阅读说明：本技术 蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的药物中的应用 (Application of venenum Bufonis extract in preparing medicine for treating infectious diseases caused by SARS-CoV-2 virus ) 是由 曹鹏 陈姣 胡星星 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开了蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的药物中的应用,首次发现蟾酥提取物对当前正在全球大流行的SARS-CoV-2具有较好的抑制作用,临床试验表明,蟾酥注射液对COVID-19重症患者的呼吸功能改善作用显著。本发明通过临床试验和体外抗病毒实验证明了蟾酥提取物具有抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的作用,对防控和治疗此类病毒引发的感染具有重大意义,尤其为当前正在大流行的SARS-CoV-2引起的COVID-19提供有效的预防和治疗候选药物,也可为未来有可能爆发的新型病毒的防控和治疗提供候选药物。(The invention discloses an application of a toad venom extract in preparing a medicament for treating infectious diseases caused by SARS-CoV-2 virus, wherein the toad venom extract is found to have a better inhibiting effect on SARS-CoV-2 which is currently in global pandemic for the first time, and clinical tests show that the toad venom injection has a remarkable effect on improving the respiratory function of a COVID-19 severe patient. Clinical tests and in vitro antiviral experiments prove that the toad venom extract has the function of resisting novel coronavirus SARS-CoV-2, has great significance for preventing, controlling and treating the infection caused by the viruses, particularly provides effective prevention and treatment candidate medicines for the COVID-19 caused by the SARS-CoV-2 which is currently in a pandemic, and also provides candidate medicines for the prevention, control and treatment of novel viruses which are likely to break out in the future.)

蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的 药物中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及蟾酥及其提取物的新用途，具体涉及蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。

背景技术

高致病性病毒的宿主主要是野生动物，随着人类和野生动物生态系统的重叠越来越多，新型病毒出现在人类中的潜力也越来越大。病毒作为异类成员定期循环进出人类和人畜共患病宿主，使得特定抗病毒疗法和疫苗的开发变得异常复杂。寻找疗效确切且广谱的抗冠状病毒药物，不仅可以缓解当前SARS-CoV-2蔓延的燃眉之急，并且对未来有可能爆发的新型病毒提供预防和治疗的候选药物。

中药蟾酥为蟾蜍科动物中华大蟾蜍或黑眶蟾蜍的皮肤腺及耳后腺分泌的干燥分泌物。蟾酥中主要含有蟾蜍二烯内酯类、非强心甾醇类、吲哚衍生物类及其它多种类型的化学成分，具有强心、升压、麻醉止痛、抗菌、增强免疫力以及抗肿瘤等药理活性。蟾酥的中药制剂现已广泛运用于抗肿瘤治疗的临床实践，对肺癌、白血病、肝癌、胃癌、妇科恶性肿瘤等有一定的治疗作用。蟾酥的化学组成复杂，主要概括为蟾蜍二烯羟酸内酯类、20,21-环氧蟾蜍内酯类、强心甾烯蟾毒类、吲哚类衍生物、蟾酥甲碱、甾醇类、肽类、氨基酸类等。蟾毒灵、酯蟾毒配基、华蟾毒精为蟾酥的3种主要活性单体。

发明内容

本发明的目的是解决临床上缺乏治疗COVID-19有效药物的难题，提供安全、有效抑制SARS-CoV-2病毒的药物。

技术方案：本发明首次发现蟾酥提取物可作为SARS-CoV-2病毒的抑制剂，抑制病毒侵染宿主细胞，并通过临床试验验证了蟾酥提取物对COVID-19的治疗效果。从而提出蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的药物中的应用。

具体地，所述SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病包括但不限定于COVID-19、上呼吸道感染或胃肠炎等疾病。

具体地，所述蟾酥提取物通过如下步骤制备：

(1)取蟾酥干品，洗净后用8～10倍质量注射用水浸泡0.5～24h，研磨，加入乙醇使提取液中乙醇含量达50～90vt％，然后于10～30℃下静置提取1～6天；

(2)将步骤(1)所得提取溶液过滤，滤液浓缩至无醇味，加入注射用水搅拌均匀，于0～5℃下低温冷藏静置30～60h，过滤分离出滤液，浓缩即得。

具体地，所述蟾酥提取物中的有效成分至少包括蟾毒灵(bufalin，分子式C₂₄H₃₄O₄)、华蟾酥毒基(Cinobufagin，分子式C₂₆H₃₄O₆)、酯蟾毒配基(Resibufogenin，分子式C₂₄H₃₂O₄)中的任意一种单体或者两种以上单体的组合物。

优选地，所述蟾酥提取物中的有效成分为蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基三者的组合物，三者在蟾酥提取物中的总浓度为10～53μg/mL。

最优选地，所述蟾酥提取物中的有效成分蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基三种单体的质量比值为(4.5～6):(2.5～4):(2.5～4)。

本发明采用蟾酥干品进行提取得到蟾酥提取物，然后可搭配药学上可接受的载体，制成液体注射剂、粉针剂、片剂、胶囊剂、软胶囊、散剂、丸剂、口服液、膏剂、纳米制剂、微球制剂、凝胶制剂、颗粒剂或敷料等剂型。

有益效果：

(1)本发明首次发现蟾酥提取物对当前正在全球大流行的SARS-CoV-2具有较好的抑制作用，临床试验表明，蟾酥注射液对COVID-19重症患者的呼吸功能改善作用显著，而临床经验用药洛匹那韦、利托那韦被证实对COVID-19重症患者效果不明显；

(2)本发明通过临床试验和体外抗病毒实验证明了蟾酥提取物具有抗新型冠状病毒SARS-CoV-2的作用，对防控和治疗此类病毒引发的感染具有重大意义，尤其为当前正在大流行的SARS-CoV-2引起的COVID-19提供有效的预防和治疗候选药物，也可为未来有可能爆发的新型病毒的防控和治疗提供候选药物。

附图说明

下面结合附图和

具体实施方式

对本发明做更进一步的具体说明，本发明的上述和/ 或其他方面的优点将会变得更加清楚。

图1为本发明制备的蟾酥注射液的指纹图谱；其中，RT57.7峰为蟾毒灵；RT67.9 峰为华蟾酥毒基；RT69.5峰为酯蟾毒配基。

具体实施方式

根据下述实施例，可以更好地理解本发明。

实施例1：蟾酥注射液的制备

取蟾酥2g，洗净，用10倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使乙醇含量达75％，搅匀，于20℃下静置提取5天，冷藏，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，加80mL 注射用水，搅匀，2℃下静置冷藏40h，滤过，滤液中加入氯化钠8g，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～6.5，加注射用水至1000mL，搅匀，滤过，灌封，灭菌，即得蟾酥注射液。

指纹图谱：采用高效液相色谱法测定蟾酥注射液的指纹图谱，色谱条件与系统适用性试验如下：用Agilent Zorbax SB C18(柱长250，内径4.6mm，粒径5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％乙酸铵溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为 296nm；柱温30℃，流速为每分钟1.0mL。理论板数按蟾毒灵计，应不低于3000。获得蟾酥注射液的指纹图谱如图1所示。其中，RT57.7峰为蟾毒灵；RT67.9峰为华蟾酥毒基；RT69.5峰为酯蟾毒配基。

含量测定：取蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基对照品用50％乙腈溶液制成每1mL分别含蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基各1.6μg的溶液为对照，通过高效液相色谱法测定蟾酥注射液的含量，每1mL含蟾酥以蟾毒灵(C₂₄H₃₄O₄)约1.16μg、华蟾酥毒基 (C₂₆H₃₄O₆)约0.92g、酯蟾毒配基(C₂₄H₃₂O₄)约0.92g，三种单体总量为3.0μg。

实施例2：蟾酥注射液的制备

取蟾酥2g，洗净，用8倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使乙醇含量达50％，搅匀，于10℃下静置提取1天，冷藏，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，加80mL注射用水，搅匀，5℃下静置冷藏30h，滤过，滤液中加入氯化钠8g，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～6.5，加注射用水至1000mL，搅匀，滤过，灌封，灭菌，即得蟾酥注射液。

指纹图谱：采用高效液相色谱法测定蟾酥注射液的指纹图谱，色谱条件与系统适用性试验如下：用Agilent Zorbax SB C18(柱长250，内径4.6mm，粒径5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％乙酸铵溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为 296nm；柱温30℃，流速为每分钟1.0mL。理论板数按蟾毒灵计，应不低于3000。获得蟾酥注射液的指纹图。

含量测定：取蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基对照品用50％乙腈溶液制成每1mL分别含蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基各1.6μg的溶液为对照，通过高效液相色谱法测定蟾酥注射液的含量，每1mL含蟾酥以蟾毒灵(C₂₄H₃₄O₄)约0.45μg、华蟾酥毒基 (C₂₆H₃₄O₆)约0.3μg、酯蟾毒配基(C₂₄H₃₂O₄)约0.25μg，三种单体总量为1.0μg。

实施例3：蟾酥注射液的制备

取蟾酥2g，洗净，用10倍量注射用水浸泡，研磨，加乙醇使乙醇含量达90％，搅匀，于30℃下静置提取6天，冷藏，滤过，滤液浓缩回收乙醇至无醇味，加80mL 注射用水，搅匀，0℃下静置冷藏60h，滤过，滤液中加入氯化钠8g，搅拌使溶解，用氢氧化钠溶液调节pH值至4.5～6.5，加注射用水至1000mL，搅匀，滤过，灌封，灭菌，即得蟾酥注射液。

指纹图谱：采用高效液相色谱法测定蟾酥注射液的指纹图谱，色谱条件与系统适用性试验如下：用Agilent Zorbax SB C18(柱长250，内径4.6mm，粒径5μm)为色谱柱；以乙腈为流动相A，以0.1％乙酸铵溶液为流动相B进行梯度洗脱；检测波长为 296nm；柱温30℃，流速为每分钟1.0mL。理论板数按蟾毒灵计，应不低于3000。获得蟾酥注射液的指纹图谱图。

含量测定：取蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基对照品用50％乙腈溶液制成每1mL分别含蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基各1.6μg的溶液为对照，通过高效液相色谱法测定蟾酥注射液的含量，每1mL含蟾酥以蟾毒灵(C₂₄H₃₄O₄)约2.5μg、华蟾酥毒基 (C₂₆H₃₄O₆)约1.3μg、酯蟾毒配基(C₂₄H₃₂O₄)约1.2μg，三种单体总量为5.0μg。

实施例4：蟾酥注射液抗SARS-CoV-2的临床试验效果

采用前瞻性随机对照研究方法，选择2020年2月05日至2020年3月05日湖北省武汉市江夏区第一人民医院呼吸与危重病医学科符合COVID-19临床诊断或实验室确诊的重型/危重型患者50例，采用随机数字法按照1:1的比例分为治疗组(标准治疗 +蟾酥注射液)和对照组(仅标准治疗)。两组患者均针对COVID-19接受无差别标准治疗，包括帕拉米韦、干扰素α经验性抗病毒治疗；经验性抗生素覆盖可能的病原菌；营养支持；规范激素治疗；抑酸护胃等。治疗组给予蟾酥注射液(江苏浦金药业有限公司，10ml/支，产品批号：191002；批准文号为：国药准字Z32020694)20ml加入0.9％生理盐水250ml内静脉输注，速度125ml/h，对照组给予0.9％生理盐水250ml以125ml/h 静脉输注，疗程为7天。

观察指标：

基线：性别、年龄、体重指数(Body Mass Index,BMI)、发病至就诊时间、指脉氧饱和度、基础疾病、入组时生命体征(当天最差指标)、初始呼吸支持、药物使用情况等。

主要观察指标：治疗第1、7天的PO₂/FiO₂、ROX指数。

其他观察指标：第1、7天白细胞计数、淋巴细胞计数，呼吸支持向愈降阶梯时间。由于无创机械通气、高流量氧疗、面罩吸氧、鼻导管吸氧四种呼吸支持方式对患者支持力度逐渐减弱，因此呼吸支持向愈降阶梯时间定义为：入组后由高级支持向低级支持转换，或者吸氧浓度较前下降50％所需时间。患者在支持方式转换后指脉氧饱和度依然维持在94％以上，呼吸频率增加不超过20％视为转换成功。

安全性指标：①肝功能指标(AST、ALT、TB)；②肾功能指标(Cr)；③全身或局部皮疹，无法用其他原因解释；④消化道症状(恶心、呕吐、腹痛、腹泻)；⑤新发的心律失常。

统计学分析：使用SPSS 22.0软件进行数据处理，呈正态分布计量资料以均数±标准差(_x_±s)表示，组间比较采用独立样本t检验。计数资料以率(％)表示,组间比较采用χ2检验。多因素回归分析先进行单因素线性回归分析筛选出回归系数有统计学意义的各项指标，再将筛选出的指标全部纳入进行多因素线性回归分析。

结果：

一般情况：本研究共纳入50名患者，其中治疗组、对照组各25名。治疗组未完成疗程转院的患者有3名，未按时复查指标的1名；对照组未完成疗程转院的6名，均予以剔除。最终纳入统计的患者有40名，其中治疗组21名，对照组19名。两组患者在性别、年龄、BMI、发病至就诊时间、基础疾病、入组时基础生命体征等方面差异未见统计学意义，见表1。

表1两组患者一般资料比较

观察指标：两组患者初始氧合指数PO₂/FiO₂差异无统计学意义，治疗过程中治疗组20(95.2％)位患者的PO₂/FiO₂得到改善，对照组13(68.4％)位患者的PO₂/FiO₂得到改善，组间具有统计学差异(P＝0.026)；第7天时治疗组氧合指数PO₂/FiO₂明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.001)。ROX指数表现出同样趋势，第7天治疗组ROX指数为14.01±3.99，较对照组9.64±5.54升高明显，差异具有统计学意义 (P＝0.006)。两组患者外周血白细胞水平治疗前后在组内、组间差异均无统计学意义；然而淋巴细胞水平第7天时在治疗组较治疗前升高，但差异无统计学差异(P>0.05)，但与对照组第7天相比差异具有统计学意义(P＝0.018)。治疗组向愈降阶梯时间为5 天，较对照组缩短1天，差异有统计学差异(P＝0.016)，见表2。

表2两组干预情况比较

*:组内Day 1和Day 7有统计学差异,P<0.05

※:组间有统计学差异,P<0.05

^:±表示平均值±SD

多因素回归分析：以第7天氧合指数PO₂/FiO₂水平作为因变量，将患者基础情况、入组时各项指标以及治疗干预措施逐项进行单因素回归分析发现：第1天氧合指数、第1天外周血淋巴细胞计数、初始呼吸支持方式、蟾酥注射液这四个指标回归系数有统计学意义，遂再次进行多因素回归分析发现，蟾酥注射液干预、第1天氧合指数、初始呼吸支持方式这3个指标回归系数有统计学意义(P＜0.05)，第1天外周血淋巴细胞计数回归系数无统计学意义(P＞0.05)，其中治疗干预措施中仅蟾酥注射液干预有统计学意义(P＜0.001)，且对回归模型贡献最大(Beta＝0.486)，如表3所示。

表3多因素回归分析

安全性指标：治疗组在治疗期间未发现皮疹、呕吐、腹泻等常见不良反应。两组患者在治疗前后各项安全性指标差异无统计学意义(P＞0.05)，组间同期比较差异同样未见统计学意义(P＞0.05)，如表4所示。

表4两组患者安全性指标比较

实施例5：蟾酥提取物的体外抗SARS-CoV-2病毒实验

方法：将Vero E6细胞以5×10⁴个细胞/孔接种到96孔板中，在添加10％FBS的DMEM培养基中培养16小时，培养条件为5％CO₂，37℃。然后倒掉培养基，用PBS 缓冲液清洗细胞，将一定浓度的药物加到50μL/孔细胞固定液中与细胞孵育1h。以50μL/ 孔培养基作为对照。然后用SARS-CoV-2病毒感染加药或不加药的细胞2小时，感染复数MOI为0.05。倒掉病毒-药物混合物，用新鲜的含药培养基在5％CO₂，37℃再培养细胞48小时。收集培养基上清，在56℃下放置30min，然后提取病毒RNA，通过 qRT-PCR方法检测药物对病毒RNA复制的影响。用HP RNA提取试剂盒(Roche)抽提病毒RNA，用病毒核酸检测试剂盒按照说明书进行PCR反应，通过PCR仪器显示的 CT值计算2^-ΔCT值，即药物组与对照组的相对病毒复制率，病毒复制抑制率的计算公式为：(1-2^-ΔCT)×100％，结果如表5所示。其中，蟾酥注射液为实施例1制备得到，稀释至终浓度20ng/mL；蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基均为单体纯品，配制成20μg/mL的母液，然后稀释成所需的终浓度测定抗SARS-CoV-2活性。

表5不同药物对SARS-CoV-2 RNA复制的抑制率

从表5可知，蟾酥注射液在20ng/mL浓度下对SARS-CoV-2病毒RNA复制的抑制率为73.4％，其三种主要单体蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基对SARS-CoV-2病毒的RNA复制均有抑制效果，其中，蟾毒灵单体的抑制效果最好。将三种单体进行组合或两两组合，发现蟾毒灵、华蟾酥毒基、酯蟾毒配基三种单体组合时，对病毒RNA复制有最佳的抑制作用，但抑制作用低于蟾酥注射液，说明蟾酥注射液中除了蟾毒灵、华蟾酥毒基和酯蟾毒配基以外，还有其他成分可能对SARS-CoV-2病毒有抑制作用。

本发明提供了一种蟾酥提取物在制备治疗SARS-CoV-2病毒引起的感染性疾病的药物中的应用的思路及方法，具体实现该技术方案的方法和途径很多，以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。本实施例中未明确的各组成部分均可用现有技术加以实现。