僵蚕水提物及其应用
阅读说明：本技术 僵蚕水提物及其应用 (Bombyx Batryticatus water extract and application thereof ) 是由 夏庆友 赵萍 孙悦婷 李晓鸿 于 2020-06-08 设计创作，主要内容包括：本发明公开了僵蚕水提物及其应用,通过以水作为提取溶剂提取制得,提取得到的产物具有安全性好,具有较好的自由基清除活性,同时具有酪氨酸酶抑制活性,可以降低LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的水平和表达量,同时降低炎性介质COX-2的表达量,具有较好的抗炎的潜力,因此可以作为化妆品原料在抗氧化、美白、抗炎等方面应用,对拓僵蚕的使用价值具有重要意义。(The invention discloses a stiff silkworm aqueous extract and application thereof, wherein the stiff silkworm aqueous extract is prepared by extracting with water as an extraction solvent, and the extracted product has high safety, high free radical scavenging activity and tyrosinase inhibitory activity, can reduce the levels and expression levels of TNF- α and I L-6 secreted by macrophages after L PS stimulation, can reduce the expression level of inflammatory medium COX-2, and has high anti-inflammatory potential, so that the stiff silkworm aqueous extract can be used as a cosmetic raw material to be applied to the aspects of oxidation resistance, whitening, inflammation resistance and the like, and has important significance for developing the use value of stiff silkworms.)
技术领域
本发明涉及中药提取领域，具体涉及僵蚕水提物，还涉及僵蚕水提物的应用。
背景技术
家蚕(Bombyx mori)是一种重要的经济昆虫，其在饲养过程中常被真菌、细菌、病毒等感染致病。在其真菌疾病中，由白僵菌引发的白僵病较为常见，感染白僵菌(Beauveriabassiana(Bals.)Vuill.)死亡后僵化的虫体即为白僵蚕，又名僵蚕。僵蚕作为一味传统中药，药用历史悠久，具有息风止痉、祛风止痛、化痰散结等功效。其含有多种成分，现代药理学研究表明其具有广泛的药理学作用。目前对僵蚕的研究，多集中在其抗惊厥、降血糖等中药药效方面，其他方面的研究很少。
因此，有必要对僵蚕提取物进行安全性和功效进行研究，有利于开拓僵蚕的使用价值，为功效型僵蚕产品的研发和推广提供思路以及理论基础。
发明内容
有鉴于此，用水作为提取溶剂提取，得到的产品的IC50为295.77±127.46μg/mL，通过鸡胚绒毛尿囊膜实验得出0.5％的BBE不具有眼刺激性，表明BBW的安全性高。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
僵蚕水提物，所述水提物蛋白质量分数为55～65％，糖质量分数为15～20％，灰分质量分数为25～30％
优选的，由以下方法制备：将干燥的僵蚕粉用水作为提取溶剂提取，收集提取液，浓缩，干燥，得到蚕水提物。
优选的，所述水加入量按照1：30的料液比添加；所述僵蚕粉为粒径小于50目的粉末；所述提取为在90℃下提取1h。
制得的产品DPPH自由基清除实验结果显示，BBW浓度为0.625mg/mL时，DPPH·清除率达到(83±1)％，浓度增加，其清除率增加不明显。ABTS自由基清除实验结果显示，BBW浓度为2.5mg/mL时，ABTS·清除率达到(94±0)％，浓度增加，其清除率增加不明显。羟自由基清除实验结果显示，BBW浓度为1.25mg/mL时，OH·清除率达到(92±0)％，浓度增加，其清除率增加不明显。FRAP法测定BBW的总抗氧化能力为0.37±0.01mmol/g。
为此，本发明提供如下技术方案：
所述僵蚕水提物在制备抗氧化的原料中的应用。
优选的，所述抗氧化为DPPH自由基清除、ABTS自由基清除或羟自由基清除。
通过酪氨酸酶抑制实验检测BBW的美白功效。结果显示BBW对酪氨酸酶单酚酶和酪氨酸酶二酚酶都具有较好的抑制作用，且具有浓度相关性。半抑制浓度IC50分别为1.463mg/mL和3.02mg/mL。
为此，本发明提供如下技术方案：
所述僵蚕水提物在制备酪氨酸酶单酚酶或酪氨酸酶二酚酶抑制剂中的应用。
ELISA实验和实时荧光定量PCR实验表明BBW则可显著降低经LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的水平和表达量，且具有一定的浓度相关性。体外抑制实验和实时荧光定量PCR实验表明不同浓度的BBW均对COX-2具有抑制作用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述僵蚕水提物在制备降低LPS刺激后巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6水平的药物中的应用。
所述僵蚕水提物在制备降低炎性介质COX-2的表达量的药物中的应用。
以大肠杆菌和金黄色葡萄球菌为待测菌株，利用营养肉汤稀释法对BBW的抑菌活性进行检测，结果显示，该方法提取得到的安全浓度范围内的BBW不具有抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌生长的能力。以上结果表明，BBW可能具备的功效有抗氧化、美白、抗炎。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
所述僵蚕水提物在制备美白或抗炎化妆品原料中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明对僵蚕用水进行提取，提取物含蛋白，糖和灰分，再各组分共同作用下具有酪氨酸酶单酚酶或酪氨酸酶二酚酶抑制作用，清除自由基，降低降低LPS刺激后巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6水平和降低炎性介质COX-2的表达量，并对僵蚕提取物进行了安全性价，再对其进行功效筛选，期望能开拓僵蚕的使用价值，为功效型中药化妆品的研发和推广提供思路以及理论基础。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为BBW对HaCat细胞的存活率曲线。
图2为BBW对HaCat细胞的存活率。
图3为BBW对CAM的刺激观察(A：阴性对照；B：阳性对照；C：0.5％BBW对CAM的刺激作用)。
图4为BBW的DPPH·清除率。
图5为BBW的ABTS·清除率。
图6为BBW的OH·清除率。
图7为BBW的总抗氧化能力(A：不同浓度BBW抗氧化能力；B：标准曲线)。
图8为BBW对酪氨酸酶单酚酶活性的抑制能力(A：不同浓度BBW随反应时间的增加生成的黑色素含量；B：不同浓度的BBW对酪氨酸酶单酚酶活性抑制率)。
图9为BBW对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制能力(A：不同浓度BBW随反应时间的增加生成的黑色素含量；B：不同浓度的BBW对酪氨酸酶二酚酶活性抑制率)。
图10为BBW对RAW264.7巨噬细胞分泌TNF-α、IL-6的影响(A：ELISA法检测TNF-α的含量；B：ELISA法检测IL-6的含量；C：BBW对TNF-α基因表达量的影响；D：BBW对IL-6基因表达量的影响)。
图11为BBW对COX-2的抑制能力(A：BBW对COX-2的抑制率结果；B：BBW对COX-2基因表达量的影响)。
图12为BBW的抗细菌活性(A：BBW对E.coli的抑制作用；B：BBW对S.aureus的抑制作用)。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、僵蚕水提物的制备方法
僵蚕水提物的制备方法，具体步骤如下：将僵蚕烘干，磨粉，过50目筛，用水作为提取溶剂，按照1：30的料液比在90℃下提取1h，抽滤除去残渣，旋转蒸发仪浓缩提取液，最后使用喷雾干燥机喷干成粉，得僵蚕水提物BBW，检测发现水提物BBW蛋白质量分数为55～65％，糖质量分数为15～20％，灰分质量分数为25～30％。
实施例2、僵蚕水提物安全性实验
1、僵蚕水提物细胞毒性
1)铺板：将对数生长期的HaCat细胞消化下来，用含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基配置成细胞悬液，在96孔板中接种100μL的细胞悬液，每孔1～2×104个细胞。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养。
2)样品准备：取适量样品，加含10％胎牛血清的DMEM高糖培养基溶解，BBW配置成60mg/mL的初始浓度，按照1.41的稀释因子将其稀释成8个浓度进行实验，并使用一次性注射器和0.22μm的过滤器对其进行过滤处理；
3)处理细胞：细胞贴壁后，将96孔板中的培养基吸出，加入100μL不同浓度的受试液。将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养；
4)24h后，吸出待测物质，按照每孔100μL加入培养基，再向每孔加入10μL CCK-8溶液，注意不要打出气泡，以免影响读数；将96孔板置于37℃、5％CO2恒温培养箱培养1h左右，使用酶标仪测定其在450nm处的吸光度值。
以含10％胎牛血清培养基和细胞的孔为空白对照，按下式计算细胞死亡率，用GraphPad Prism 5计算出IC50。
细胞死亡率(％)＝1-(受试物OD值/空白对照OD值)×100％
结果如图1所示。结果显示，在60mg/mL的浓度下，细胞存活率为(17±2)％，BBW对细胞产生了一定的刺激作用，但细胞仍能存活一小部分。在21.4mg/mL的浓度下，细胞存活率为(45±4)％，细胞存活一半左右。在5.42mg/mL的浓度下，细胞存活率为(101±5)％，细胞全部存活。经GraphPad Prism 5分析，IC50为20.66mg/mL。
随后在其IC50范围内选择了几个浓度处理细胞，并在处理后6h、12h、24h对细胞的存活率进行测定。结果如图2所示，选取的6个BBW检测浓度对细胞的存活率并无太大影响，仅10mg/mL的BBW在处理24h后使细胞的存活率下降到了90％左右。
2、鸡胚绒毛尿囊膜试验
1)鸡胚孵育：将种蛋以气室朝上的方式放置进孵化箱中，孵化箱温度设置为37.6℃，湿度为45％-60％，翻蛋频率3次/天-6次/天，在9日龄进行照蛋检查，观察其血管长势。
2)尿囊膜制备：用镊子小心翼翼的去除气室部分的蛋壳，暴露蛋壳膜，加入3-5滴生理盐水使蛋壳膜湿润，吸出多余的生理盐水，小心用尖头镊子将蛋壳膜撕开，暴露完整的尿囊膜。
3)在暴露出的尿囊膜上放置一个硅酮橡胶环，内加质量分数0.5％的BBW样品300μL。反应3min后，用生理盐水轻轻冲洗后，观察尿囊膜的反映情况，并按表1对其进行分值评价，再按表2对其进行刺激强度分级。同时以生理盐水作为阴性对照，0.1M氢氧化钠作为阳性对照。
表1、鸡胚绒毛尿囊膜试验刺激反应评分
表2、眼刺激强度分级
结果如图3所示，结果显示，阴性对照组未引起血管的出血、凝血或血管融解(图3，A)，ES值为0，按表2判定其无刺激性。阳性对照组引起几乎所有血管都出血，有明显得凝血点出现，且有血管融解现象发生(图3，B)，ES值为18，按表2判定其具有强刺激性/腐蚀性。0.5％BBW组引起了小部分小血管融解，其他现象并未出现(图3，C)，ES值为1，按表2判定其无刺激性。
实施例3、僵蚕水提物功效实验
1、BBW对DPPH·的清除能力
取1mL不同浓度的BBW，向其中加入1mL 200ug/mL DPPH·溶液，避光反应20min，于517nm处测定吸光度值Abssampl；以1mL乙醇与1mL DPPH·溶液混合作为标准对照，测定吸光度值Abscontrol；以1mL不同浓度的BBW与1mL生理盐水混合作为空白对照，测定吸光度值Absblank；取1mL不同浓度的VC标准对照液与1mL 200ug/mL DPPH·溶液混合，为阳性对照。每组设置三个重复。受试物的DPPH·清除能力按以下公式进行计算：
清除率ARAvalue(％)＝(Abscontrol-Abssampl)/(Abscontrol-Absblank)×100
结果如图4所示，结果显示，BBW对DPPH·的清除率具有一定的浓度相关性。当BBW的浓度为0.625mg/mL时，清除率趋于稳定，此时DPPH·清除率达到了(83±1)％，随着浓度的升高，其清除率无明显改变。结果表明BBW具有较强的DPPH·清除能力。
2、BBW对ABTS·的清除能力
配制初始浓度为10mg/mL的BBW溶液，二倍稀释成6个浓度备用。取96孔板，向空白孔、样品孔和VC标准对照孔加入20μL ddH2O、不同浓度的受试液以及不同浓度的VC标准对照液，再向每个孔中加入180μL ABTS工作液。混匀后，在734nm处测定其吸光度。以VC浓度作为横坐标，清除率为纵坐标，制作VC标准曲线。每组设置三个重复。受试物的ABTS·清除率按以下公式进行计算：
清除率(％)＝[(Abs空白-Abs样品)/Abs空白]×100
结果如图5所示，结果显示BBW对ABTS·的清除率随着其浓度的升高而升高。当BBW的浓度从0.156mg/mL增加到2.5mg/mL时，其ABTS·清除率也从(9±1)％增加到了(94±0)％。当BBW的浓度达到2.5mg/mL后，随着浓度的升高，其清除率无明显改变。结果表明BBW具有较强的ABTS·清除能力。
3、BBW对OH·的清除能力
羟自由基的测定按照南京建成生物工程研究所生产的羟自由基测试试剂盒(A018-1-1)说明书进行操作。
1)配制初始浓度为10mg/mL的BBW溶液，二倍稀释成7个浓度备用。
2)按照说明书配制好应用液，在37℃水浴中预温3min。
3)按照表3配置反应体系，该步在37℃水浴中进行。
表3、反应液含量
4)室温放置20min后，550nm处测定各管吸光度值。受试物的OH·清除率按以下公式进行计算：
清除率(％)＝[(Abs样品-Abs空白)/(Abs对照-Abs空白)]×100
结果如图6所示，结果显示当BBW的浓度为0.156mg/mL时，OH·清除率为81％，当BBW的浓度达到1.25mg/mL时，清除率趋于稳定，此时OH·清除率达到了95％，随着浓度的升高，其清除率无明显改变，结果表明BBW具有强的OH·清除能力。
4、BBW的总抗氧化能力测定
FRAP法测定的总抗氧化能力本质上是受试物将Fe3+还原为Fe2+的能力，测得的OD值就代表着Fe2+的多少，因此可以从各组测得的OD值判断其抗氧化能力的强弱。10mg/mL的BBW的抗氧化能力显著高于阳性对照组1.5mM trolox的抗氧化能力，且BBW的抗氧化能力具有浓度相关性，BBW的浓度越高，其抗氧化能力也就越强(图7，A)。以Trolox的浓度为横坐标，593nm处的OD值为纵坐标，得出的标准曲线(图7，B)，其线性方程为y＝0.3046x+0.0515，R2值为0.9999。最后根据标准曲线计算得出BBW的总抗氧化能力值为0.37±0.01mmoL/g。
5、BBW对酪氨酸酶单酚酶活性的抑制能力
配制20mg/mL的BBW溶液，然后按表4准备反应液。先添加磷酸缓冲液、受试样品于24孔板，然后快速加入2mM酪氨酸溶液和100U/mL的酪氨酸酶溶液，放置于酶标仪中进行开始动力学检测，波长设置为475nm，温度设置为37℃，时间设置为40min。每组三个重复。样品的酪氨酸酶单酚酶抑制能力按以下公式进行计算：
抑制率(％)＝[1-(A4-A3)/(A2-A1)]×100
表4、反应液含量
酪氨酸酶催化生成的多巴醌在475nm处存在特征吸收，因此可以通过OD值的大小来判断多巴醌生成的多少。对照组随着反应时间的增加，酪氨酸酶与酪氨酸发生反应生成了越来越多的多巴醌，最后多巴醌的生成达到峰值；实验组反应速率明显低于对照组，且BBW的浓度越高，反应速率越低(图8，A)。取反应40min时测得的OD值对抑制率进行计算作图(图8，B)，BBW的浓度与酪氨酸酶单酚酶抑制率具有浓度相关性，其IC50为1.643mg/mL。表明BBW可以抑制酪氨酸酶单酚酶活性。
6、BBW对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制能力
配制20mg/mL的BBW溶液，然后按表5准备反应液。先添加磷酸缓冲液、受试样品于24孔板，然后快速加入4mM L-Dopa溶液和100U/mL的酪氨酸酶溶液，放置于酶标仪中进行开始动力学检测，波长设置为475nm，温度设置为37℃，时间设置为40min，每组三个重复。样品的酪氨酸酶单酚酶抑制能力按以下公式进行计算：
抑制率(％)＝[1-(A4-A3)/(A2-A1)]×100
表5、反应液含量
对照组随着反应时间的增加，酪氨酸酶与L-Dopa发生反应生成了越来越多的多巴醌，最后多巴醌的生成达到峰值；实验组反应速率明显低于对照组，且BBW的浓度越高，反应速率越低(图9，A)。取反应15min时测得的OD值对抑制率进行计算作图(图9，B)，BBW的浓度与酪氨酸酶单酚酶抑制率具有浓度相关性，其半数抑制浓度为3.02mg/mL。表明BBW可以抑制酪氨酸酶二酚酶活性。
7、BBW对经LPS刺激RAW264.7巨噬细胞产生的炎性因子TNF-α、IL-6的作用
通过ELISA的方法定量检测了经LPS刺激的RAW264.7巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的含量。LPS组TNF-α、IL-6的水平均显著高于空白组和样品组，BBW则可显著降低经LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的水平，且具有一定的浓度相关性(图10，A,B)。利用实时荧光定量PCR实验检测TNF-α、IL-6的mRNA表达量。LPS组TNF-α、IL-6的表达量均显著高于空白组和样品组，BBW则可显著降低经LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的表达量，且具有一定的浓度相关性(图10，C,D)，与ELISA的结果相吻合，说明BBW对经LPS刺激巨噬细胞产生的炎性因子TNF-α、IL-6具有一定的抑制能力。
8、BBW对COX-2的抑制能力
不同浓度的BBW均对COX-2具有抑制作用，且其抑制率与试剂盒自带的阳性对照的抑制率并无显著性差异，均在90％左右。随着BBW浓度的下降，其抑制率下降不明显(图11，A)。随后，我们又通过实时荧光定量PCR实验分析了BBW对COX-2基因表达量的影响。LPS组的COX-2表达量显著高于对照组，BBW组则无论浓度高低，均显著降低了其表达量(图11，B)。这与蛋白水平实验的结果相一致，表明BBW能够有效抑制COX-2合成。
9、BBW对大肠杆菌E.coli和金色葡萄球菌S.aureus的抑制作用
利用营养肉汤稀释法检测BBW对E.coli和S.aureus的抑制作用，结果如图12。结果显示，无论是E.coli，还是S.aureus，实验组和空白对照组的OD600均无明显差异，表明BBW对E.coli和S.aureus无抑制作用，也不会促进其增殖。
上述研究表明BBW具有较好的自由基清除活性，表明BBW在抗衰功效化妆品领域有广阔的应用前景。BBW的安全性高，且同时具有酪氨酸酶抑制活性与清除自由基活性，表明BBW在美白功效化妆品领域具有广阔的应用前景。BBW可以降低LPS刺激后巨噬细胞分泌的TNF-α、IL-6的水平和表达量，同时降低炎性介质COX-2的表达量，表明BBW具有抗炎的潜力。因此，BBW具备成为功能性化妆品原料的能力。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。