疗作用，并且显著提升了光疗效果，显著改善了单独使用IR780水溶性差、体内递送困难、单线态氧作用时间短、作用距离有限治疗效果不佳等缺陷，显著提升了光疗的效果。在本发明的实施方式中，本发明以黑色素瘤细胞为研究对象进行了体外细胞抑制实验，以IR780、IR780-M-APPNPs与IR780-M-APP NPs+MMP2三组在施与激光的情况下进行比较，与 IR780相比，IR780-M-APP NPs组与IR780-M-APP NPs+MMP2组的细胞存活率均有降低，并且IR780-M-APP NPs+MMP2组显著降低，与IR780 相比，IR780-M-APP NPs在MMP2酶的作用下使PD-L1拮抗肽活性部分 APP暴露出来，发挥免疫治疗的作用，而且断裂后带有修饰的IR780部分经内吞作用进入细胞内，克服了IR780疏水性强、难以递送至有效部位的缺陷，协同IR780部分的光动力治疗，实现了对恶性侵袭性黑色素瘤细胞的优异的抑制作用。同时，上述三组药物在无光下进行了暗毒性实验，实验表明本发明的IR780-M-APP NPs的暗毒性小于20％，表明该药物毒性较小，尤其，当药物浓度低于5.0μM时，对待测细胞的暗毒性小于10％，在药物浓度不高于2μM时，对待侧细胞的暗毒性更低。
在本发明的第十方面，发明提供了上述第一方面中所述的免疫检查点拮抗肽M-APP或上述第三方面中所述的光敏剂-PD-L1拮抗肽共聚物 IR780-M-APP或者上述第五方面中所述的纳米组装体IR780-M-APP NPs 或者上述第六方面中所述的组合物或药物制剂在制备免疫治疗药物或抗肿瘤药物中的应用，所述免疫治疗药物为免疫治疗抗肿瘤药物。
在本发明的实施方式中，本发明对IR780-M-APP NPs进行了体外黑色素瘤细胞抑制实验和黑色素瘤实体瘤抑制实验，结果表明，R780-M-APP NPs组小鼠瘤体积生长较IR780组缓慢，IR780-M-APP NPs制剂抑瘤效果明显优于单独给药的IR780组和M-APP组，抑瘤率接近86％。表明该纳米制剂的免疫联合光疗增强了抗黑色素瘤的效果。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次合成新型光动分子IR780与PD-L1拮抗肽自组装纳米粒的纳米制剂，该制剂不仅解决了IR780强疏水性，体内药物递送困难的难点，增加了在肿瘤部位的蓄积，还可以进一步增加了免疫治疗的治疗效果，增强光疗疗效。
(2)本发明制得的纳米制剂简单绿色，符合绿色化学方面的节约资源。
(3)本发明制得的纳米制剂形态均匀，粒径在150nm左右，适合静脉注射，可以通过EPR效应蓄积于肿瘤部位。
(4)本发明通过敏感键PLGLVG使纳米粒到达TME后，发生断裂，使M-APP免疫检查点拮抗肽和肿瘤细胞表面的PD-L1结合，抑制肿瘤免疫逃逸的过程，提高了M-APP拮抗肽的体内免疫治疗的利用率，增强了 M-APP拮抗肽免疫治疗的效果。
(5)本发明通过体外细胞实验表明IR780-M-APP NPs制剂对黑色素瘤细胞显示较强的细胞毒性，表明该制剂效果明显。且该纳米制剂生物相容性好，暗毒性低；以及在抑制实体黑色素瘤的药效实验中对肿瘤的抑制率可达86％以上，具有较强的抑瘤效果。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：
图1为本发明实施例1中制备的M-APP的碳谱图(A)，以及实施例 2制备的IR780-M-APP的质谱(B)、氢谱图(C)。
图2为实施例3制备的IR780-M-APP NPs的TEM图。
图3为实施例4对B16-F10黑色素瘤细胞抑制实验中肿瘤细胞的存活率实验结果，其中，A图为不经激光照射时的结果，B图为经激光照射后的结果(L表示激光Laser的缩写)。
图4为实施例5的IR780-M-APP NPs制剂体内抗肿瘤实验的结果图，其中，A图为肿瘤体积-时间曲线图，B图为肿瘤重量及肿瘤抑制率结果图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1 M-APP的合成
(M-APP多肽的结构为：巯基丙酸-L-Met-PLGLVG-DPPA-1)
M-APP的制备过程如下：
首先进行树脂溶胀，将10克Rink amide AM Resin(树脂取代度为 0.35mmol/g)用200mL二氯甲烷浸泡15分钟，待树脂膨胀，抽去二氯甲烷。其次，去除氨基保护，加入200mL六氢吡啶/DMF溶液，使用氮气鼓动，室温反应2次，时间为5分钟和15分钟，反应结束后用DMF洗涤树脂。取少量树脂加入验色剂在100℃下共热3分钟，溶液及树脂颜色应为蓝色或者红色，即可认定反应完成。即可判断氨基Fmoc保护已经脱除。然后，进行缩合反应，加入2倍摩尔数的Fmoc-D-Phe-OH和HBTU，用 200mL DMF溶解，加入2倍摩尔数的DIEA，氮气鼓动，室温反应1小时，反应结束后用DMF洗涤树脂。
接下来，重复步骤2-3，依次连接各个保护氨基酸完成序列的合成,将树脂用二氯甲烷和乙醚浸泡后抽干。将多肽从树脂上分离，加入150Ml TFA 裂解液，在恒温摇床中反应1-3h。温度15-40℃左右，转速120转/分钟。然后，析出粗品，滤去树脂，向滤液中加入无水乙醚，用离心机(2500rpm) 离心后获得固体，加入无水乙醚洗涤，再离心，重复数次后烘干即可获得粗品多肽。进一步纯化，将粗品溶解，使用0.45μm膜过滤后上样，用溶剂乙腈溶液和溶剂(0.1％三氟乙酸、99.9％纯水溶液)进行梯度洗脱，收集主峰溶液，主峰溶液合并即得精品肽液体，经HPLC检测，计算含量。不合格进行二次纯化。然后，用旋转蒸发仪浓缩，经减压浓缩去除残留有机溶剂和部分水份。最后，冻干，上述浓缩物放进冷冻干燥机进行冷冻干燥得冻干制品，即为M-APP。M-APP的核磁碳谱图谱如图1A所示。
其中，上述制备过程中所涉及的原料DPPA-1，其分子简式为： H-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe-NH2，DPPA-1可根据文献Chang,H.-N.,Liu,B.-Y.,Qi,Y.-K.,Zhou,Y.,Chen,Y.-P.,Pan,K. -M.,Li,W.-W.,Zhou,X.-M.,Ma,W.-W.,Fu,C.-Y.,Qi,Y.-M.,Liu,L. and Gao,Y.-F.(2015),Blocking of the PD-1/PD-L1 Interactionby a D- Peptide Antagonist for Cancer Immunotherapy.Angew.Chem.Int.Ed.,54:11760-11764.doi:10.1002/anie.201506225合成，该文献以其原文全文合并引用到本发明中。
实施例2 IR780-M-APP分子合成
分析天平精密称取IR780，溶于无水N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶剂中，并置于圆底烧瓶中。称取M-APP(按实施例1所述方法制备)，溶于无水DMF 中，加入正在搅拌的IR780的DMF溶液中，并加入三乙胺(TEA)，氩气保护、室温条件下反应48小时，其中IR780、M-APP与TEA的物质的量之比为5：1： 20。反应结束后，二甲基亚砜透析除去无水DMF和未反应完的IR780，透析过夜，接着甲醇透析除去二甲基亚砜，减压蒸发除去溶液中的甲醇，真空干燥过夜，得到IR780-M-APP产物。IR780-M-APP的结构鉴定相关图谱如图1B 和图1C所示：
1、飞行质谱(ESI-TOF-MS)：
称取IR780-M-APP约1mg，甲醇溶解，采用飞行质谱仪测定其分子量，记录化合物的相对分子质量。结果如图1B所示，质谱结果可以证实，新合成的分子中出现了原料分子IR780-M-APP分子离子峰[M+2H]3181.62Da，证实IR780-M-APP的成功合成。
2、核磁图谱：
称取IR780-M-APP约5mg，氘代二甲亚砜(DMSO-d6)溶解并置于核磁管内，采用400MHz核磁共振氢谱仪测定其核磁共振氢谱，记录化合物的化学位移值(ppm)。结果如图1C所示，核磁结果可以证实IR780-M-APP 的成功合成。
实施例3 IR780-M-APP NPs的制备
精密称取IR780-M-APP2 mg，溶于500μL甲醇中，置于圆底烧瓶中；超声，2mL过膜水滴加入IR780-M-APP的甲醇溶液中，不断超声(超声条件： 100W，30min)形成纳米聚集体，减压蒸发，得到IR780-M-APP的纳米粒溶液，即纳米制剂IR780-M-APP NPs，TEM结果如图2所示，显示制备的 IR780-M-APP NPs的形态为纳米粒形态，证实制剂的成功制备。
实施例4 IR780-M-APP NPs制剂体外细胞毒性实验
1、细胞的培养
选取恶性侵袭性黑色素瘤B16-F10细胞作为实验研究对象。
取冻存细胞(B16-F10细胞)，用RPMI-1640培养基于37℃、5％CO2条件下培养，待细胞复苏生长至高密度时传代，按比例转移至培养瓶中继续培养并进行细胞计数。
2、细胞毒性实验
收集对数生长期的B16-F10细胞，用培养基将细胞稀释为约3.0×104个 /mL。将待测目标化合物分为3组，分别为IR780(CAS：207399-07-3)组、 IR780-M-APP NPs组和IR780-M-APP NPs+MMP2组，其中，IR780-M-APP NPs均取自实施例3，IR780-M-APP NPs+MMP2即在IR780-M-APP NPs中加入MMP2酶大约2nM；用培养基将待测目标化合物IR780，IR780-M-APPNPs、IR780-M-APP NPs+MMP2的溶液各稀释至5μM、4μM、2μM、1μM、 0.5μM。细胞以6×103个/孔(200μL)的浓度加入96孔板中，贴壁过夜后，弃去培养基，加入不同浓度的目标化合物溶液200μL，设3个复孔，设不加药物的孔为对照组，37℃分别培养4h。然后弃去上层含药培养基，换成新鲜培养基，IR780、IR780-M-APP NPs制剂、IR780-M-APP NPs+MMP2均用 808nm激光器照射(功率均为1W/cm2，照射时间为2min)。为考察研究IR780、 IR780-M-APP NPs制剂、IR780-M-APP NPs+MMP2溶液本身的暗毒性，同时设立暗毒性孔，除不经激光照射外，所有处理均一致。继续孵育20h，各孔加入10μL的MTT溶液(5mg/mL)，继续孵育4h，然后弃去孔内液体，每孔加120μL的DMSO溶解，用酶标检测仪测定570nm处吸光度，按以下公式计算抑制率：
其中，Ac表示未经药物处理的细胞的孔的吸光度，Asample表示各种样品处理过的细胞的孔的吸光度。
不同待测目标化合物组在不同浓度下对B16-F10黑色素瘤细胞存活率实验结果如图3所示，其中，A图为不经激光照射时的结果，B图为经激光照射后的结果(L表示激光Laser的缩写)。
由图3B可以看出，与IR780相比，IR780-M-APP NPs组与IR780-M-APP NPs+MMP2组的细胞存活率均有降低，并且IR780-M-APP NPs+MMP2组显著降低，与IR780相比，IR780-M-APP NPs不仅可以通过IR780的光动力治疗，而且可以在MMP2酶的作用下使PD-L1拮抗肽(APP)暴露出来，发挥免疫治疗的作用，对恶性侵袭性黑色素瘤细胞的抑制作用显著优于IR780。
由图3A可以看出，IR780组、IR780-M-APP NPs组及IR780-M-APP NPs +MMP2组对待测细胞的暗毒性小于20％，表明该药物毒性较小，尤其，当药物浓度低于5.0μM时，对待测细胞的暗毒性小于10％，在药物浓度不高于2μM 时，对待侧细胞的暗毒性更低。
通过细胞抑制率实验，可以得出结论：本发明实施例中制备的 IR780-M-APP NPs可以同时增强光疗和癌症免疫的疗效来最大化肿瘤的治疗效果。
实施例5 IR780-M-APP NPs制剂体内抗肿瘤实验
C57小鼠腋下荷瘤(每只100万个B16-F10细胞)，待瘤长至100mm3左右，随机分成6组，每组7只，分别静脉注射生理盐水(NS)、M-APP(取自实施例1)、IR780、IR780-M-APP NPs(取自实施例3)，在尾静脉注射给药后6h，对各组使用808nm激光器的激发光照射1W/cm2，5min。在治疗过程中记录小鼠肿瘤体积的变化。7次治疗过后，脱颈处死小鼠，取出肿瘤，称重并计算抑瘤率。
其中，瘤体积的计算公式如下：
L表示最大直径(mm)，而W表示最小直径(mm)。
其中，抑瘤率的计算公式如下：
其中，wc是生理盐水组小鼠的平均瘤重(g)，wsample是其他各组小鼠的平均瘤重(g)。
结果如图4所示。本发明实施例制备的IR780-M-APP NPs具有EPR效应，能够蓄积于肿瘤部位，IR780-M-APP NPs到达肿瘤部位后，在MMP2 酶的作用下与DPPA-1的连接的MMP2响应氨基酸序列PLGLVG处断裂形成LAG-APP，暴露出的PD-L1拮抗肽(APP)与肿瘤细胞表面的PD-L1结合，进而抑制肿瘤免疫逃逸过程，提高拮抗肽在体内免疫治疗的利用率，增强拮抗肽的免疫治疗效果；同时，断裂后剩余部分经内吞作用进入肿瘤细胞，在激光作用下发挥光疗作用，并且显著提升了光疗效果，显著改善了单独使用IR780水溶性差、体内递送困难、单线态氧作用时间短、作用距离有限而治疗效果不佳的缺陷。如图4所示，IR780-M-APP NPs组小鼠瘤体积生长较 IR780组缓慢，IR780-M-APP NPs制剂抑瘤效果明显优于IR780混合物，抑瘤率接近86％。表明该纳米制剂的免疫联合光疗增强了抗黑色素瘤的效果。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。