阅读说明：本技术 水泡型口炎病毒包膜糖蛋白变体及其构建方法和应用 (Vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein variant, and construction method and application thereof ) 是由 石磊 慈雅丽 于 2019-06-10 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种水泡型口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)变体、其构建方法及其在制备水泡型口炎病毒(VSV)疫苗中的应用。(The invention relates to a vesicular stomatitis virus envelope glycoprotein (VSV-G) variant, a construction method thereof and application thereof in preparation of a Vesicular Stomatitis Virus (VSV) vaccine.)

水泡型口炎病毒包膜糖蛋白变体及其构建方法和应用

技术领域

本发明涉及一种水泡型口炎病毒包膜糖蛋白(VSV-G)功能缺失变体及其构建方法和应用。

背景技术

水泡型口炎病毒/水疱性口炎病毒(Vesicular Stomatitis Virus,VSV)是弹状病毒家族成员，属于包膜病毒，此类病毒因其形似子弹而得名，其家族成员除VSV还有狂犬病毒和过客病毒。

VSV能感染多种动物和昆虫。家畜中自然感染VSV的有马、牛、羊和猪等，野生动物(野猪、浣熊和鹿等)可以被自然感染。受感染的动物表现为发热、嗜睡、食欲下降，在口腔、***、趾间及蹄冠上出现水疱性病灶和腿部的罐状环带。水泡易破裂，露出肉芽组织，呈红色糜烂，周围有刮破的上皮，可在7至10天内自愈。水泡型口炎病毒导致的牲畜感染通常不是致死性的，但是，可造成局部继发细菌和真菌感染，从而导致跛行、体重下降、出奶下降和乳腺炎等症状，带来重大经济损失。早在十九世纪初就有报道美国的马、牛、猪感染本病。美国内战期间，因此病导致4000匹战马不能作战。以后美国几乎每隔10年就暴发一次。后来墨西哥、中美洲、巴拿马、委内瑞拉、哥伦比亚、秘鲁、阿根廷、巴西、法国和南非等国相继报道过本病。目前尚未在中国出现大面积流行。据世界动物卫生组织道，南美、中美几乎所有的国家和地区以及北美的美国等国家在二十世纪末暴发了大面积的VSV流行，造成严重的经济损失。因此，针对VSV的抗病毒研究具有兽医、畜牧养殖和经济上的重要意义。

目前，市场上尚无一种有效的VSV疫苗用于VSV感染的预防和治疗。对病毒疫苗的研究主要集中在亚单位疫苗、灭活疫苗、减毒疫苗和基因工程疫苗这几个方面。研究表明，基于蛋白大分子的亚单位疫苗免疫原性较低，且需与佐剂合用，多次注射。灭活疫苗减毒疫苗通常只引起体液免疫，不能激发起重要作用的细胞免疫，且需要接种几次。而减毒疫苗作为活病毒，进入体内后能够同时诱发体液免疫和细胞免疫，接种量小，免疫维持时间较长，从免疫效果上来说明显优于亚单位疫苗和灭活疫苗。但减毒疫苗也存在一定缺陷，如，需要对菌株进行大量长期的筛选，毒力有回复的可能，病毒可在体内增殖，因此对免疫缺陷者可能并不适用。

由于VSV的广泛流行性、高度感染性、变异性、抗体保护的特殊性，及其流行带来的巨大的经济损失，因此开发利用安全高效的VSV疫苗具有重要的现实意义，并且在世界范围具有广阔的市场前景。

发明内容

病毒包膜蛋白是暴露在具有包膜的病毒表面的重要蛋白，在介导病毒包膜与细胞膜融合然后侵入细胞的过程中具有关键作用。由于其暴露在病毒表面，具有良好的抗原性，可以被宿主系统识别并产生抗体，水泡型口炎病毒可刺激机体产生高滴度的中和抗体和诱导体液免疫的产生，是良好的疫苗载体(J Virol.2000Dec；74(23):10903–10910；PostepyHig Med Dosw(Online).2013Jan 11；67:1345-58)。

发明人在研究中意外发现，当VSV-G跨膜区被其它序列置换或其胞外近膜区被延长后，VSV-G介导的病毒与细胞融合的能力显著降低，从而抑制了VSV-G介导的病毒入侵。携带上述VSV-G变体的病毒进入体内后，由于不能与细胞膜融合侵入细胞进行复制增殖，避免了细胞损伤及坏死；同时，完整的病毒颗粒可以与机体的免疫系统充分接触，诱导特异性细胞免疫和体液免疫的产生，可作为一种安全有效的基因工程减毒疫苗。本发明的这种VSV基因工程减毒疫苗，既可以保留传统减毒疫苗的优点，又避免了毒力回复的可能，能够满足未被满足的健康需求。

发明人在此基础上完成了本发明，并提供以下技术方案。

在一个方面，本发明提供了一种VSV-G蛋白变体，其跨膜区具有突变。

优选地，所述跨膜区突变为置换，即VSV-G跨膜区被其它跨膜蛋白的跨膜区替换。

在本发明的一个实施方案中，所用VSV-G基因序列来自Vesicular StomatitisIndiana virus(GenBank识别号:J02428.1)，如SEQ ID NO:1所示；其对应的VSV-G蛋白序列如SEQ ID NO:2所示。

SEQ ID NO:2

在一个实施方案中，本发明构建了一系列VSV-G跨膜区置换变体。

其中，所述跨膜区位于VSV-G氨基酸序列的465至490位，其序列如SEQ ID NO:3所示，

SEQ ID NO:3：IASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCI。

其中，可用于置换VSV-G跨膜区的非VSV-G跨膜区的可跨膜序列选自：

1)病毒融合蛋白的跨膜区序列，其中所述病毒不是VSV；

2)膜蛋白的跨膜区序列，所述膜蛋白不是病毒膜蛋白；和

3)与1)和2)所述蛋白跨膜区之氨基酸序列具有至少60％、70％、80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％一致性的跨膜区序列。

本发明所述“病毒融合蛋白”是指介导病毒与宿主细胞融合的病毒蛋白质。

在一些实施方案中，所述可跨膜序列选自以下蛋白跨膜区氨基酸序列：

A)Syntaxin 1A蛋白的跨膜区或其片段，例如所述Syntaxin 1A蛋白的跨膜区含有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列或由其组成；SEQ ID NO:4，IMIIICCVILGIIIASTIGGIFG；

B)VAMP2蛋白的跨膜区或其片段，例如所述VAMP2蛋白的跨膜区含有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列或由其组成；SEQ ID NO:5，MMIILGVICAIILIIIIVYFST；

C)流感病毒HA蛋白的跨膜区或其片段，例如所述流感病毒HA蛋白的跨膜区含有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列或由其组成；SEQ ID NO:6，ILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLW。

SNARE蛋白是细胞膜上一类介导膜融合的蛋白(J Pept Sci.2015Aug；21(8):621-9)，Syntaxin 1A和VAMP2都属于这类蛋白。

发明人在研究中意外发现，VSV-G跨膜区被Syntaxin 1A或VAMP2跨膜区置换后，导致细胞实验中VSV-G介导的细胞融合能力降低约30～40％，而VSV-G跨膜区被流感病毒HA跨膜区置换后，导致细胞实验中VSV-G介导的细胞融合能力降低约80％。

在另一个方面，本发明提供了一种VSV-G蛋白变体，其胞外近膜区具有突变，所述胞外近膜区位于VSV-G蛋白靠近跨膜区的胞外区，含有SEQ ID NO:7所示序列，

SEQ ID NO:7，TGLSKNPIELVEGWFSSWKSS。

优选地，所述胞外近膜区突变为***，即在该区域***一个或更多个额外氨基酸。

在一个实施方案中，本发明构建了一系列的VSV-G胞外近膜区***变体，优选为***3至20个氨基酸，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个氨基酸，更优选为6个氨基酸。在本发明中，对***的氨基酸的种类无特殊限制。

发明人发现，VSV-G胞外近膜区被***1、2、3、4、5和6个氨基酸后，导致细胞实验中VSV-G介导的细胞融合能力分别降低7％、18％、26％、39％、79％和90％。

在另一个方面，本发明提供了一种疫苗组合物，其包含如上所述的VSV-G跨膜区和/或胞外近膜区的突变。

优选地，所述VSV-G蛋白变***于病毒颗粒表面，所述病毒颗粒不具有导致VSV所致疾病的能力。

具体地，病毒颗粒可以是VSV本身，也可以是其它不含有致病基因的病毒。

进一步地，所述疫苗组合物还包含免疫学和药学上可接受的载体或佐剂。

在本发明的一个实施方案中，VSV-G跨膜区变体被包装到慢病毒表面并感染Hela细胞，发现Syntaxin 1A或VAMP2跨膜区置换导致慢病毒的感染效率降低了约50％，而流感病毒HA跨膜区置换导致慢病毒的感染效率降低了约90％。证明跨膜区的置换能降低VSV-G介导的病毒与细胞的融合能力。

在本发明的另一个实施方案中，VSV-G胞外近膜区变体被包装到慢病毒表面并感染Hela细胞，发现VSV-G近膜结构域1至6个氨基酸的***导致慢病毒的感染效率分别降低了26％、45％、68％、80％、93％和98％。证明VSV-G胞外近膜区***氨基酸能降低VSV-G介导的病毒与细胞的融合能力，并且随着氨基酸***数量的相应增加，其融合能力相应下降。当***的氨基酸为6个时，病毒与细胞的融合能力仅为野生型VSV-G的2％。

在又一方面，本发明提供了同时具有跨膜区和胞外近膜区突变的VSV-G变体。

已有研究表明，水泡型口炎病毒是通过侵入细胞进行大量复制从而导致细胞坏死，水泡型口炎病毒并不具有特殊的致病基因。VSV-G介导病毒包膜与细胞膜的融合，进而使病毒得以侵入细胞，因此，VSV-G介导的融合功能决定着病毒的毒力。同时，VSV-G也是水泡型口炎病毒的主要表面抗原，可刺激机体产生中和抗体。本发明提供的VSV-G变体具有显著降低的融合能力，从而显著降低了病毒的感染性。此外，由于水泡型口炎病毒感染没有致死性，在无并发症的情况下，受感染的动物可在一段时间后自愈。因此，本发明提供的包含VSV-G变体的病毒具有很好的安全性；同时，所述VSV-G变体仅在跨膜区和/或胞外近膜区具有突变，而暴露于膜表面的整个胞外区保持完整，因此完整地保留了VSV-G的抗原性，可用于制备安全高效的VSV基因工程疫苗。

在另一个方面，本发明还提供了一种构建VSV基因工程疫苗的方法，其包括下列步骤：

(1)利用基因工程技术，在体外对VSV-G核酸序列中的编码跨膜区的核酸序列进行置换；和/或

(2)利用基因工程技术，在体外对VSV-G核酸序列中的编码胞外近膜区的核酸序列内***编码一个或更多个氨基酸的序列；

(3)将步骤(1)或(2)获得的序列与病毒包装系统一起导入包装细胞，获得病毒。

在一些实施方案中，步骤1)中用于置换VSV-G跨膜区的序列选自以下的蛋白跨膜区的氨基酸序列：

A)Syntaxin 1A蛋白的跨膜区或其片段，例如所述Syntaxin 1A蛋白的跨膜区具有SEQ ID NO:4所示氨基酸序列；

B)VAMP2蛋白的跨膜区或其片段，例如所述VAMP2蛋白的跨膜区具有SEQ ID NO:5所示氨基酸序列；

C)流感病毒HA蛋白的跨膜区或其片段，例如所述流感病毒HA蛋白的跨膜区具有SEQ ID NO:6所示氨基酸序列。

在另一些实施方案中，步骤2)中***的氨基酸为3至20个额外氨基酸，例如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个额外氨基酸，更优选为至少6个额外氨基酸。

在另一个方面，本发明提供了包含编码上述VSV-G蛋白变体的核苷酸序列。

在又一个方面，本发明还提供了上述VSV-G蛋白变体、多核苷酸和/或疫苗组合物在制备用于预防和/或治疗VSV所致疾病的药物中的用途。

在又一个方面，本发明还提供了一种预防和/或治疗VSV所致疾病的方法，其包括向有此需要的对象施用所述的VSV-G蛋白变体、多核苷酸和/或疫苗组合物。所述施用选自肌肉注射、皮内注射、皮下注射、静脉注射、粘膜施用及其任意组合。所述对象选自马、牛、羊和猪。

改造后的基因工程病毒进入血液/体液后被机体的免疫系统识别并诱导特异性免疫反应，使机体获得对同种病毒的免疫力。同时，由于是使用完整活病毒进行免疫，所需接重量小，获得的抗体效价高。而融合能力的缺陷也可能减缓VSV-G被细胞降解的进程，延长其抗原活化效应时间，增强免疫应答。这些都是以往VSV疫苗设计中无法实现的。

在一个实施方案中，发明人将上述融合能力缺陷但是保留活性抗原表位的VSV-G蛋白装载到不具有自我复制能力的慢病毒表面，利用病毒载体保证其在体内高效运输，避免运输过程中额外的降解，同时保证其被宿主细胞识别和吞噬，以激活体内免疫反应，增加了疫苗的安全性，增强了本系统作为病毒疫苗的应用潜力。

以上几方面说明，发明人建立的依赖于VSV-G融合能力缺陷变体组装的病毒系统是一种安全有效的基因工程疫苗系统，具有广阔的应用前景。

附图说明

图1示VSV-G介导的细胞-细胞融合检测方法示意图。胞浆表达红色荧光蛋白同时携带有VSV-G的细胞与胞核表达青色荧光蛋白的细胞在低pH的条件下发生融合，融合细胞含有红色的胞浆和多个青色的胞核。

图2示检测VSV-G融合能力的Hela细胞融合模型。图2A示不表达VSV-G的Hela细胞在低pH条件下无融合事件的发生；图2B示表达VSV-G的Hela细胞在低pH条件下可以诱导大量融合事件的发生。

图3示跨膜区替换显著降低VSV-G介导的细胞-细胞融合能力。图中含有多个细胞核的巨大细胞是发生融合后的细胞，标尺，40μm。

图4示图3实验的统计学分析结果。***表示P<0.001。

图5示近膜结构区的氨基酸***显著降低VSV-G介导的细胞-细胞融合能力，且融合能力的降低与***氨基酸数目呈反比。图中含有多个细胞核的巨大细胞是发生融合后的细胞。标尺，50μm。

图6示图5实验的统计学分析结果。

图7示跨膜区替换显著降低VSV-G介导的慢病毒感染细胞的效率。用野生型或跨膜区替换的嵌合型VSV-G构建重组的慢病毒，感染Hela细胞，被病毒感染的细胞表达GFP作为标记，用共聚焦显微镜观察结果。标尺，30μm。

图8示图7实验的流式细胞术分析。图8A示流式细胞术记录结果，图8B示统计学分析结果，***，P<0.001。

图9示近膜结构区的氨基酸***显著降低VSV-G介导的慢病毒感染细胞的效率。共聚焦显微镜观察表达不同VSV-G变体的病毒感染细胞后图像。标尺，50μm。

图10示图9实验的统计学结果。

具体实施方式

下面对本发明作进一步的说明，但不以任何方式对本发明加以限制，基于本发明教导所作的任何变换，均落入本发明的保护范围。

实施例

以下实施例结合附图仅为举例说明本文公开的发明，在任何情况下都不应解释为对所附权利要求保护范围的限制。

实施例1实验相关方法和流程

1.1.细胞培养

HEK293T(CRL-11268)和Hela(CRM-CCL-2)细胞培养于37℃、饱和湿度、5％CO₂的细胞培养箱中。

1.2.Western印迹

1)弃去培养基，用PBS缓冲液洗涤2次；

2)加入预冷的全细胞蛋白裂解液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，1％NP-40，0.5％sodium deoxycholate)，约30μL/mL细胞，吹打混匀，置于冰上裂解10min；

3)将细胞裂解悬液于4℃ 13300rpm离心10min，将上清转移至新的EP管中，即获得细胞全蛋白提取液；

4)按比例加入6x SDS加样缓冲液(6x loading buffer:3.75mL 1M Tris pH 6.8，1.2g SDS，6mL glycerol，0.006g bromophenol blue，0.462g DTT)，100℃沸水浴5-10min；

5)将样品上样于SDS-PAGE胶，样品在浓缩胶中时，以80V进行电泳，当样品泳动至分离胶中时改用120V进行电泳；

6)将大小合适的NC膜(硝酸纤维素膜)浸泡于电转缓冲液(3.03g Tris+14.42gGly+200mL CH₃OH配成1L)中平衡离子强度；

7)电泳停止后，将电泳完毕的胶转移到电转缓冲液中；

8)按下述顺序(由下至上)在电转缓冲液中制作转膜体系：滤纸，NC膜，带有蛋白样品的凝胶，滤纸；

9)将上述转膜体系放入事先在电转缓冲液中浸湿的海绵垫，凝胶一面朝向负极，NC膜一面朝向正极；

10)在电转槽中倒入电转缓冲液，置于冰水浴中以200mA的电流恒流进行电转1.5-2h；

11)封闭：将NC膜置于5％的脱脂奶粉溶液中，于室温下缓慢摇动孵育0.5-1h，之后用TBST(Tris-HCL(1M,pH7.5):50Ml；NaCl:8g；KCL:0.2g；吐温:0.5ml；加蒸馏水定容至1L)摇动洗涤3次；

12)一抗孵育：用5％BSA(以TBST配制)溶液按适当比例稀释一抗，将NC膜放入密封袋，加入一抗，4℃孵育过夜或室温孵育2h；

13)NC膜的洗涤：一抗孵育结束后，取出NC膜，加入适量TBST溶液缓慢摇动洗涤3次，每次5min；

14)二抗孵育：用5％BSA(以TBST配制)以1:5000的比例稀释二抗，将NC膜放入密封袋，加入二抗，室温孵育1h；

15)NC膜的洗涤：二抗孵育结束后，用小镊子取出NC膜，加入适量TBST溶液缓摇洗涤3次，每次5min；

16)ECL曝光：将NC膜于滤纸上适当沥干，平铺于塑料薄膜上，按说明书滴加ECL反应液(PerkinElmer,USA)，反应完成后在暗室内用X光片进行曝光，显影和定影后获得信号图像。

实施例中用到的抗体来源如下：anti-VSV G antibody(1:12,000；Santa Cruz,sc-66180),anti-p24antibody(1:30,000；Sino Biological Inc.),anti-β-actinantibody(1:10,000；Sigma-Aldrich,A5441)。

1.3.膜蛋白生物素标记实验

实验原理

细胞表面蛋白是一群重要的细胞组分，其定位在细胞质膜表面。为了方便对这些膜表面蛋白的功能进行研究，很多时候需要分离出膜表面蛋白。可以利用膜不通透的、氨基反应性的生物素化试剂sulfo-NHS-Biotin(Thermo scientific,货号21217)与细胞表面蛋白的氨基形成稳定的共价连接，使细胞表面蛋白发生生物素化。然后利用链霉抗生物素琼脂糖树脂(streptavidin agarose resin，Thermo fisher scientific,货号20349)通过链霉抗生物素(streptavidin)和生物素之间的相互作用即可将膜表面的蛋白分离出来。

实验步骤

1)向12孔板中接种4×10⁵/孔Hela细胞，次日转染目的质粒；

2)转染48h后，弃去细胞培养基，用预冷的HBSS(Hyclone)洗涤3次；

3)加入0.25mg/ml EZ-Link sufo-NHS-Biotin于4℃孵育15min；

4)用预冷HBSS洗涤3次，加入200mM甘氨酸于4℃孵育15min；

5)用预冷HBSS洗涤3次，加入400μL细胞裂解液，冰上裂解10min；

6)收集细胞裂解物至1.5ml EP管中，以200W功率超声，每次5s，间隔3s，共超声3次；

7)将细胞裂解物于4℃离心机中以13300rpm离心10min；

8)将上清移至新管，取40μL作为对照，向剩余的细胞裂解物中加入30μL链霉抗生物素蛋白琼脂糖树脂，4℃旋转孵育4h；

9)离心弃上清，用预冷的细胞裂解液洗涤树脂3次，最后加入蛋白上样缓冲液煮沸7min；

10)Western印迹检测目的蛋白水平。

1.4目的基因的定点突变

PCR扩增目的DNA

反应体系(全式金)：

5×buffer	4μL
		Plasmid	50-100ng
dNTP	2μL
		上下游引物(10μM)	1.5μL
DNA polymerase	0.8μL
		ddH<sub>2</sub>O	补足20μL

用于构建VSV-G跨膜区变体的PCR引物如下表所示(每对引物携带对应于3-5个氨基酸的突变，通过5轮PCR反应构建各个跨膜区变体)：

用于构建VSV-G胞外近膜区变体的PCR引物如下表所示：

PCR反应条件：

向PCR产物中加入1μL DpnI酶，37℃消化3h；

取适量PCR产物转化大肠杆菌；

次日将长出的单个菌落分别接种到液体培养基中扩增，提取质粒进行测序验证。

实施例2VSV-G介导的细胞融合

VSV-G作为病毒融合蛋白，其融合能力已经得到证实。为了对其融合功能进行定量分析以及实时监控融合发生的动力学过程，发明人构建了一个细胞-细胞融合系统。将带有核输出信号的红色荧光蛋白(dsRED-nes)与VSV-G共转染细胞，转染的细胞胞浆在荧光显微镜下为红色，VSV-G表达于细胞膜的表面；另外，将带有核定位信号的青色荧光蛋白(CFP-nls)转染细胞，转染的细胞胞核在荧光显微镜下为青色。将这两种细胞共同培养，利用低pH诱导VSV-G介导的融合，如果出现胞浆为红色同时含有多于一个青色的胞核的细胞即为发生了融合的细胞，如图1和图2所示。

1.细胞-细胞融合实验流程

1)在24孔板中以2×10⁵/孔的密度接种Hela细胞；

2)次日，转染表达dsRED-nes的质粒和表达VSV-G的质粒；

3)在另一个24孔板中放入玻片，在玻片上以7×10⁴/孔的密度接种在胞核中稳定表达CFP的HeLa细胞；

4)用柠檬酸钠缓冲液(11g KCl,4.4g柠檬酸钠加水定容到1升)消化步骤2)获得的表达VSV-G的Hela细胞，以1×10⁵/孔的密度接种到步骤3)的24孔板中，与CFP稳定细胞共培养；

5)16h后，向24孔板加入pH 5.0-6.0的MES缓冲液(MES,cat no.18886；USB,USA)处理细胞1min；

6)更换成新鲜完全培养液后继续培养3h；

7)弃去培养液，用4％多聚甲醛(PFA)固定细胞10min，PBS洗涤3次，每次5min；

8)取出玻片，封闭后置于激光共聚焦显微镜下观察并记录图像。

2.活细胞成像检测

1)在12孔板中以4×10⁵/孔的密度接种Hela细胞；

2)次日，转染表达dsRED-nes的质粒和表达VSV-G的质粒；

3)将胞核表达CFP的稳定细胞以7×10⁴的密度接种在35mm显微镜专用玻璃底培养皿中；

4)用柠檬酸钠缓冲液消化步骤2)获得的表达VSV-G的Hela细胞，以4×10⁵/孔的密度接种到步骤3)的培养皿中与CFP稳定细胞共培养；

5)16h后，用pH6.0的MES缓冲液处理细胞1min，然后更换为新鲜完全培养基；

6)将培养皿置于激光共聚焦显微镜的小型培养装置中，在显微镜的Time Series功能下，每15s捕捉一张图像，记录细胞融合的动态变化过程。

3.VSV-G跨膜区置换变体的融合能力检测

采用常规分子克隆技术构建VSV-G跨膜区置换变体，PCR引物参见实施例1部分，所用表达载体为pMD2.G(购自Addgene)，所述跨膜区位于VSV-G氨基酸序列的465至490位(IASFFFIIGLIIGLFLVLRVGIHLCI，SEQ ID NO:3)。

将VSV-G跨膜区置换为Syntaxin 1A蛋白的跨膜区(IMIIICCVILGIIIASTIGGIFG，SEQ ID NO:4)，获得Stx1A跨膜区置换变体(缩写为Stx1A)；

将VSV-G跨膜区置换为VAMP2蛋白的跨膜区(MMIILGVICAIILIIIIVYFST，SEQ IDNO:5)，获得VAMP2跨膜区置换变体(缩写为VAMP2)；

将VSV-G跨膜区置换为流感病毒HA蛋白的跨膜区(ILSIYSTVASSLALAIMVAGLSLW，SEQ ID NO:6)，获得HA跨膜区置换变体(缩写为HA)。

将上述构建完成的表达质粒分别导入细胞-细胞融合系统，检测VSV-G跨膜区置换变体介导细胞融合的能力。实验共设4组：野生型对照组(VSV-G)，Stx1A跨膜区置换变体(Stx1A)，VAMP2跨膜区置换变体(VAMP2)，HA跨膜区置换变体(HA)。结果如图3和图4所示。由图3可以看出，野生型VSV-G可以介导大量细胞融合，形成具有多个细胞核的巨大的融合细胞。而各个VSV-G变体均导致发生融合的细胞数不同程度的下降。图4的统计学分析显示，Syntaxin 1A或VAMP2跨膜区置换导致实验中VSV-G介导的细胞融合能力降低约30～40％，而流感病毒HA跨膜区置换导致实验中VSV-G介导的细胞融合能力降低约80％。这个结果表明，用其它蛋白的跨膜区置换野生型VSV-G跨膜区会在不同程度上导致VSV-G介导的细胞融合能力的降低。

4.VSV-G胞外近膜区***变体的融合能力检测

采用常规分子克隆技术构建VSV-G胞外近膜区***变体，PCR引物参见实施例1部分，所用表达载体为pMD2.G，所述胞外近膜区位于VSV-G氨基酸序列的444至464位(TGLSKNPIELVEGWFSSWKSS，SEQ ID NO:7)，***位置为459和460位之间。

细胞融合实验共设7组：野生型对照组(WT)，***1个氨基酸的变体(linker 1，***一个丝氨酸)，***2个氨基酸的变体(linker 2，***甘氨酸和丝氨酸)，***3个氨基酸的变体(linker 3，***甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)，***4个氨基酸的变体(linker 4，***甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸)，***5个氨基酸的变体(linker 5，***甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸)，***6个氨基酸的变体(linker 6，***甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸-甘氨酸-甘氨酸-丝氨酸)。结果如图5和图6所示。由图5可以看出，野生型VSV-G可以介导大量细胞融合，形成具有多个细胞核的巨大的融合细胞。而随着胞外近膜区***氨基酸数量的增加，VSV-G介导细胞融合能力的随之降低。图6的统计学分析显示，VSV-G近膜结构域1～6个氨基酸的***导致实验中VSV-G介导的细胞融合能力分别降低7％、18％、26％、39％、79％和90％。

实施例3表达VSV-G变体的慢病毒的制备及细胞感染实验

VSV-G作为一种病毒融合蛋白，介导病毒包膜与靶细胞内吞体膜的融合，进而侵入细胞。VSV-G介导融合的宿主范围十分广泛，VSV-G可被表达于基因工程化的慢病毒表面，作为慢病毒转染载体的融合原，由于基因工程化的慢病毒无自我复制能力，安全性高，该系统在研究中得到广泛应用。在由pLVTHM、pMD 2.G和psPAX2三种质粒(均购自Addgene)组成的慢病毒包装体系中，pMD 2.G携带VSV-G基因，使获得的病毒表面表达有VSV-G，可介导病毒与细胞的融合。发明人利用常规分子克隆技术，参照实施例2对VSV-G进行改造，置换其跨膜区或在胞外近膜区***氨基酸。在所述慢病毒包装体系中，pLVTHM质粒携带有GFP基因，病毒侵入细胞后可表达绿色荧光蛋白作为观察标记，通过观察绿色荧光蛋白来判断VSV-G是否能介导病毒与细胞的融合。

1.病毒制备

1)以1×10⁶/孔的密度将293T细胞接种到6孔板中；

2)次日，向每孔293T细胞转染1.17μg pLVTHM，0.8μg psPAX2以及0.53μg pMD 2.G(表达VSV-G或其变体)；

3)转染24h后，弃去细胞培养液，更换为新鲜的Opti-MEM培养液(Invitrogen)，继续培养；

4)24-48h后，收集含有病毒的培养液，4000rpm离心10min，将上清移至新管作为病毒原液，立即使用或-80℃保存备用。

2.病毒感染实验

1)将各病毒原液按照1:5，1:25，1:125，1:625的比例加入接种有相同数量Hela细胞的6孔板；

2)培养24h后，将培养液更换为新鲜的完全培养基，继续培养；

3)12h后，弃去培养液，用4％PFA固定细胞，置于共聚焦显微镜下观察并记录图像；或用胰酶消化细胞后，进行流式细胞术定量分析被病毒感染细胞(GFP阳性细胞)的比例。

3.具有VSV-G跨膜区置换变体病毒的感染能力测定

采用常规分子克隆技术对pMD 2.G质粒携带的野生型VSV-G基因进行改造，构建VSV-G跨膜区置换变体，制备病毒后进行细胞感染实验。实验共设4组：表达野生型VSV-G的病毒对照组(VSV-G)，表达Stx1A跨膜区置换变体的病毒(Stx1A)，表达VAMP2跨膜区置换变体的病毒(VAMP2)，表达HA跨膜区置换变体的病毒(HA)。感染细胞后结果如图7和8所示。在共聚焦荧光显微镜下，被感染的细胞由于表达GFP报告基因而在特定激发波长下呈绿色。由图7可以看出，表达野生型VSV-G的病毒加入细胞培养皿后，能够与细胞融合，感染进入细胞，表达GFP报告基因，细胞在荧光显微镜下为绿色。而表达跨膜区置换变体的病毒加入细胞培养皿后，只有少量细胞呈现绿色，表明病毒的感染能力明显降低。用流式细胞仪计数感染细胞(GFP阳性细胞)，结果如图8A所示。图8B的统计学分析显示，Syntaxin 1A或VAMP2跨膜区置换导致病毒的感染效率降低了约50％(p<0.01)，而流感病毒HA跨膜区置换导致慢病毒的感染效率降低了约90％(p<0.001)。

4.具有VSV-G胞外近膜区***变体病毒的感染能力测定

采用常规分子克隆技术对pMD 2.G质粒携带的野生型VSV-G基因进行改造，构建VSV-G胞外近膜区***变体，制备病毒后进行细胞感染实验。实验共设7组：野生型对照组(WT)，***1个氨基酸的变体(linker1)，***2个氨基酸的变体(linker 2)，***3个氨基酸的变体(linker 3)，***4个氨基酸的变体(linker 4)，***5个氨基酸的变体(linker 5)，***6个氨基酸的变体(linker 6)。结果如图9和图10所示。由图9可以看出，表达野生型VSV-G的病毒加入细胞培养皿后，能够与细胞融合，感染进入细胞，表达GFP报告基因，细胞在荧光显微镜下为绿色。而随着***胞外近膜区氨基酸数量的增加，表达绿色荧光蛋白的细胞数显著下降，表明病毒与细胞融合的能力降低，导致被感染的细胞数下降。图10的统计学分析显示，VSV-G近膜结构域1-6个氨基酸的***使病毒的感染效率分别降低了26％，45％，68％，80％，93％和98％(p<0.01)。

以上结果表明，本发明构建的水泡型口炎病毒融合蛋白(VSV-G)功能缺失变体(包括跨膜区置换变体和近膜结构域***变体)，能够显著降低VSV-G介导的病毒与细胞的融合，阻断病毒侵入细胞导致的细胞损伤或坏死；本发明构建的VSV-G并未改变VSV-G胞外区的原有序列和结构，充分保留了其抗原性，可用于制造安全有效的VSV基因工程疫苗，达到有效的预防和治疗作用。

SEQUENCE LISTING

<110> 水泡型口炎病毒包膜糖蛋白变体及其构建方法和应用

<120> 中国医学科学院基础医学研究所

<130> MP1910835

<160> 49

<170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 1536

<212> DNA

<213> Vesicular stomatitis virus

<400> 1

atgaagtgcc ttttgtactt agccttttta ttcattgggg tgaattgcaa gttcaccata 60

gtttttccac acaaccaaaa aggaaactgg aaaaatgttc cttctaatta ccattattgc 120

ccgtcaagct cagatttaaa ttggcataat gacttaatag gcacagccat acaagtcaaa 180

atgcccaaga gtcacaaggc tattcaagca gacggttgga tgtgtcatgc ttccaaatgg 240

gtcactactt gtgatttccg ctggtatgga ccgaagtata taacacagtc catccgatcc 300

ttcactccat ctgtagaaca atgcaaggaa agcattgaac aaacgaaaca aggaacttgg 360

ctgaatccag gcttccctcc tcaaagttgt ggatatgcaa ctgtgacgga tgccgaagca 420

gtgattgtcc aggtgactcc tcaccatgtg ctggttgatg aatacacagg agaatgggtt 480

gattcacagt tcatcaacgg aaaatgcagc aattacatat gccccactgt ccataactct 540

acaacctggc attctgacta taaggtcaaa gggctatgtg attctaacct catttccatg 600

gacatcacct tcttctcaga ggacggagag ctatcatccc tgggaaagga gggcacaggg 660

ttcagaagta actactttgc ttatgaaact ggaggcaagg cctgcaaaat gcaatactgc 720

aagcattggg gagtcagact cccatcaggt gtctggttcg agatggctga taaggatctc 780

tttgctgcag ccagattccc tgaatgccca gaagggtcaa gtatctctgc tccatctcag 840

acctcagtgg atgtaagtct aattcaggac gttgagagga tcttggatta ttccctctgc 900

caagaaacct ggagcaaaat cagagcgggt cttccaatct ctccagtgga tctcagctat 960

cttgctccta aaaacccagg aaccggtcct gctttcacca taatcaatgg taccctaaaa 1020

tactttgaga ccagatacat cagagtcgat attgctgctc caatcctctc aagaatggtc 1080

ggaatgatca gtggaactac cacagaaagg gaactgtggg atgactgggc accatatgaa 1140

gacgtggaaa ttggacccaa tggagttctg aggaccagtt caggatataa gtttccttta 1200

tacatgattg gacatggtat gttggactcc gatcttcatc ttagctcaaa ggctcaggtg 1260

ttcgaacatc ctcacattca agacgctgct tcgcaacttc ctgatgatga gagtttattt 1320

tttggtgata ctgggctatc caaaaatcca atcgagcttg tagaaggttg gttcagtagt 1380

tggaaaagct ctattgcctc ttttttcttt atcatagggt taatcattgg actattcttg 1440

gttctccgag ttggtatcca tctttgcatt aaattaaagc acaccaagaa aagacagatt 1500

tatacagaca tagagatgaa ccgacttgga aagtaa 1536

<210> 2

<211> 511

<212> PRT

<213> Vesicular stomatitis virus

<400> 2

Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys

1 5 10 15

Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn

20 25 30

Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp

35 40 45

His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Ile Gln Val Lys Met Pro Lys Ser

50 55 60

His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp Met Cys His Ala Ser Lys Trp

65 70 75 80

Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr Gly Pro Lys Tyr Ile Thr Gln

85 90 95

Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile

100 105 110

Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln

115 120 125

Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp Ala Glu Ala Val Ile Val Gln

130 135 140

Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val

145 150 155 160

Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr

165 170 175

Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu

180 185 190

Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn

210 215 220

Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys

225 230 235 240

Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser Gly Val Trp Phe Glu Met Ala

245 250 255

Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly

260 265 270

Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr Ser Val Asp Val Ser Leu Ile

275 280 285

Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp

290 295 300

Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr

305 310 315 320

Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn

325 330 335

Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala

340 345 350

Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr

355 360 365

Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile

370 375 380

Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu

385 390 395 400

Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp Ser Asp Leu His Leu Ser Ser

405 410 415

Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His Ile Gln Asp Ala Ala Ser Gln

420 425 430

Leu Pro Asp Asp Glu Ser Leu Phe Phe Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys

435 440 445

Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser

450 455 460

Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu

465 470 475 480

Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys

485 490 495

Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys

500 505 510

<210> 3

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VSV-G蛋白跨膜区

<400> 3

Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu

1 5 10 15

Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile

20 25

<210> 4

<211> 23

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> Syntaxin 1A蛋白跨膜区

<400> 4

Ile Met Ile Ile Ile Cys Cys Val Ile Leu Gly Ile Ile Ile Ala Ser

1 5 10 15

Thr Ile Gly Gly Ile Phe Gly

20

<210> 5

<211> 22

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VAMP2蛋白跨膜区

<400> 5

Met Met Ile Ile Leu Gly Val Ile Cys Ala Ile Ile Leu Ile Ile Ile

1 5 10 15

Ile Val Tyr Phe Ser Thr

20

<210> 6

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> HA蛋白跨膜区

<400> 6

Ile Leu Ser Ile Tyr Ser Thr Val Ala Ser Ser Leu Ala Leu Ala Ile

1 5 10 15

Met Val Ala Gly Leu Ser Leu Trp

20

<210> 7

<211> 21

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> VSV-G胞外近膜区

<400> 7

Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser

1 5 10 15

Ser Trp Lys Ser Ser

20

<210> 8

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 8

ttcagtagtt ggaaaagctc tatactgtct atttatttta tcatagggtt aatcatt 57

<210> 9

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 9

aatgattaac cctatgataa aataaataga cagtatagag cttttccaac tactgaa 57

<210> 10

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 10

agctctatac tgtctattta ttcaacagtg gcgagtatca ttggactatt cttggtt 57

<210> 11

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 11

aaccaagaat agtccaatga tactcgccac tgttgaataa atagacagta tagagct 57

<210> 12

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 12

tattcaacag tggcgagttc cctagcactg gcattggttc tccgagttgg t 51

<210> 13

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 13

accaactcgg agaaccaatg ccagtgctag ggaactcgcc actgttgaat a 51

<210> 14

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 14

agttccctag cactggcaat catggtagct ggtggtatcc atctttgcat t 51

<210> 15

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 15

aatgcaaaga tggataccac cagctaccat gattgccagt gctagggaac t 51

<210> 16

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 16

gcaatcatgg tagctggtct atctttatgg aaattaaagc acaccaag 48

<210> 17

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 17

cttggtgtgc tttaatttcc ataaagatag accagctacc atgattgc 48

<210> 18

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 18

ttcagtagtt ggaaaagctc tatcatgatc atcattttta tcatagggtt aatcatt 57

<210> 19

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 19

aatgattaac cctatgataa aaatgatgat catgatagag cttttccaac tactgaa 57

<210> 20

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 20

agctctatca tgatcatcat ttgctgtgtg attctgatca ttggactatt cttggtt 57

<210> 21

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 21

aaccaagaat agtccaatga tcagaatcac acagcaaatg atgatcatga tagagct 57

<210> 22

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 22

atttgctgtg tgattctggg catcatcatc gccttggttc tccgagttgg t 51

<210> 23

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 23

accaactcgg agaaccaagg cgatgatgat gcccagaatc acacagcaaa t 51

<210> 24

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 24

ctgggcatca tcatcgcctc caccatcggg ggcggtatcc atctttgcat t 51

<210> 25

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 25

aatgcaaaga tggataccgc ccccgatggt ggaggcgatg atgatgccca g 51

<210> 26

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 26

gcctccacca tcgggggcat ctttggaaaa ttaaagcaca ccaag 45

<210> 27

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 27

cttggtgtgc tttaattttc caaagatgcc cccgatggtg gaggc 45

<210> 28

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 28

ttcagtagtt ggaaaagctc tatgatgatc atcttgttta tcatagggtt aatcatt 57

<210> 29

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 29

aatgattaac cctatgataa acaagatgat catcatagag cttttccaac tactgaa 57

<210> 30

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 30

agctctatga tgatcatctt gggagtgatc tgcgccatca ttggactatt cttggtt 57

<210> 31

<211> 57

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 31

aaccaagaat agtccaatga tggcgcagat cactcccaag atgatcatca tagagct 57

<210> 32

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 32

gtgatctgcg ccatcattct catcatcttg gttctccgag ttggt 45

<210> 33

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 33

accaactcgg agaaccaaga tgatgagaat gatggcgcag atcac 45

<210> 34

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 34

gccatcattc tcatcatcat catcgtttac ttcggtatcc atctttgcat t 51

<210> 35

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 35

aatgcaaaga tggataccga agtaaacgat gatgatgatg agaatgatgg c 51

<210> 36

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 36

atcatcatcg tttacttcag cactaaatta aagcacacca ag 42

<210> 37

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 37

cttggtgtgc tttaatttag tgctgaagta aacgatgatg at 42

<210> 38

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 38

gaaggttggt tcagtagcag ttggaaaagc tct 33

<210> 39

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 39

agagcttttc caactgctac tgaaccaacc ttc 33

<210> 40

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 40

gtagaaggtt ggttcagtgg aagcagttgg aaaagctcta tt 42

<210> 41

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 41

aatagagctt ttccaactgc ttccactgaa ccaaccttct ac 42

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 42

gtagaaggtt ggttcagtgg aggaagcagt tggaaaagct ctatt 45

<210> 43

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 43

aatagagctt ttccaactgc ttcctccact gaaccaacct tctac 45

<210> 44

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 44

ttcagtggag gaagcggaag ttggaaaagc tctat 35

<210> 45

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 45

atagagcttt tccaacttcc gcttcctcca ctgaa 35

<210> 46

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 46

tggttcagtg gaggaagcgg aggaagttgg aaaagctcta tt 42

<210> 47

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 47

aatagagctt ttccaacttc ctccgcttcc tccactgaac ca 42

<210> 48

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 48

tggttcagtg gaggaagcgg aggaagcagt tggaaaagct ctatt 45

<210> 49

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 引物

<400> 49

aatagagctt ttccaactgc ttcctccgct tcctccactg aacca 45