阅读说明：本技术 阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物及其制备方法和用途 (Alfacalcidol carbamate derivative and preparation method and application thereof ) 是由 施建飞 钱建 于 2020-04-01 设计创作，主要内容包括：本发明属于药物化学和药理学技术领域,具体涉及一种阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物,本发明还涉及制备其化合物的方法。本发明制备的衍生物具有较强的抑制肿瘤细胞生长活性,可预期作为抗肿瘤药物用途。本发明中提供的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物,此类化合物结构中引入了芳基氨基甲酸酯结构,并且通过体外肿瘤细胞增殖抑制实验发现此类化合物具有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性,与阳性对照药骨化三醇相当或优于骨化三醇,可应用于防治乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌的药物的制备。(The invention belongs to the technical field of medicinal chemistry and pharmacology, and particularly relates to an alfacalcidol carbamate derivative and a method for preparing the compound. The derivative prepared by the invention has stronger activity of inhibiting the growth of tumor cells, and can be expected to be used as an anti-tumor medicament. According to the alfacalcidol carbamate derivative provided by the invention, an aryl carbamate structure is introduced into the compound structure, and the compound is found to have stronger tumor cell proliferation inhibition activity through an in vitro tumor cell proliferation inhibition experiment, is equivalent to or superior to a positive control drug calcitriol, and can be applied to preparation of medicines for preventing and treating breast cancer, colon cancer, lung cancer and liver cancer.)

阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于药物化学和药理学技术领域，具体涉及一种阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物及其制备方法和应用。

背景技术

阿法骨化醇(alfacalcidol)是维生素D类化合物中的脂溶性甾醇，是一类参与钙、磷的内环境稳定和骨的矿化过程的物质。阿法骨化醇最早由美国骨保健国际公司(BoneCare International)研制，并先后在以色列、德国、日本、意大利获得批准上市。用于治疗因维生素D代谢障碍而引起的钙代谢紊乱，临床用于骨质疏松症、慢性肾功能不全、甲状旁腺功能减退症、抗维生素D佝偻症、骨软化症等。近些年来，阿法骨化醇的类似物骨化三醇和度骨化醇被发现具有抗肿瘤活性，抗肿瘤作用机制与抑制Hh信号通路有关，其中骨化三醇正在临床研究中。阿法骨化醇衍生物的抗肿瘤活性报道较少，因此通过结构修饰来发现新的阿法骨化醇衍生物来开发新型抗肿瘤药物具有较高的研究价值。

发明内容

发明目的：有鉴于此，本发明的目的在于提供一种阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物，这些衍生物具有与骨化三醇相当或更优的抑制肿瘤细胞增殖活性，可用于制备抗肿瘤药物。

技术方案：本发明提供了一种阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物具有式(I)所示结构：

其中R取代基为：H、C₁-C₆的烷基、C₃-C₇的环烷基、C₁-C₆的烷氧基、硝基、氨基、羟基、氰基、卤素、三氟甲基；

进一步的，所述阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物具有如式2a～f中任意一项所示的结构：

其中，

R为氢时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2a所示结构的化合物；化合物2a：3-O-(苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇；

R为4-氟苯基时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2b所示结构的化合物；化合物2b：3-O-(4’-氟苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇；

R为4-氯苯基时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2c所示结构的化合物；化合物2c：3-O-(4’-氯苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇；

R为4-甲氧基苯基时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2d所示结构的化合物；化合物2d：3-O-(4’-甲氧基苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇；

R为3-氟苯基时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2e所示结构的化合物；化合物2e：3-O-(3’-氟苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇；

R为4-硝基苯基时，该阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物为式2f所示结构的化合物；化合物2f：3-O-(4’-硝基苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇。

本发明还提供了一种阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物的制备方法，包括以下步骤：

由阿法骨化醇与N,N-碳酰二咪唑(CDI)在甲苯中反应得到3-O-咪唑甲酰基阿法骨化醇，然后再与取代的苯胺、1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)在N,N-二甲基甲酰胺中反应，然后在甲醇中55℃反应而得到，

其中，所述反应的反应式为：

本发明还提供了一种上述的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物在制备防治乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌的药物中的应用。

有益效果：与现有技术相比，本发明中提供的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物，此类化合物结构中引入了芳基氨基甲酸酯结构，并且通过体外肿瘤细胞增殖抑制实验发现此类化合物具有较强的肿瘤细胞增殖抑制活性，与阳性对照药骨化三醇相当或优于骨化三醇，可应用于防治乳腺癌、结肠癌、肺癌、肝癌的药物的制备。

具体实施方式

下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

具体实施例1

将400mg(1mmol)的阿法骨化醇溶于10mL的甲苯中，加入0.4mL(2.5mmol)的三乙胺，和350mg(2mmol)N,N-碳酰二咪唑，室温反应48小时，反应液中加入饱和碳酸氢钠10mL淬灭反应，然后用10mL甲苯萃取3次，合并有机相，然后依次水洗、饱和食盐水洗，MgSO₄干燥，减压浓缩，柱层析(prtroleum ether:EtOAc＝3:1,R_f＝0.3)得到淡黄色固体330mg，产率67％。将该固体溶于10mL的N,N-二甲基甲酰胺中，0℃下慢慢加入1,8-二氮杂二环十一碳-7-烯(DBU)0.15mL(1mmol)和苯胺93mg(1mmol)，反应液升温到室温，反应12小时后加入水10mL淬灭反应，水相用10mL乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，然后依次水洗、饱和食盐水洗，MgSO₄干燥，减压干燥得到粗产物，将该粗产物溶于15mL甲醇，加热到55℃，并在此温度下搅拌20小时，浓缩反应液，柱层析(prtroleum ether:EtOAc＝2:1,R_f＝0.3)得到淡黄色固体260mg，产率75％。

对3-O-(苯基氨基甲酰基)-阿法骨化醇(2a)进行核磁共振检测，结果为：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.51-7.49(2H,m,ArH×2),7.32(1H,d,J＝7.5Hz,ArH),7.20-7.18(2H,m,ArH×2),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd for C₃₄H₅₀NO₃:520.3785；found:520.3790[M+H]⁺。

具体实施例2-6(2b-2f)

根据以上实施例1的方法制备以下实施例化合物

下面列出是2b-2f各化合物的理化数据：

2b：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.54(d,J＝1.8Hz,ArH),7.52(d,J＝1.8Hz,ArH),7.21(1H,d,J＝2.1Hz,ArH),7.18(1H,d,J＝2.1Hz,ArH),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd for C₃₄H₄₉FNO₃:538.3691；found:538.3697[M+H]⁺。

2c：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.52(1H,d,J＝1.8Hz,ArH),7.44(1H,d,J＝2.1Hz,ArH),7.18(1H,d,J＝1.8Hz,ArH),7.15(1H,d,J＝1.8Hz,ArH),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd forC₃₄H₄₉ClNO₃:554.3395；found:554.3391[M+H]⁺。

2d：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.51-7.49(2H,m,ArH×2),7.02-6.98(2H,m,ArH×2),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),3.78(3H,s,OCH₃)2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd for C₃₅H₅₂NO₄:550.3891；found:550.3882[M+H]⁺。

2e:¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.52(1H,s,ArH),7.44(1H,d,J＝2.1Hz,ArH),7.21(1H,s,ArH),7.10(1H,s,ArH),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd for C₃₄H₄₉FNO₃:538.3691；found:538.3693[M+H]⁺。

2f：¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ:7.98-7.97(2H,m,ArH×2),7.82-7.80(2H,m,ArH×2),6.38(1H,d,J＝11.3Hz,H-6),6.02(1H,d,J＝11.3Hz,H-7),5.33(1H,t,J＝1.5Hz,H-19Z),5.01(1H,s,H-19E),4.44(1H,dd,J＝7.8,4.3Hz,H-1b),4.26-4.25(1H,m,H-3a),2.83(1H,dd,J＝11.8,3.8Hz,H-14),2.60(1H,dd,J＝13.4,3.3Hz),2.32(1H,dd,J＝13.4,6.6Hz,H-4b),0.92(3H,d,J＝6.5Hz,CH₃),0.88-0.87(6H,m,CH₃×2),0.55(3H,s,CH₃)；HRMS(ESI):m/z calcd for C₃₄H₄₉N₂O₅:565.3636；found:565.3641[M+H]⁺。

为了更好地理解本发明的实质，下面分别用本发明提供的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物对四种肿瘤细胞株的生长的抑制作用的药理实验结果，说明其在抗肿瘤药物研究领域中的新用途。药理实施例给出了代表性化合物的部分活性数据。必须说明，本发明的药理实施例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。

药物实验例1：化合物2a～2f和骨化三醇对乳腺癌细胞(MCF-7)细胞毒活性测试：

人乳腺癌细胞MCF-7用RPMI1640培养基培养，培养基中含有10％的胎牛血清，100U/mL青霉素和100U/mL的链霉素。细胞以每孔5×10³的浓度加入到96孔板中，在37℃含有5％CO₂的潮湿空气的培养箱中培养24小时。

将化合物2a～2f溶于DMSO中，配制1×10^-2mol/L的母液，用完全培养基将母液稀释到相应浓度取对数生长期细胞接种于96孔板，24h贴壁后加入不同浓度的化合物溶液，每个浓度设4个平行孔，培养68h后加入四甲基偶氮唑盐(MTT)溶液，继续培养4h，弃去培养液，加入二甲亚砜150μL，振荡10min，用酶标仪测定570nm吸收度(A)值，计算半数抑制浓度(IC₅₀)，具体如表1所示。根据表1可知，化合物2a的IC₅₀为9×10^-9M，而阳性对照骨化三醇对MCF-7细胞的IC₅₀为16×10^-9M。

药物实验例2-4：化合物2a～2f和骨化三醇对人结肠癌细胞(HCT-116)，人肺腺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)细胞毒活性测试：

采用药物实验例1所示方法，对人结肠癌细胞(HCT-116)，人肺腺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)的生长抑制作用进行药理实验，计算半数抑制浓度(IC₅₀)，具体如表1所示。

表1化合物2a～2f和紫杉醇的细胞毒活性测试结果

根据表1可知，本发明提供的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物具有重要的生物活性，体外对人乳腺癌细胞(MCF-7)，人结肠癌细胞(HCT-116)，人肺腺癌细胞(A549)，人肝癌细胞(HepG2)共四种肿瘤细胞的细胞毒活性试验表明：此类式(1)所示结构的阿法骨化醇氨基甲酸酯衍生物对肿瘤细胞生长具有抑制作用，有可能发展成为新的防治肿瘤药物。从以上药理实施例中我们可以看出这些化合物对这四种肿瘤细胞都显示了较强的细胞毒活性，细胞毒活性超过或与阳性对照骨化三醇相当，具有开发成抗肿瘤药物的潜力。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。