阅读说明：本技术 野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用 (Wild citrus resource AbTFIIA gamma gene and application thereof in citrus canker resistance ) 是由 徐强 汤小美 于 2020-04-10 设计创作，主要内容包括：本发明属于植物基因工程领域,其公开了一种野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用。本发明从野生资源酒饼簕(Atalantia buxifolia,柑橘的野生近缘种)中克隆到TFIIAγ基因,其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示,其编码的蛋白序列如SEQ ID NO：3所示,不能被溃疡病菌携带的效应子TALEs结合和利用,进一步明确了影响TAL效应子与TFIIAγ互作的重要氨基酸突变位点。本发明为柑橘溃疡病抗性品种培育提供了重要基因资源和靶位点。(The invention belongs to the field of plant genetic engineering, and discloses a wild citrus resource AbTFIIA gamma gene and application thereof in citrus canker resistance.A nucleotide sequence of the gene is shown as SEQ ID NO: 1, and a coded protein sequence of the gene is shown as SEQ ID NO: 3, so that an effector TA L Es which cannot be carried by canker pathogenic bacteria is combined and utilized, and important amino acid mutation sites influencing interaction of the TA L effector and the TFIIA gamma are further defined.)

野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及一种野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用。

背景技术

溃疡病是柑橘毁灭性病害之一，严重威胁着柑橘产业的发展。大多数柑橘栽培品种都易感染溃疡病，得病后会在其果实和叶片中形成坏死斑症状，加速果实和叶片的脱落，严重影响果实产量和商品价值。生产中溃疡病的防治主要是使用杀菌剂，这不仅会增加种植成本；而且柑橘作为多年生作物，化学药剂年复一年的使用也给产品安全、绿色生态带来风险。目前国内外还没有发现完全抗溃疡病的商业柑橘品种。因此，挖掘抗性基因并应用于抗性育种已成为柑橘产业迫切需求的研究。

柑橘溃疡病是由黄单胞杆菌引起的细菌性病害。黄单胞杆菌通过三型分泌系统将病菌转录激活效应子(TALEs)释放到植物细胞，并最终进入细胞核。TALEs会结合到感病基因的启动子上；激活感病基因表达。TALE结构中含有转录因子结合结构域(TFB)，TFB对黄单胞杆菌的致病性非常重要。黄单胞杆菌携带的TFB可以和寄主植物的基础转录因子TFIIAγ结合，稳定病菌TAL效应因子与感病基因启动子的结合，促进感病基因表达，从而使其感病。在真核生物中，TFIIA参与由RNA聚合酶II依赖的转录，它由小亚基TFIIAγ和大亚基TFIIAαβ组成。其中，小亚基TFIIAγ是一类在不同物种中都比较保守的基因，它可以激活植物特定基因的表达，调控植物的生长发育。

我国是柑橘起源地之一，具有丰富的野生资源，为挖掘抗性基因资源提供了材料基础。申请小组在收集野生资源的基础上，对其溃疡病的抗性进行评价，鉴定到了抗溃疡病的资源。应用基因组学工具在这些野生资源中寻找TFIIAγ的自然变异，挖掘并鉴定抗性基因，为柑橘溃疡病抗性品种的培育提供基因资源。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用。本发明发现酒饼簕(Atalantia buxifolia)对柑橘溃疡病具有较强的抗性，并且克隆了酒饼簕TFIIAγ基因(命名为AbTFIIAγ)，发现2种柑橘溃疡病病菌TAL效应因子上的转录因子结合motifs(TFBi和TFBii，简称为TFBs)不能与AbTFIIAγ基因结合。与此相反，TFBs可以和对照感病品种甜橙的TFIIAγ基因(命名为CsTFIIAγ)稳定互作。稳定干涉CsTFIIAγ基因的甜橙增强了其对溃疡病的抗性。将CsTFIIAγ的第81位亮氨酸(L)替换为AbTFIIAγ的第81位缬氨酸(V)后，TFBs与CsTFIIAγ^L81V的结合能力减弱，而将CsTFIIAγ的第87位亮氨酸(L)和90位苏氨酸(T)分别替换为AbTFIIAγ的第87位异亮氨酸(I)和90位天冬酰胺(N)，结合能力没有改变。相反，将AbTFIIAγ(81V，87I，90N)突变为CsTFIIAγ相应的(81L，87L，90T)氨基酸后，第81位氨基酸的突变导致病原菌TFBs可以和AbTFIIAγ^V81L结合；而第87位和90位的氨基酸突变没有这种变化。该研究结果揭示了AbTFIIAγ可作为柑橘抗溃疡病品种改良的候选基因，该基因编码的第81位氨基酸是病原菌-寄主植物能否互作的关键位点。

为实现上述目的，本发明涉及一种野生柑橘资源AbTFIIAγ基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

上述野生柑橘资源AbTFIIAγ基因编码区核苷酸序列，其序列如SEQ ID NO：2所示。

上述野生柑橘资源AbTFIIAγ基因编码的AbTFIIAγ氨基酸，其氨基酸序列如SEQID NO：3所示。

本发明还提供了上述野生柑橘资源AbTFIIAγ基因在柑橘抗溃疡病育种中的应用。

本发明的有益效果：

本发明公开了柑橘野生资源酒饼簕AbTFIIAγ基因在柑橘抗溃疡病品种改良中的应用。本发明发现稳定干涉与溃疡病病菌TFBs结构域互作的柑橘感病基因CsTFIIAγ增加了其对溃疡病的抗性，同时还发现TFBs结构域不能与AbTFIIAγ结合；并且，当感病等位基因CsTFIIAγ的第81位亮氨酸(L)替换为抗病等位基因AbTFIIAγ的第81位缬氨酸(V)，TFBs与CsTFIIAγ^L81V的结合能力减弱，明确了第81位氨基酸的变异对于病原菌和植物寄主的互作起关键作用。该变异信息可以应用于柑橘抗溃疡病品种改良。

附图说明

图1为不同野生柑橘资源对溃疡病抗性评价试验结果图；

图2为稳定干涉CsTFIIAγ基因的甜橙对溃疡病抗性评价试验结果图；

图3为柑橘溃疡病病菌携带的TFBs结构域与AbTFIIAγ之间的互作结果图；TFBs不能和AbTFIIAγ互作；

图4为柑橘溃疡病病菌携带的TFBs结构域与突变的CsTFIIAγ和AbTFIIAγ之间的互作结果图；TFBs与突变的CsTFIIAγ^L81V结合能力减弱，而可以与突变的AbTFIIAγ^V81L互作。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1不同野生柑橘资源对溃疡病抗性评价试验

采用离体叶片刺伤接种的方法对其抗性进行评价，为了更准确的对野生资源溃疡病抗性进行评价，本发明采用感病品种甜橙作为对照，接种叶片的每个刺伤点接种5μL菌液悬浮液，接种菌液浓度为OD₆₀₀＝0.3。叶片接种后用鲜膜覆盖保湿，放于28℃恒温光照培养箱，接种12天后观测发病症状。

如图1所示：对照甜橙和野生资源紫皮柚在接种溃疡病菌12天时病斑扩展较为明显，其次是宜昌橙和莽山野橘，而酒饼簕在接种溃疡病菌12天时，没有观察到明显的溃疡病症状；说明在这些野生资源中，只有酒饼簕对溃疡病的抗性最强。

实施例2筛选获得酒饼簕TFIIAγ基因

本发明利用生物信息方法结合PCR特异扩增的方法克隆基因。具体是在甜橙基因组数据库(http：//citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/orange/blast)中进行Blast分析，搜索与水稻OsTFIIAγ5氨基酸序列高度同源的酒饼簕(Atalantia)、莽山野橘(WildMandarin)、宜昌橙(Ichang Papeda)、葡萄柚(Grapefruit)、甜橙(Sweet Orange)TFIIAγ基因，其基因号分别为sb14580、MSYJ065590、Ci256580、Cg3g013750、Cs3g16970)，根据这5个预测的TFIIAγDNA和cDNA序列设计通用引物验证，基因扩增引物序列如下所示：

IIAγ正向引物(IIAγ-cF)：5’-AGCCCCAAAATCTCTCCGCCCAA-3’

IIAγ反向引物(IIAγ-cR)：5’-CCAGTTGAAAACAGTTGGCGGCT-3’

分别以酒饼簕、莽山野橘、宜昌橙、紫皮柚、甜橙叶片DNA和cDNA为模板，进行PCR产物扩增，扩增得到的酒饼簕DNA片段(SEQ ID NO：1)长度为2343bp。通过对TFIIAγ基因编码序列进行分析发现，该基因的编码区序列全长为321bp，如SEQ ID NO：2所示酒饼簕核苷酸序列。该基因编码106个氨基酸，对获得的5个柑橘资源TFIIAγ氨基酸序列比对发现，除酒饼簕AbTFIIAγ编码的蛋白序列(SEQ ID NO：3)外，莽山野橘、宜昌橙、紫皮柚TFIIAγ基因编码的蛋白序列均与已知感病甜橙CsTFIIAγ基因编码的蛋白序列相同。

实施例3稳定干涉TFIIAγ基因的甜橙增强了其对溃疡病的抗性

利用干涉技术，将扩增的长度为160bp的CsTFIIAγ基因序列通过gateway技术连接到pk7GWIWG2D(II)载体。扩增引物序列为：

RNAi-F正向引物：5’-ATGGCGACGTTTGAGCTGTA-3’

RNAi-R反向引物：5’-TTCACCTGAGTTTCTAGTGCTTC-3’

将构建好的载体转化到EHA105菌株中，通过转化甜橙上胚轴茎段获得转基因阳性苗。具体方法为：

在播种培养基上播种甜橙种子，播种好的甜橙种子放于25℃暗培养，待白化苗长至10cm左右时移至光照培养室进行转绿，约十天左右可以侵染茎段。先将已转化好的农杆菌划线培养36小时，然后将茎段切成长为1-2厘米左右的梯形，切好的茎段放于悬浮培养基，同时用加有乙酰丁香酮的悬浮培养基悬浮农杆菌，使其菌液浓度为OD₆₀₀＝0.6，将切好的茎段转移至含有农杆菌的悬浮培养基，于200rpm/min摇床培养20min。后将浸染好的茎段移至共培养培养基，并于22℃暗培养三天，之后用无菌水清洗茎段三次，并用无菌滤纸吸干多余水分，最后将茎段移到生芽培养基，于25℃暗培养7天，然后将茎段转移到光培养室进行生芽，通过绿色荧光筛选标记筛选阳性苗。

对获得的稳定干涉甜橙阳性苗的抗性进行评价。所用柑橘溃疡病菌株Xcc306(福建农林植物保护学院的邹华松教授和华中农业大学植物保护学院丁芳副教授惠赠)。在接种溃疡病病菌0天、7天和12天后分别取样。病斑面积用ImageJ软件计算，细菌生长采用qRT-PCR的方法测定TFB基因表达，然后根据公式(Xcc，pthA)＝10^{(38.3-ct)/3.56}计算溃疡病病菌数量，同时对获得的CsTFIIAγ干涉系RNAi-1和RNAi-4的TFIIAγ基因表达进行分析。TFIIAγ定量引物对如下所示：

TFIIAγ正向引物(IIAγ-qF)：5’-TGAAGAGCAAGGTCTCCATTAAG-3’

TFIIAγ反向引物(IIAγ-qR)：5’-TCCTCACTCTTGAACAAAGCATCT-3’

结果表明：RNAi-1和RNAi-4的TFIIAγ基因表达分别降低到对照的43％和62％(图2a)；在接种12天时，干涉系的病斑面积均显著小于对照组(图2b和2c)；且在接种7天和12天时，RNAi-1的细菌生长均显著低于对照组(图2d)。

实施例4溃疡病病菌TFBs不能与酒饼簕AbTFIIAγ互作

用于验证AbTFIIAγ与TFBs互作的酵母双杂交引物序列：

TFIIAγ正向引物(IIAγ-F)：5’-ATGGCGACGTTTGAGCTGTATC-3’

TFIIAγ反向引物(IIAγ-R)：5’-TTGTGATAGCAGCTTTGAGTC-3’

以酒饼簕样品cDNA为模板，IIAγ-F/IIAγ-R为引物扩增。将扩增得到的TFIIAγ编码序列(SEQ ID NO：2)通过同源重组法构建到pGADT7载体中，命名为AD-AbTFIIAγ；TFBi和TFBii序列构建到pGBKT7载体上，命名为BD-TFBi和BD-TFBii。本实施例所用的酵母双杂交阳性对照载体为pGBKT7-53/pGADT7-RecT，阴性对照载体为pGADT7/pGBKT7。

将构建好的连接有目的基因的pGADT7和pGBKT7载体共转化酵母菌株AH109，将转化产物涂于缺亮氨酸和色氨酸的缺陷培养基(SD)中，于30℃倒置培养3天，后挑取单克隆进行摇菌，培养20h后阳性鉴定。每个菌液先取10μl，然后加入10μl 20μm氢氧化钠，于98℃PCR仪中变性10min，取1μl作为PCR扩增模板。PCR反应体系为：2X Phanta max buffer 10μl，dNTP 0.4μl，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 0.4μl，正向和反向引物各0.8μl，最后用无菌水补足到20μl；将扩增得到的PCR产物送至上海擎科生物技术有限公司进行测序，然后将测序正确的菌液涂于四缺及四缺加X-α-gal的SD培养基上。

用于验证AbTFIIAγ与TFBs基因之间互作的双分子荧光互补试验引物序列：

JW771正向引物(771-F)：

5’-ACGGGGGACGAGCTCGGTACCATGGCGACGTTTGAGC-3’

JW771反向引物(771-R)：

5’-CGCGTACGAGATCTGGTCGACTTGTGATAGCAGCT-3’

JW772正向引物(772-F)：

5’-TACGCGTCCCGGGGCGGTACCATGAGCATTGTTGCCCAG-3’

JW772反向引物(772-R)：

5’-ACGAAAGCTCTGCAGGTCGACTTACATCCCTGATGCCTG-3’

将扩增的AbTFIIAγ与TFBs序列通过KpnI和SalI酶切位点分别引入到JW771-nLuc和JW772-cLuc载体，命名为AbTFIIAγ-nLuc、TFBi-cLuc和TFBii-cLuc。

将构建好的AbTFIIAγ-nLuc与TFBi-cLuc/TFBii-cLuc载体，及空载JW771-nLuc/JW772-cLuc分别转化GV3101农杆菌菌株，注射烟草时菌液浓度为OD ₆₀₀＝0.8，n端和c端载体分别按照1：1混合后共注射烟草，每个烟草叶片注射三个阴性对照(图3b和3c)中的a/b/d：AbTFIIAγ-nLuc/cLuc；TFBi-cLuc/nLuc或TFBii-cLuc/nLuc；nLuc/cLuc)和一个处理(图3b和3c)中的c：AbTFIIAγ-nLuc/TFBi-cLuc或AbTFIIAγ-nLuc/TFBii-cLuc)。

酵母双杂交试验(图3a)结果表明，和阴性对照一样，AD-AbTFIIAγ/BD-TFBi和AD-AbTFIIAγ/BD-TFBii共转化酵母菌株均不能在四缺(-T-L-H-A)及四缺加X-α-半乳糖苷酶显色底物(-T-L-H-A-X-α-gal)的SD培养基上生长，而阳性对照则可以生长。

双分子荧光互补试验(图3b和3c)结果表明，三个阴性对照a/b/d(图3b和3c)观测不到荧光信号，处理c共转化AbTFIIAγ-nLuc/TFBi-cLuc的烟草仅观测到及其微弱的荧光信号(图3b)，而转化AbTFIIAγ-nLuc/TFBii-cLuc的烟草和阴性对照一样观测不到荧光信号(图3c)。

酵母双杂和双分子荧光互补试验结果均表明：柑橘溃疡病病菌携带的TFBi和TFBii结构域不能与AbTFIIAγ蛋白互作。

实施例5第81位氨基酸的突变导致CsTFIIAγ和AbTFIIAγ与柑橘溃疡病病菌TFBs互作能力发生改变

利用两轮重叠PCR的方法分别在酒饼簕和甜橙TFIIAγ基因81位，87位和90位引入突变氨基酸。具体方法如下：

将IIAγ-F做正向引物，分别与突变的R引物扩增一轮(PCR产物为1)；同时将突变的R引物序列反向互补，做为正向引物F，分别与反向引物IIAγ-R扩增一轮(PCR产物为2)，扩增模板均为酒饼簕和甜橙cDNA。将含有相应突变位点的产物1和2按照1：1混合后作为第二轮扩增的模板，第二轮扩增引物均为IIAγ-F和IIAγ-R。将扩增得到的含有突变位点氨基酸的TFIIAγ序列连接到pGADT7载体上，分别命名为AD-CsTFIIAγ^L81V、AD-CsTFIIAγ^L87I、AD-CsTFIIAγ^T90N、AD-AbTFIIAγ^V81L、AD-AbTFIIAγ^I87L、AbTFIIAγ^N90T。所述三个突变位点引物对分别如下所示：

CsTFIIAγ^L81V正向引物(L81V-F)：5’-CATTCATCTTGCAAGATGCTG-3’

CsTFIIAγ^L81V反向引物(L81V-R)：5’-CAGCATCTTGCAAGATGAATG-3’

CsTFIIAγ^L87I正向引物(L87I-F)：5’-TGTTCAAGAGTGAGGAAATT-3’

CsTFIIAγ^L87I反向引物(L87I-R)：5’-AATTTCCTCACTCTTGAACA-3’

CsTFIIAγ^T90N正向引物(T90N-F)：5’-ACGTTGGTAGGGTGAAAATAG-3’

CsTFIIAγ^T90N反向引物(T90N-R)：5’-CTATTTTCACCCTACCAACGT-3’

AbTFIIAγ^V81L正向引物(V81L-F)：5’-ATTCATCTTGCAAGATGCTT-3’

AbTFIIAγ^V81L反向引物(V81L-R)：5’AAGCATCTTGCAAGATGAAT-3’

AbTFIIAγ^I87L正向引物(I87L-F)：5’-GTTCAAGAGTGAGGAATTA-3’

AbTFIIAγ^I87L反向引物(I87L-R)：5’-TAATTCCTCACTCTTGAAC-3’

AbTFIIAγ^N90T正向引物(N90T-F)：5’-CCGTTGGTAGGGTGAAAAT-3’

AbTFIIAγ^N90T反向引物(N90T-R)：5’-ATTTTCACCCTACCAACGG-3’

如图4a所示：BD-TFBi和BD-TFBii可以与突变的AD-AbTFIIAγ^V81L互作，而不能与突变的AD-AbTFIIAγ^I87L和AbTFIIAγ^N90T互作。

如图4b所示：BD-TFBi与突变的AD-CsTFIIAγ^L81V的互作能力明显减弱，而BD-TFBii不能与AD-CsTFIIAγ^L81V互作，但BD-TFBi和BD-TFBii仍可以与突变的AD-CsTFIIAγ^L87I和AD-CsTFIIAγ^T90N互作。

以上结果显示：在近缘野生种酒饼簕中发现了TFIIAγ基因的自然变异，接种试验结果表明：酒饼簕对柑橘溃疡病具有极强的抗病性，而且AbTFIIAγ基因不能被溃疡病病菌携带的TFBs利用；通过稳定干涉与溃疡病病菌TFBs互作的CsTFIIAγ基因增强了其对柑橘溃疡病的抗性。

突变试验结果表明：第81位氨基酸对互作有着及其重要的作用，因此，可以通过基因编辑技术将感病柑橘品种中的TFIIAγ第81位氨基酸亮氨酸突变为缬氨酸，以赋予柑橘对溃疡病的广谱抗性。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 野生柑橘资源AbTFIIAγ基因及其在柑橘抗溃疡病中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 2343

<212> DNA

<213> 酒饼簕(Atalantia buxifolia)

<400> 1

agccccaaaa tctctccgcc caaaaaaatt catcttcaca gcaaacgttc aacaactcta 60

ccatttacgt caatcaccac cccccaatac gtaagctcca atttgtaact tcaatttctc 120

catgcaattt tgtgttaact tgatcaaatt tttagataat catcatattt tttattgttg 180

tgtttttttg cctgtacaaa ttcaatcttg actcgatgca tttgttgaat atgtggactg 240

aatcgacaga tcacgtgaga aatggcgacg tttgagctgt atcgcaggtc gacgattggg 300

atgtgcttaa ccgagacttt agacgagatg gtccaaaacg gtacgctcac tcccgagctc 360

gctatccagg ttctcgtcca gttcgataag gtacggttat tcaattacat gttaacgagc 420

ttggtatttg gatacctatg tttattgttt ttttttgtga attatttatt tatctttttc 480

atcttatagt ctatgacaga agcactagaa actcaggtga agagcaaggt ctccattaag 540

gtatcaattt ctttttcttt taatttattt ttaatctttt aagatgcttt tttttttttt 600

gacgcacagt cttgttaagc atttgtctgt ttagggatct gaggtgtgaa tctggctatg 660

ttgtactttt gctttatttt gaaagaacaa tacgaatcac gcggccacct atacttgatg 720

gctactgatt ccattcactt gtggattaaa agcccaacaa tttgattcca gacatgccct 780

aattttgatt catgtattgc tggaggtgga agatctgttc tcagtgattg ctaatgaatt 840

gttagaaatc aaatgttatt gtgatgcact aatgtagaat atacatggca aaatttgtgg 900

tttaaatatt ctattggtgt ggtgtaaatc cactgctaga gataagagtt attcagcatg 960

tgttgagact attgagcttt tgcatcaggt gataattgac cttaatatta tttatgtata 1020

ttatttatag atttgccttt gaatgtcctt ttactgttaa gttgttagct gtcttttcaa 1080

agagttactc ttgttaaacg acaaaagctt tttttatgga aaatggccac tgggaccagt 1140

atcatgggct tcatagaagc catggtattt gggaatttga gatctcatgg aagaatcatt 1200

ctaaatgatt ggaattgggg actggcagtt gtaagattcc aagtttcttt cactttatta 1260

tatcattggc tttttccttt tcttaaagca attaattgga gtatctagta tgttaaaatt 1320

cttatttatt gaatgcctca tttatagtaa cttccttggc tttatatata cgttggatct 1380

cttaagattt tcatgcttgt ccaaacatca aatgaatcat ttgatttttt ctggctagcc 1440

cttgtgcttt ttgaatgagt caatgtgaca tgtccataaa gtgctcactt atgcgcttat 1500

tataaaatag ctgaggctga ccaaatggag gggaaaacaa ttgcccatgc gtaaatgctg 1560

gtctagtatt agcgcagaat ggtatatagg aacttgtacc caaattataa ctgttgtaga 1620

caaattatga aatctacatt aaattacaaa gaagttatac aatacttgag tcatatgact 1680

catggagagg aatctctgta aattttaagt ctccaaactg tttttcacag atgtctacgg 1740

ttatgcaaaa agtaaaaccc aaatttatgt attaatttta agtctgattg gatgcttact 1800

tttatgcgca gattcaactc attttgtaat tgtttgtgtt tgccaatttt tgtgagtgca 1860

aatgtgaggg gcatgcatgt ttttcatgca taattgtata tgttgaaaat aagagaaatt 1920

agattccttt gcaatgtgtt ttatccagag aagtaggctt cttaggctga tagctgagca 1980

ttataattca cgtcaatcca gacccttacc tagtttgtac tcttatcatt tatcttgttg 2040

tgggtgaaat ctgagcattt gaaattttaa cttctcctgg attcctcagg ggcatctgca 2100

cacttacagg ttctgtgaca acgtgtggac attcatcttg caagatgctg tgttcaagag 2160

tgaggaaatt caagagaacg ttggtagggt gaaaatagtg gcatgtgact caaagctgct 2220

atcacaatga gacaatgaag attggtttgt tgctggggaa ttagattaaa ttacttggag 2280

aaggtggcaa ttatgcatta ttgatgagca taatttgtaa agccgccaac tgttttcaac 2340

tgg 2343

<210> 2

<211> 321

<212> DNA

<213> 酒饼簕(Atalantia buxifolia)

<400> 2

atggcgacgt ttgagctgta tcgcaggtcg acgattggga tgtgcttaac cgagacttta 60

gacgagatgg tccaaaacgg tacgctcact cccgagctcg ctatccaggt tctcgtccag 120

ttcgataagt ctatgacaga agcactagaa actcaggtga agagcaaggt ctccattaag 180

gggcatctgc acacttacag gttctgtgac aacgtgtgga cattcatctt gcaagatgct 240

gtgttcaaga gtgaggaaat tcaagagaac gttggtaggg tgaaaatagt ggcatgtgac 300

tcaaagctgc tatcacaatg a 321

<210> 3

<211> 106

<212> PRT

<213> 酒饼簕(Atalantia buxifolia)

<400> 3

Met Ala Thr Phe Glu Leu Tyr Arg Arg Ser Thr Ile Gly Met Cys Leu

1 5 10 15

Thr Glu Thr Leu Asp Glu Met Val Gln Asn Gly Thr Leu Thr Pro Glu

20 25 30

Leu Ala Ile Gln Val Leu Val Gln Phe Asp Lys Ser Met Thr Glu Ala

35 40 45

Leu Glu Thr Gln Val Lys Ser Lys Val Ser Ile Lys Gly His Leu His

50 55 60

Thr Tyr Arg Phe Cys Asp Asn Val Trp Thr Phe Ile Leu Gln Asp Ala

65 70 75 80

Val Phe Lys Ser Glu Glu Ile Gln Glu Asn Val Gly Arg Val Lys Ile

85 90 95

Val Ala Cys Asp Ser Lys Leu Leu Ser Gln

100 105