阅读说明：本技术 用于确定抗cd26配体的生物活性的定量细胞方法 (Quantitative cellular method for determining biological activity of anti-CD 26 ligand ) 是由 A·F·迪纳罗 于 2018-12-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及定量细胞方法,其用于体外确定抗CD26配体(优选抗CD26单克隆抗体(例如,倍格罗单抗)的作用。(The present invention relates to a quantitative cellular method for determining the effect of an anti-CD 26 ligand, preferably an anti-CD 26 monoclonal antibody (e.g., gemuzumab), in vitro.)

用于确定抗CD26配体的生物活性的定量细胞方法

技术领域

本发明涉及定量细胞方法，其用于体外确定抗CD26配体(优选抗CD26单克隆抗体(例如，倍格罗单抗(begelomab))的作用。

背景技术

CD26是在细胞表面和以可溶性形式表达的110kDa多功能糖蛋白。CD26抗原由各种组织和器官(例如，肺、内皮、心脏、脑、肝脏、肠、肾脏、胎盘、胰腺和骨骼肌)表达(AbbottC.A.等人,1994)。在细胞水平上，已发现CD26的表达在淋巴细胞群中(特别是在活化的T淋巴细胞中，在静息T淋巴细胞中和B淋巴细胞上)具有强的共刺激活性(Cordero OJ等人,2007)。实际上，在记忆T细胞的特定子集上，CD26的表达在T细胞自身活化后增加(MorimotoC.等人,1989)。T细胞上CD26的表达与这些细胞产生大量IL-2并响应促有丝分裂刺激而强烈增殖的能力有关。但是，CD26的表达与T辅助淋巴细胞的活性呈负相关(Mattern T.等人,1991)。

CD26的特征在于二肽基肽酶IV(DPP-IV)酶促活性。上述酶促活性特异性地促进在X-Pro位置的N末端氨基酸和相邻氨基酸之间的肽键的水解(Gorrel M.D.等人,2001)。CD26属于寡肽酶的一个子集，其能够从许多生物活性底物(例如，细胞因子、多肽、激素和趋化因子)中切割N末端二肽(De Meester I.等人,1999；Hildebrandt M.等人,2000)。

在人类中，CD26也参与与腺苷脱氨酶(ADA)的结合(Franco R.等人,1998)。ADA缺乏不仅通过免疫失调的一般机制而且通过嘌呤代谢的毒性代谢物的细胞内积累而易患免疫缺陷疾病(Sauer A.V.等人,2012)。

CD26与ADA之间的联系的可能作用实际上是调节局部细胞外腺苷浓度，其通过细胞表面的腺苷受体在T细胞内产生负信号。一些对CD26特异性的单克隆抗体在体外能够将活化信号传递给T细胞并调节免疫反应(Morimoto C.和Schlossman S.F等人,1998)。因此，CD26与炎症、免疫内分泌和神经功能的调节以及AIDS的病理生理学有关。

由于CD26无所不在的分布，许多病理状态与CD26的表达和/或活性改变相关，而CD26的表达和/或活性改变与相应病理状况的严重程度有关。这些疾病可以分为至少五类：自身免疫和炎性疾病、恶性血液肿瘤、精神神经内分泌病症、传染性疾病和实体肿瘤。许多研究人员已观察到，在各种免疫介导的疾病中，CD26的血清酶促活性水平似乎有所改变(Klemann C.等人,2016)。在临床研究中，已经观察到CD26的表达/活性的变化涉及各种自身免疫疾病，例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、I型糖尿病和宿主中的移植排斥疾病(GvHD)。

施用高选择性CD26抑制剂的多个研究显示糖尿病的发病延迟、胰岛炎减少、调节性T细胞数量增加，提示CD26在免疫调节中的重要作用。

关于罹患类风湿性关节炎的患者的一些报道显示CD26表达/酶促活性、疾病的严重程度和治疗之间的相关性。这些发现可为旨在抑制CD26酶促活性的新的治疗方法铺平道路。此外，已经发现罹患多发性硬化的患者的血液和脑脊液中的T细胞表面上的CD26表达更高(Ohnuma K.等人,2011)。GvHD是造血干细胞移植(HSCT)后的主要并发症，HSCT是许多血液疾病的重要疗法(Ferrara J.L.M.等人,2009)。GvHD能够基于发病时间分为急性或慢性，并且是由移植源自供体骨髓的幼稚T细胞引起的，其损伤受体的组织(Henden A.S.,HillG.R.,2015)。GvHD代表了对骨髓移植作为一种挽救生命的疗法的用途的严格限制(WelniakL.A.等人,2007)。

GvHD的发展通常需要三个条件：(1)供体的骨髓必须含有免疫活性细胞，(2)受体必须表达供体中不存在的组织抗原，并且(3)受体不应该能够引发会破坏移植细胞的有效反应。

GvHD的特征在于3个不同的阶段：1)在第一阶段，由于放射治疗和化学治疗，在宿主中组织受到损伤，释放促炎性细胞因子，例如，TNF-α和IFN-γ；2)在第二个活化阶段，供体的同种异体反应性T细胞被呈递受体抗原的细胞(APC)暴露的抗原活化，3)最后，细胞增殖随着由细胞毒性T细胞和效应T细胞两者产生的细胞因子的进一步分泌而发生(FerraraJ.L.M.等人,2009)。

急性GvHD(aGvHD)的病理学、严重程度和器官特异性由不同T淋巴细胞亚群Th1、Th2和Th17之间的平衡决定。实际上，已经显示，Th1亚型相对于其他亚型的流行取决于供体T细胞活化时的细胞因子环境、接着与宿主的APC细胞的相互作用以及它们随后分化为辅助性T细胞。

主要的Th1细胞因子是IFN-γ、IL-2和TNFα。由于Th1细胞因子(例如，TNF和IFN-γ)诱导能够促进炎性反应的趋化因子和受体上调的能力，Th1细胞因子(例如，TNF和IFN-γ)的量增加与疾病的更早和更严重发病有关。Th2细胞因子是IL-4、IL-5、IL-10和IL-13。已经观察到Th2细胞对反应的阻断与胃肠道症状的增加以及肝脏和皮肤损伤水平的降低有关。IL-6是一种促炎性细胞因子，其控制Th17细胞和调节性T细胞之间的平衡。IL-6抑制可能是通过诱导免疫耐受来降低HCT中aGvHD严重程度的潜在有效策略(Henden A.S.,HillG.R.,2015)。

因此，阐明CD26在T细胞反应和细胞因子水平改变中的作用无疑将有助于了解GvHD的发病现象和进展(Henden A.S.,Hill G.R.,2015；Yi T.2009)。

基于这个前提，一种预防GvHD发病的新的治疗方法基于使用抗CD26单克隆抗体(Hatano R.,2013；Bacigalupo A.,2016)。最近在临床前模型中开发了抗CD26抗体以预防疾病动物模型中GvHD的发病。尽管应该进一步研究CD26/DPPIV在GvHD中的作用，但已经报道用抗人CD26的小鼠抗体(即倍格罗单抗)的治疗在罹患急性类固醇耐药性GvHD的患者中有效治疗GvHD(美国专利9376498)。因此，临床数据证实，通过单克隆抗体使CD26失活代表了一种有效的治疗方法，其用于根除自身反应性T细胞亚群，从而解决GVHD。

鉴于上述，CD26受体在新的治疗方法中作为分子靶标的重要性是显而易见的。

效力测试提供特定药物的生物活性的定量测量，并代表药理学分子开发过程中的关键质量参数。

能够使用各种方法来开发效力测试，包括配体-受体测定、动物测定、体外细胞测定或其他生物化学测定(例如，酶测定)。如果效力测试再现特定药物的作用机制，则它是特别相关的。

对于生物产品，优选使用配体-受体测定或体外细胞实验。前者因为它能够提供药物对其分子靶标的亲和力的直接测量，也能够适用于效力测试。

但是，使用这些类型的测定并不总是可能的，仅仅因为效力测试应基于药物的作用机制开发，但是这一信息并不总是可获得的，尤其是对于单克隆抗体。这种方法特别复杂，因为生物药物通常在体内具有多种作用机制，如此以致在体外系统中特别难再现。

本发明的作者现已发现，抗CD26单克隆抗体(倍格罗单抗)能够在特异性结合后以称为“封端”的作用机制诱导CD26受体的内化。内化现象导致抑制促炎性细胞因子(在炎症过程中起关键作用)的释放，这是由抗CD26配体诱导的直接下游功能事件。因此，描述的作用机制支持单克隆抗体在所有自身免疫疾病中的所有应用，其中必须使自身反应性T淋巴细胞失活的同时保持它们的免疫活性。

因此，由于药物产品的效力测试是为了以功能方式确定样品中活性化合物的量而产生的，CD26的内化和对炎性细胞因子分泌的抑制两者都代表了一种新的能够用于评估任何抗CD26配体的效力的测试，优选开发用于治疗和/或诊断应用的单克隆抗体。

基于倍格罗单抗作用机制的革命性发现，能够应用所描述的方法以评估任何抗CD26的效力。此外，这一方法的使用允许获得CD26的内化和对细胞因子的分泌/产生的抑制两者的定量测量。

总之，这些发现允许在1)再现性，2)易于定量特定样品中抗CD26配体的活性，以及3)定量测量抗CD26配体(无论是已知的倍格罗单抗还是新鉴定的)的活性方面制备极其有利的效力测试。

发明内容

因此，本发明涉及体外测定抗CD26配体效力的方法，其包括以下步骤：

a)将以高于75％的百分比表达CD26受体的人T淋巴细胞群与浓度在0.001μg/ml至150μg/ml范围内(优选0.01μg/ml至100μg/ml，更优选0.01μg/ml至2μg/ml，甚至更优选0.01μg/ml至0.5μg/ml)的抗CD26配体在37℃下孵育；

b)与用荧光染料标记的抗CD26抗体孵育，所述抗体识别CD26受体上与步骤a)的抗CD26配体识别的表位不同的表位；

c)通过细胞荧光分析确定用抗CD26配体处理的细胞样品测量的CD26的MFI值(荧光强度中值)(MFI_T)和未处理的细胞的MFI值(MFI_NT)；

d)以RFI(相对荧光强度，即相对于基底归一化的MFI值)评估CD26受体的内化百分比，根据下式计算RFI：用抗CD26配体处理的细胞样品测量的CD26的MFI值(MFI_T)与未处理的细胞的MFI值(MFI_NT)之间的比率，乘以100，并且从100中减去：

其中“％int CD26”或RFI是CD26的内化百分比，“MFI_T”是用CD26配体处理的细胞(测试细胞)的MFI值，以及“MFI_NT”是未用CD26配体处理的细胞(参考细胞)的MFI值。

这样的百分比(％int CD26或RFI)：

-如果小于20％，表明抗CD26配体的低效力；

-如果在20％至30％范围内，表明抗CD26配体的中等效力；

-如果高于30％，表明抗CD26配体的高效力。

在图12的小图A中，指出了用于分别指定“低”、“中等”和“高”效力标准的合理性。特别地，观察到以CD26内化％表示的反应是剂量依赖性的S形状(S形)，其中在较低配体浓度(在这个图中表示为“RS”)时，它具有较低的“％int CD26”值，并且反之亦然，在较大配体浓度时，它具有较大的“％int CD26”值，直到最大值(平稳值)为30％-35％。如果这个平稳值被视为“％int CD26”的100％，则可对曲线的所有值进行归一化，如图12小图B中所示。

从这个意义上说，观察到从0％开始到100％内化的曲线，并因此可定义三种不同的效力范围：

1.“低”，这是指相对于所述平稳值，配体具有0％至50％的内化百分比，

2.“中等”，这是指相对于所述平稳值，配体具有50％至90％的内化百分比，

3.“高”，这是指相对于所述平稳值，配体具有高于90％的内化百分比。

换言之，这个概念可以总结在下表1中：

表1

效力	RFI	％平稳值
			低	0％-20％	0％-50％
中等	20％-30％	50％-90％
			高	>30％	90％-100％

在本发明的一个替代实施方案中，步骤a)的人淋巴细胞群能够在室温下孵育。

所述抗CD26配体是能够特异性结合CD26受体的任何分子，优选抗CD26单克隆抗体或其片段，更优选倍格罗单抗。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤a)中所述抗CD26配体的浓度为0.001μg/ml、0.01μg/ml、0.5μg/ml或2μg/ml。

在本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤b)中所述抗CD26抗体是小鼠抗人CD26 APC荧光染料缀合的类型(BD Pharmingen；目录号：563670，克隆号：M-A261)，并且以2.5μg/ml的浓度孵育。

根据本发明的方法的另一个优选实施方案，步骤b)中使用的荧光染料是能够用于细胞荧光分析的任何荧光染料，其选自由下列各项组成的组：FITC、APC、PE、PE-Cy7、APC-H7、PerCP和PE-Cy5.5。所述荧光染料优选为APC。

同样，根据本发明的方法的一个优选实施方案，步骤a)中所述CD26+T淋巴细胞群选自原代T淋巴细胞群和人T淋巴细胞的肿瘤细胞系。优选地，所述人T淋巴细胞的肿瘤细胞系是Karpas 299细胞系。

在根据本发明的方法的一个优选实施方案中，步骤c)中所述细胞荧光分析是通过FACS进行的。

根据本发明的方法还提供了对步骤a)中所述CD26+人T淋巴细胞群进行的抗CD26配体效力的进一步验证步骤，其提供了上述配体对细胞因子释放的抑制测试，所述细胞因子选自由下列各项组成的组：IL-8、IL-1β、IL-6、IL-2、GM-CSF、IL-6和TNF-α。在一个优选实施方案中，所述细胞因子是IL-8和/或IL-1β。步骤a)中所述CD26+人T淋巴细胞群选自原代T淋巴细胞群和人T淋巴细胞的肿瘤细胞系。优选地，所述人T淋巴细胞的肿瘤细胞系是Karpas 299细胞系。

在一个优选的实施方案中，所述细胞因子产生的抑制测试通过MesoScaleDiscovery(MSD)测定进行。

附图说明

现在将根据具体参考附图的优选实施方案，出于说明性和非限制性的目的描述本发明，其中：

-图1显示了用MSD测定分析促炎性细胞因子水平的细胞培养实验方案。

-图2显示了外周血原单核细胞和经纯化的CD4+T细胞(A)和人T细胞系Karpas 299(B)中CD4+细胞(深色柱)和CD26+细胞(浅色柱)的百分比的细胞荧光分析。

-图3显示了在Karpas 299细胞中孵育8小时后(小图A)以及在原代CD3+、CD4+、CD8+T细胞中4℃和37℃下孵育6小时和24小时后(小图B、C、D)倍格罗单抗对CD26受体内化的影响。

-图4显示了在T细胞系Karpas 299(小图A)和在原代T细胞(小图B)中由倍格罗单抗诱导的细胞因子IL-2、IL-8、IL-1β、GM-CSF、IL-6和TNF-α水平的抑制。在该图中，在纵坐标轴的左侧指示电化学发光信号，而在横坐标轴上指示相应的浓度。

-图5显示了在Karpas 299细胞中用倍格罗单抗处理24小时后与CD26相关的荧光减少。

-图6显示了从0.0005μg/mL(3x10^-12M)的低剂量开始直至较高浓度的等于150μg/mL(1x10^-6M)的倍格罗单抗处理后，在Karpas 299细胞中24小时后与CD26相关的荧光减少。

-图7显示了通过对在不同温度条件下储存的倍格罗单抗样品进行的FACS分析获得的CD26的剂量-反应内化曲线(RFI)(SVI-STB是效力降低的样品，即样品在32.5℃的加速稳定条件下放置6个月)。

-图8显示了通过在不同细胞荧光计上进行的FACS分析获得的CD26内化曲线(RFI)。

-图9显示了相对于倍格罗单抗(WS-BEG-013)观察到的小鼠单克隆抗hCD26抗体(克隆202.36)的相对效力。

-图10显示了相对于倍格罗单抗(WS-BEG-013)观察到的IgG2b小鼠抗体K同种型(克隆MG2b-57)的相对效力。

-图11显示了相对于参考标准品RS(倍格罗单抗)计算的测试样品(TEST)的效力值，以证明如何相对于参考标准品(RS)定量测量命名为TEST的任何未知样品的相对活性。

-图12显示了用于确定低、中等或高效力的标准的两个示例性图。

具体实施方式

为了更好地说明本发明，现在提供以下实施例，其应被认为是说明性的和非限制性的。

实施例1：单克隆抗体倍格罗单抗的作用机制研究

研究了倍格罗单抗(抗CD26)的作用机制，以产生一种用于体外评估抗体有效性的测试。

这一测试(称为效力测试)的开发对于测量给定药物的生物活性非常重要，因为该活性是作为批次释放测试的质量控制范围内的早期开发、高级开发和销售阶段期间的分子质量控制的重要组成部分。

具体地，许多生物产品(例如，单克隆抗体)通过结合至细胞靶标或可溶性靶标、随后引发分子靶标下游的适当细胞事件而发挥它们的功能。

因此，评估了以下：

·CD26在人T细胞系和人原代T细胞中的表达/过表达。

·与倍格罗单抗结合后CD26的内化。

·倍格罗单抗对炎性细胞因子产生和释放的影响。

材料和方法

原代细胞和细胞系

人T细胞系源自购自SIGMA(目录号06072604-1VL)的Karpas 299淋巴瘤T细胞。Karpas 299细胞在具有GlutaMAX(Gibco，目录号#72400)的补充有10％热灭活的胎牛血清(Sigma，目录号#F2442，在实验室中进行热灭活)、1IU/ml青霉素/链霉素(Gibco，目录号#15140)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco，目录号#2503)和50μMβ-巯基乙醇(Sigma-Aldrich，目录号#M3148)的RPMI1640中培养。解冻后，将细胞扩增并冷冻保存。

分析细胞系以评估支原体的存在(MycoAlert^TM，Lonza，目录号#LT-07)，发现对后者是阴性的。根据San Raffaele伦理委员会(IRB)批准的实验方案，通过Ficoll-Hypaque分离梯度(Lymphoprep,Fresenius)，从知情同意后获得的三名健康供体的血沉棕黄层中分离外周血单核细胞(PBMC)。为了评估细胞活力，将PBMC用台盼蓝染色并在Burker's室中计数。将PBMC在具有低剂量IL-2(50IU/mL)和IL-7(5μg/mL)的完全培养基(RPMI 10％FBS+1％PenStrep和谷氨酰胺)中在37℃下培养过夜(o/n)，然后开始实验。

为了确定CD26在人原代CD4+T细胞和T细胞系的细胞表面上的表达，购买了抗体α-CD26-FITC克隆BA5b(Biolegend,目录号#302704)。为了确定用于细胞荧光法的最佳浓度，在稀释范围内，在三个供体的原代T细胞和在Karpas 299细胞上测试了所述抗体。所述最佳浓度将用于确定人原代CD4+T细胞和T细胞系上CD26表达的百分比，以及用于CD26的内化分析。

CD26在T细胞系和人原代CD4+T细胞中的表达

将来自两个供体的原代CD4+细胞和Karpas 299细胞在添加有0.2％BSA(Miltenyi，目录号#130-091-376)的autoMACS缓冲液(Miltenyi，目录号#130-091-222)中以100000个细胞/孔的密度接种在96孔V-底板(Costar,目录号#3598)中。将细胞在浓度范围为2.5μg/ml至31.3ng/ml的α-CD26-FITC或α-IgG2a-FITC(Biolegend,目录号#400208)中孵育15分钟。随后洗涤细胞并在4％甲醛中固定。使用FACSCanto II，通过细胞荧光法确定阳性CD26细胞的百分比。IgG-FITC用于确定非特异性结合。

定量人原代细胞和T细胞系上CD26的表达

细胞荧光法用于确定在原代外周血单核细胞(PBMC)和CD4+T细胞以及在Karpas299细胞系的细胞膜上表达的CD26的量。添加CD4+标记作为T细胞标记物。将来自三个供体的原代CD4+T细胞和Karpas 299细胞在MACS缓冲液中以密度为100000个细胞/孔接种在96孔V-底板中。将细胞与10μg/ml的α-CD26-FITC和2.5μg/ml的α-CD4孵育15分钟。添加10μg/ml的α-IgG2a-FITC和2.5μg/ml的α-IgG2b-APC(Biolegend,目录号400612)以允许门控。随后洗涤细胞并在4％甲醛中固定。使用FACSCanto II通过细胞荧光法确定CD4+和CD26+细胞的百分比。

CD26的内化测定

通过细胞荧光分析确定倍格罗单抗在T细胞中(在人原代T细胞和T细胞系两者中)诱导CD26受体内化的能力。该测定在两个独立的实验中进行。每个实验从三份(3)血沉棕黄层中分离CD4+T细胞。随后，将PBMC和分离的细胞两者用抗CD4和抗CD26抗体标记，以确定分离的细胞群的纯度以及实验前CD26细胞的百分比。另外，添加活力染料以确保实验在活细胞上进行。通过细胞荧光法分析细胞。

因为发现CD4+群的纯度>95％，评估CD4+细胞的质量良好；在CD4+群中CD26+细胞的百分比>75％。将T细胞系以100000个细胞/孔接种在包被有2μg/ml的抗CD3/抗CD28(eBioscience，目录号分别为#16-0037-85和16-0289-85)的96孔平底板(Corning Costar，目录号#3598)中整晚(过夜)，并在37℃下孵育2小时。在过夜孵育后，更换培养基并将所述细胞与0.03mg/ml(2x10^-7M)的倍格罗单抗孵育，IgG2b(Sigma-Aldrich，目录号#SAB4700729或Biolegend，目录号#401202)作为对照或PBS(Gibco，目录号#10010)作为对照载料，总体积为100μl。每种条件一式三份(三个细胞孔/条件)进行测试。该处理在4℃和37℃下进行8小时。随后标记细胞，并通过细胞荧光法确定CD4+细胞中CD26+细胞的百分比。另外，在处理开始之前标记并分析一组细胞以确定在时刻零的CD4+CD26+细胞的百分比。在实验当天，通过以1500rpm离心5分钟分离PBMC，并分别与不同浓度的倍格罗单抗孵育6小时和24小时。与倍格罗单抗孵育后，洗涤PBMC，并用以下单克隆抗体标记：与FITC-、PE-、APC、APC-H7-缀合的针对CD3、CD4、CD8和CD26的人抗体(Biolegend)。先前已显示，针对CD26的单克隆抗体能够结合与倍格罗单抗不同的表位。与荧光团缀合的针对对应于倍格罗单抗(IgG2b)的同种型的抗体总是用作阴性对照。使用FACS Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)分析样品。用Flow Jo软件(Tree Star Inc.)分析所有数据，并表示为CD4+或CD8+细胞的相对荧光强度(RFI)。通过将用抗CD26标记的样品的平均荧光强度除以相应的同种型对照来计算该值。

用于促炎性细胞因子的9重MSD测定

为了评估倍格罗单抗在T细胞活化中的作用，评估了促炎性细胞因子的产生。

为了这个目的，使用MesoScale Discovery(MSD)测定，即用于人促炎性细胞因子的9重测定(目录号#15007B-2)。如上面所描述的(4.1.1.2节)，将原代T细胞和Karpas 299T细胞系两者以100000个细胞/孔接种在用抗CD3/抗CD28包被的96孔平底板中，并孵育过夜。

将细胞保持在具有GlutaMAX的补充有10％HI-FBS、1％青霉素/链霉素、2mM L-谷氨酰胺和50μMβ-巯基乙醇的RPMI 1640培养基中。如图1所描述的，用IL-12和倍格罗单抗处理细胞。简而言之，将细胞与20ng/ml di IL-12(R&D systems，目录号#219-IL-0059)和对照载料(0.1％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，目录号#A2153-1kg)-PBS)预孵育过夜或在没有IL-12/对照载料的情况下孵育过夜。第二天，将没有与IL-12过夜预孵育的细胞与20ng/ml的IL-12孵育2小时。随后将所有细胞与0.03mg/ml(2x10^-7M)的IgG2b(Biolegend)、倍格罗单抗或PBS对照载料孵育6小时或24小时。在所有实验中，在预期的时间段后收集上清液并在-80℃下冷冻直至进行新的分析。

为了测试用抗CD3和抗CD28“包被”对细胞因子分泌的影响，在包被和未包被的板上测试细胞，并用IL-12预孵育过夜，以及随后用倍格罗单抗/IgG2b/PBS处理24小时。

细胞因子MSD分析检测白介素2(IL-2)、IL-8、IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-12p70的水平。按照制造商的说明书进行MSD细胞因子测定，实际上将板在4℃封闭过夜而不是在室温下封闭1小时，以防止潜在的非特异性结合。使用在实验的细胞阶段期间采用的培养基制备标准化曲线。MSD Discovery Workbench 4.0.12软件用于生成标准化曲线和计算细胞因子浓度(pg/ml)。将样品的值输入标准化曲线以确定它们是否在其范围内。用GraphPad Prism6制备所有细胞因子的图。最初，倍格罗单抗比IgG2b对照高两倍的抑制被任意设置为阈值水平用于进行统计学分析。

但是，因为各种条件均显示1.9倍的抑制，这个阈值转为1.9。为了评估统计学显著差异，在处理条件内，将双向ANOVA检验与Graph Pad Prism 6.0中的post-hoc Turkey检验一起使用，获得在多次测试中调整的p值。

结果

CD26在人T细胞系和人原代T细胞中的表达/过表达

图2显示了在源自外周血的单核原代细胞群中、在纯化的CD4+T细胞和在Karpas299系中CD4+和CD26+细胞的百分比。通过细胞荧光法获得的结果显示，原代单核细胞中CD4+和CD26+细胞的百分比分别为约>45％和>35％，分离CD4+T细胞后，这些百分比分别变为>95％和>75％(图2，小图A)。几乎所有的Karpas 299细胞都表达CD4(>95％)以及高水平的CD26(>95％)(图2，小图B)。总之，在分离的原代CD4+T群内和在Karpas 299细胞系中，CD26阳性细胞的百分比分别为约75％和95％。上述百分比也足以在随后的实验步骤中测量CD26水平的变化。

CD26的内化

细胞荧光分析用于确定在原代T细胞和T细胞系中倍格罗单抗诱导的CD26的内化。同样的分析还用于确定CD26存在的减少与倍格罗单抗浓度之间的剂量依赖性关系。在Karpas 299T细胞系中，确定了CD26+细胞的百分比以及CD4+群中CD26+的平均荧光强度(MFI)。在T Karpas 299细胞系中，仅在37℃下，8小时后观察到CD4+群中CD26 MFI的降低(分别为4小时后抑制7％-图中未报告数据-以及8小时后抑制22.3％)(图3，小图A)。相对于在4℃(即当所有生物过程均受低温抑制)下进行的孵育，在37℃下与倍格罗单抗孵育8小时后测量的CD4+群中CD26的MFI的这种降低在统计学上是显著的。获得的数据表明，在37℃下，在与倍格罗单抗结合后，Karpas 299细胞中每个单细胞的CD26受体数量减少。由于在4℃下未观察到相同的生物学现象，因此能够得出结论，与倍格罗单抗结合后CD26受体的内化代表在Karpas 299T细胞系中抗体的作用机制。为了确保通过与倍格罗单抗结合诱导的Karpas 299细胞中CD26受体的内化可以用作用于临床开发的批次释放的效力测试，进行了剂量-反应实验。在上述实验中，用增加浓度的倍格罗单抗在37度下处理Karpas 299细胞24小时，并且具体是0.5μg/ml(3x10^-9M)、5μg/ml(3x10^-8M)和30μg/ml(2x10^-7M)(图5)。所获得的结果是非常有趣的，因为已经发现，增加浓度的抗CD26能够诱导膜中表达的CD26的内化逐渐增加。特别地，0.5μg/ml、5μg/ml和30μg/ml的倍格罗单抗的剂量(分别为3x10^-9M、3x10^-8M和2x10^-7M)对应于26.9％、34.5％和43.8％的内化百分比。这种剂量-反应作用是开发效力测试的必要条件。

为了评估倍格罗单抗对原代T细胞的作用，将源自外周血的单核细胞与倍格罗单抗在三种不同条件(6μg/ml；30μg/ml和150μg/ml，分别为4x10^-8M、2x10^-7M和1x10^-6M)下在37℃孵育6小时和24小时。孵育后，立即标记细胞以评估它们的CD26表达。作为对照，将单核细胞与最高浓度的倍格罗单抗(150μg/ml，即1x10^-6M)在4℃下孵育。6小时后，观察到与CD3+、CD4+和CD8+T细胞中CD26的基线水平相比，CD26的内化水平(RFI)明显降低(尽管不显著)(图3，小图B)。但是，在24小时时获得了统计学显著的结果(*，P<0.05)，特别是对于CD8+T细胞(图3，小图C)。如先前对Karpas 299细胞系所观察到的，当单核细胞与倍格罗单抗在4℃下孵育时，CD26下调的作用降低(图3，小图D)，表明一种抗体-CD26复合物内化的主动阻断现象。简而言之，与倍格罗单抗孵育24小时后，当用浓度为30μg/ml(2x10^-7M)倍格罗单抗处理时，在Karpas 299细胞中CD26的表达降低至43.8％，并且这种现象取决于抗CD26的剂量(图5)。如所预期的，在4℃下，在所分析的细胞表面上未观察到CD26表达的变化。所获得的结果清楚地表明，响应于与倍格罗单抗的结合，CD26受体被内化，从而消除了CD26+T细胞亚群的关键活化信号。

促炎性细胞因子的释放

考虑到CD26的内化可能对T细胞活化具有各种下游影响，在原代T细胞和Karpas299细胞中用倍格罗单抗处理后，评估了一些促炎性细胞因子的水平。

炎性细胞因子能够分为两组：组1)参与急性炎症；组2)负责慢性炎症。诸如IL-1、TNF-α、IL-6、IL-11、IL-8的细胞因子和其他趋化因子G-CSF和GM-CSF属于第一组。第二组能够被进一步分为介导体液反应的细胞因子(例如，IL-4、IL-5、IL-6、IL-7和IL-13)以及介导细胞反应的这些细胞因子(例如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12、干扰素、转化生长因子β和肿瘤坏死因子α和β)(Shaikh PZ，2011)。

促炎性细胞因子是参与一系列自身免疫疾病(例如，类风湿性关节炎、多发性硬化、GvHD)的分子。在这些疾病的发病机理中，CD26特别在炎症过程中发挥关键作用。出于这个原因，评估了倍格罗单抗对一些促炎性细胞因子的抑制。更具体地说，分析了以下细胞因子的水平：白介素-2(IL-2)、IL-8、IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干扰素-γ(IFN-γ)、IL-6、IL-10、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和IL-12p70。上清液样品的一系列稀释液作为测定中的预测试进行，并且结果表明，对于所有细胞因子，未稀释的样品均在的标准化曲线范围内，除了在暴露于作为信号的IL-12的IL-12p70细胞的上清液中(未显示)。出于这个原因，在MSD测定中测试了25μl未稀释的标准品上清液。在两个实验中，所有测定板中的所有细胞因子的标准曲线均显示良好校准的曲线。

将要分析的样品插入标准图表中以确定它们是否在检测范围内。测量并分析除IL-12p70外的所有细胞因子的水平，尽管在原代T细胞供体和Karpas 299T细胞系之间观察到细胞因子水平的变化，但在某些条件下水平低于检测极限。在两个实验中分析的所有细胞群中，IL-1β和IL-6水平都非常低。如先前在文献中报道的(Vacaflores A.等人,2016)，用IL-12处理细胞在多种条件下明显诱导IL-1β、IFN-γ、IL-6和IL-10的产生。因此，用倍格罗单抗处理后观察到对细胞因子(IL-2、IL-8、IL-1β、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-6和肿瘤坏死因子α)产生的抑制(图4)。

在相同条件下，在Karpas 299细胞和原代T细胞两者中观察到与倍格罗单抗孵育后IL-8和IL-1β水平强烈降低。

下表2提供了在原代T细胞和Karpas 299细胞中倍格罗单抗在不同细胞因子分泌中的抑制作用的概况，特别显示了在37℃下孵育细胞6小时或24小时后由倍格罗单抗诱导的促炎性细胞因子水平的抑制。

表2

-：无抑制

+：有抑制

此外，为了测试“包被”对细胞因子分泌的影响，在用抗CD3/抗CD28包被和未包被的板上测试细胞，并用IL-12、倍格罗单抗或合适的对照载料处理，如“材料和方法”一节所描述的。通常，相对于包被的板，观察到在未包被的板中细胞因子水平是不可检测的或被证明是较低的。这表明包被对于创建用于研究倍格罗单抗在评估细胞因子水平中的作用的测定窗口是必需的。因此，未进一步分析倍格罗单抗对使用未包被的板测量细胞因子水平的影响。在这个实验的基础上，所获得的结果显示，倍格罗单抗能够强烈减少原代T细胞和Karpas 299细胞两者中特定细胞因子(例如，IL-8、IL-1β和IL-6)的产生，突出抗CD26(倍格罗单抗)在治疗自身免疫疾病中的作用机制。

实施例2：用于确定抗CD26配体效力的细胞测定设置

本实验部分的目的是从已知的抗CD26单克隆抗体倍格罗单抗开始，建立抗CD26配体活性的细胞测定。

倍格罗单抗是由杂交瘤细胞产生的抗CD26单克隆抗体，其临床靶标是抑制在同种异体移植物中供体T淋巴细胞的活化。

该测定的目标是，在体外用增加浓度的倍格罗单抗处理人T淋巴细胞(Karpas299，CD4阳性)后，测量存在于人T淋巴细胞(Karpas 299，CD4阳性)的细胞膜上的CD26水平的变化。

CD26是一种参与T淋巴细胞活化的具有二肽基肽酶活性的膜糖蛋白。初步数据表明在24小时处理后倍格罗单抗诱导人T淋巴细胞和Karpas 299细胞表面上的CD26内化的能力。

具体地，将细胞与增加浓度的倍格罗单抗在37℃下孵育24小时，随后用能够分别结合CD4和CD26受体并与以不同波长发射的荧光团缀合的两种抗体染色。在FACS分析期间，对于每种测试的倍格罗单抗浓度，测量的荧光强度与每个单细胞的细胞表面上存在的CD26的量成比例。然后，用仪器通过计算在阳性CD4细胞群上选择的20000个单个荧光信号采集事件的中值来量化这个参数。

细胞样品的染色实验方案和FACS分析

在用倍格罗单抗预先建立的孵育时间到期后，根据以下染色实验方案，用与荧光团缀合的抗体处理细胞样品，然后通过FACS分析表面CD26的表达：

-将每个孔的内容物转移至1.5mL Eppendorf中；

-以10000rpm离心5分钟；

-用1mL冷DPBS洗涤沉淀物；

-以10000rpm离心5分钟；

-干燥沉淀物并根据用于FACS分析的孵育实验方案用以下抗体染色，如下表3所描述的。

表3

-涡旋振荡样品并在室温下在黑暗中孵育30分钟；

-添加1mL DPBS并以10000rpm离心5分钟；

-排出上清液并用1mL冷DPBS洗涤沉淀物1次(1X)；

-以10000rpm离心5分钟；

-将细胞沉淀物以0.7-1E6个细胞/mL的浓度重悬浮于DPBS-5％FBS中，并将样品在+4℃在黑暗中储存直至FACS读取。如果在白天不能进行读取，则添加多聚甲醛(终浓度为0.36％)固定所述细胞。

在FACS分析期间，对于测试的每种倍格罗单抗浓度，测量的荧光强度与每个单个CD4阳性细胞的细胞表面上存在的CD26的量相关。然后，通过仪器将这个参数量化为源自在CD4阳性细胞群内选择的20000个事件的荧光的采集的平均值。对于与FITC和APC相关的两种荧光的采集，不必进行补偿活动，因为两种荧光团以不同的波长发射。

随后使用BD FACS Diva程序对数据进行再处理，该程序允许将CD26的表达水平计算为采集期间记录的所有事件(在CD4阳性细胞群内选择的)的平均值。

结果

用诱导Karpas 299细胞的细胞膜表面上存在的CD26的内化的能力来测量倍格罗单抗的生物活性。

用增加浓度的倍格罗单抗处理后内化的CD26的量被测量为与表达在细胞膜表面的CD26结合的特异性抗体(APC小鼠抗人CD26，克隆M-A261 RUO BD Pharmigen编号563670)发射的荧光平均值的降低。

目的是生成每批产品的浓度-反应曲线，以通过批次与工作标准品(WS)的比较效力测试将其与用WS处理细胞而获得的浓度-反应曲线进行比较，其中所述曲线的平行度是测定适用性的前提(使用PLA.3分析软件进行的平行度测试)。

从图5的图中能够看出，用倍格罗单抗处理24小时后，对于Karpas299细胞，与CD26相关的荧光减少了大约40％。

此外，在Karpas 299细胞中的这种作用被证明是浓度反应，这一条件被认为对细胞测定的开发至关重要。

观察到的作用对倍格罗单抗是特异性的，因为IgG2b库(倍格罗单抗所属的IgG类)在测试的任何条件下均不会诱导CD26内化。

为了实现最佳生长条件用于评估生物学作用，决定通过重复与倍格罗单抗孵育24小时来进行，并用Dynabeads人T-激活剂CD3/CD28(Gibco试剂盒，Life Technologies，编号11131D)刺激后使用CD3+T淋巴细胞。

CD26内化百分比(％CD26内化)

从图6的图中可以看出，用倍格罗单抗处理24小时后，用最高浓度的倍格罗单抗(等于150μg/mL或1x10^-6M)处理后，对于Karpas 299细胞，与CD26相关的荧光减少了大约48％。

浓度-反应曲线的扩展允许达到较低的反应极限，该反应极限等于0.01μg/mL(7x10^-11M)。

证实了IgG2b库(用作阴性对照)缺乏作用。

设计后续测定以降低曲线的复杂性(以验证曲线是具有单相还是多相模式)。

不同倍格罗单抗样品的效力评估

然后，对三种倍格罗单抗样品进行效力评估，其中一种在32.5℃的加速稳定条件下储存6个月(SVI-STB制剂)。

从FACS分析来看，在CD26的内化动力学方面，批次1和批次2的两种独立制剂之间没有实质性差异。

相反，SVI-STB制剂(通过在32.5℃下孵育6个月而降解的倍格罗单抗样品)在诱导CD26内化方面似乎不如其他有效(图7)。该结果支持截取改变的倍格罗单抗样品的方法的能力。

从图7的图中能够看出，在4℃下储存的倍格罗单抗样品和长时间经历热偏移至32.5℃的倍格罗单抗样品的所选择的八种浓度的倍格罗单抗在曲线中心区域显示高变化性。

倍格罗单抗的两个均在4℃的最佳条件下储存的样品在曲线的中心区域没有显示变化性。

用不同的流式细胞仪评估效力

为了确保与抗C26孵育后获得的CD26内化结果也可以通过改变读取技术来再现，我们使用了两个不同制造商的细胞荧光计进行内化实验。

获得的结果(图8)清楚地表明属于不同细胞荧光计的技术不会改变内化曲线的结果。

具体地，在两个实验中，能够容易地识别在非最佳条件下保存的倍格罗单抗样品(SVI-STB)，与在最佳条件下储存的其他2种倍格罗单抗样品的曲线相比时，曲线中心部分显示高变化性。

结论

进行的实验测试表明，通过使用Karpas 299细胞系，基于倍格罗单抗诱导膜的CD26内化的细胞测定具有覆盖用于临床使用的药物的批次释放测试功能的所有特征。

特别地，基于在倍格罗单抗孵育后CD26的内化的测试允许以特异性且可再现的方式鉴别释放的用于临床使用的药物的特征的任何可能的偏差。

实施例3：用其他抗CD26抗体验证效力测定

用其他两种抗CD26抗体测试效力测定：

-小鼠抗hCD26-mAb，(克隆202.36)Thermo Fisher编号：MA1-35147；批号：311030F

-IgG2b，小鼠同种型K(克隆MG2b-57)，BioLegend编号：M1395，作为阴性对照。

为了检测膜中的CD26，使用与APC缀合的小鼠抗人CD26抗体(克隆M-A261)，BDPharmingen.编号：563670；Lotto：8116645。

图9和10显示了相对于倍格罗单抗(WS-BEG-013)观察到的相对效力。从所获得的结果，抗体克隆202.36显示大约0.01的相对效力，而抗体克隆MG2b-57显示完全没有活性。能够观察到，根据本发明的效力测试因此也适用于其他CD26配体。

再次在图9中，在将CD26的内化与参考化合物WS-BEG-013(2μg/mL)接近渐近线的浓度进行比较时，仅对WS-BEG-013观察到CD26的最大内化大于30％(32.5％)，而对于特异性测试的抗体克隆202.36远低于20％(11.5％)，根据声明的标准，确认它是一种低效力的抗体，即<20％(即<平稳值％的50％)。

图11显示了相对于参考标准品(RS)计算的测试样品(TEST)的效力值，以显示如何能与倍格罗单抗比较定量测量相对活性。在这种情况下，参考标准品(RS)是浓度为1.8mg/mL的倍格罗单抗，而测试样品(TEST)是浓度为1.26mg/mL的倍格罗单抗，即RS浓度的70％，预期的对RS的相对效力等于浓度比TEST/RS(例如，1,26/1.8＝0.7，即70％)。在图11中，表明了如何在70％的浓度比下观察到如预期的70％的相对效力(根据指南USP 1034“Analysis of Biological Assays”mediante软件PLA 3.0进行计算)。

在图11的图中，MFI值170代表膜CD26的最大表达值(最大水平渐近线)，而值110代表达到最大CD26内化的MFI值，因此该值对应于最小膜表达(最小水平渐近线)。在这个范围内，每个测定均以绝对值定义，通过测量测试曲线与倍格罗单抗参考曲线的相对距离来进行效力估计。

图中显示的直方图显示相对于其最大膜表达的CD26内化百分比，最大膜表达由测量的最大MFI值(170)表示。当涉及测试化合物时，该百分比与相对效力有关：

-在MFI值130处，与仅内化18.5％的测试样品比较，RS内化23.1％的膜中存在的CD26(测试/参考比＝0.80)；

-在MFI值110(膜CD26的最小存在)处，与仅内化9.9％的测试样品比较，RS内化12.1％的膜中存在的CD26(测试/参考比＝0.82)。

能够观察到，所述效力值不仅仅是在一个点的内化百分比，而是计算为两个EC₅₀之间的相对比率，对于参考样品和对于测试样品，EC₅₀分别为0.04342μg/mL和0.06644μg/mL。

实际上，在讨论的实施例中计算的效力能够估计为EC_50RS/EC_50Test，获得等于0.65的值，即能够确认该测试样品的效力是RS效力的大约70％。

此外，通过比较浓度接近达到RS的最小水平渐近线(2μg/mL)的CD26的内化，观察到RS(36％)和测试样品(35.9％)两者的CD26的最大内化都高于30％，根据声明的标准确认，在两种情况下它都是高效力，即>30％。

参考文献

-Abbott C.A.,Baker E.,Sutherland G.R.,McCaughan G.W.Immunogenetics1994 40:331–338.

-Cordero OJ,Yang CP,Bell EB.Immunobiology 2007,212:85–94.

-Morimoto C.,Torimoto Y.,Levinson G.,Rudd C.E.,Schrieber M.,DangN.H.,Letvin N.L.J.Immunol.1989,143:3430–3439.

-Mattern T.,Scholz W.,Feller A.C,Flad H.-D.,Ulme,A.J.Scand.J.Immunol.1991,33:737-48.

-Gorrel M.D.,Gysbers V.,Mccaughan G.W.Scand.J.Immunol.2001,54:249-264.

-De Meester I.,Korom S.,Van Damme J.,Scharpe′S.Immunol.Today 1999,20:367–375.

-Hildebrandt M.,Reutter W.,Arck P.,Rose M.,Klapp B.F.Clin.Sci.2000,99:93–104.

-Franco R.,Valenzuela A.,Lluis C.,Blanco J Immunol.Rev.1998,161:27–42.

-Sauer A.V.,Brigida I.,Carriglio N.,Aiuti A.Front Immunol.2012,3:265.

-Morimoto C.,Schlossman S.F.Immunol.Rev.1998,161:55–70.

-Klemann C.,Wagner L.,Stephan M.,von Horsten S.Clin Exp Immunol.2016,185(1):1-21.

-Ohnuma K.,Hosono O.,Dang NH.,Morimoto C.Adv Clin Chem.2011,53:51-84.

-Ferrara JLM,Levine JE,Reddy P and Holler E.Lancet 2009,373:1550-1561.

-Welniak LA,Blazar BR and Murphy WJ.Annu Rev Immunol2007,25:139-170.

-Henden A.S.,Hill G.R.J Immunol 2015；194:4604-4612.

-Yi T.,Chen Y.,Wang L.,Du G.,Huang D.,Zhao D.,Johnston H.,Young J.,Todorov I.,Umetsu D.T.,Chen L.,Iwakura Y.,Kandeel F.,Forman S.,ZengD.Blood.2009,114(14):3101-12.

-Hatano R.,Ohnuma K.,Yamamoto J.,Dang N.H.,Yamada T.,Morimoto C.Br JHaematol.2013,162(2):263-77.

-Bacigalupo A.,Deeg J.,Caballero D.,Gualandi F.,Raiola A.M.,VaraldoR.,Di Grazia C.,Van Lint M.T.Abstract 671.ASH会议2016年12月.

-Brevetto US 9,376,498.

-Shaikh P.Z.Int.J.of Pharm.&Life Sci.(IJPLS)2011,2(11):1247-1263.

-Vacaflores,A.,Chapman,N.M.,Harty,J.T.,Richer,M.J.,&Houtman,J.C.PLoSOne.2016,9；11(6):e0157175.

-Seidel U.J.E.,SchlegelP.,Lang P.Front Immunol.2013,4:76.