阅读说明：本技术 一种前阿尔法骨化醇的制备方法 (Preparation method of pre-alpha-calciferol ) 是由 邱妍川 张慧梅 钟玲 于 2019-05-17 设计创作，主要内容包括：发明提供了一种前阿尔法骨化醇的制备方法。采用高温水浴回流制备前阿尔法骨化醇,以高效液相色谱法对其进行分离纯化,并运用HRMS,NMR对其进行了结构鉴定,结果显示所得化合物为前阿尔法骨化醇。该方法过程简单、周期短、成本低且收率高,可循环制备。(The invention provides a preparation method of pre-alpha calciferol. The method comprises the steps of preparing the pre-alpha calciferol by adopting high-temperature water bath reflux, separating and purifying the pre-alpha calciferol by using a high performance liquid chromatography, carrying out structure identification on the pre-alpha calciferol by using HRMS and NMR, and displaying the result that the obtained compound is the pre-alpha calciferol. The method has the advantages of simple process, short period, low cost, high yield and cyclic preparation.)

一种前阿尔法骨化醇的制备方法

技术领域

本发明涉及药物分析实验。

背景技术

阿尔法骨化醇化学名：(5Z，7E)-9，10-开环胆甾-5，7，10(19)-三烯-1α，3β-二醇。作用机理为通过调节对钙的利用，避免了骨软化症。其活性代谢物还对成骨细胞有调节作用，产生重要的骨基质蛋白及生长因子，对骨的更新和微小骨折的修复极为重要。阿法骨化醇片于1988年7月在日本上市，适应症为骨质疏松症、改善慢性肾功能衰竭、甲状旁腺功能低减症及抗维生素D佝偻病、软骨病等疾病所致的维生素D代谢异常的各种症状。

在根据相关指导原则及文件要求对自制阿法骨化醇片与参比制剂开展了一致性评价药学研究中发现，原研产品和自制产品中均存在一定水平的前阿法骨化醇，药典中阿法骨化醇原料与片剂质量标准中均未对前阿法骨化醇进行控制。在EP9.2阿法骨化醇原料质量标准中，有“溶液中会发生阿法骨化醇与前阿法骨化醇的互变异构，取决于温度和时间，两种化合物均为活性物质”的说明(参见图1)。在其含量测定项下规定“如有必要，将前阿法骨化醇的峰计入含量”。由于前阿法骨化醇同为活性物质，因此需要在计划含量测定项下同时对阿法骨化醇和前阿法骨化醇含量进行控制。但由于前阿法骨化醇和阿法骨化醇紫外存在响应差异，含量测定过程中也存在误差。以前阿法骨化醇为对照品的高效液相色谱法能直接定位其色谱峰的位置，显著降低或消除相对保留时间、紫外响应差异带来的影响，含量测定更准确，但该方法需要高纯度的前阿法骨化醇作为对照品。

由于前阿法骨化醇极不稳定，与阿法骨化醇在常温下易发生互变异构，如要直接合成前阿尔法骨化醇，则需要设计一条合成路线，其开发周期长、成本高、难度大。如果从原料药中直接分离制备前阿尔法骨化醇，则需要消耗大量的原料药，同样存在物料成本高的问题。

发明内容

本发明的目的是提供一种前阿尔法骨化醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1〕取得阿法骨化醇原料置于反应器中，用无水乙醇溶解；

2〕加热置步骤1所述反应器，冷凝回流；

3〕将步骤2〕反应器中的产物取出，旋蒸除去乙醇；

4〕加入流动相使步骤3〕所得产物溶解，即进行液相制备

5〕采用硅胶柱层析法，以4.5mL/min～5.5mL/min的流速，收集17min～20min的组分；

6〕浓缩步骤5〕获得的组分至凝胶状；

7〕冷冻干燥处理步骤6〕获得的凝胶状产物，得到前阿法骨化醇的白色粉末。

本发明的技术效果是毋庸置疑的，采取定向降解的方式获取前阿尔法骨化醇，并通过色谱制备及其他手段进行分离提纯。上述制备方法通过“高温制备-分离纯化-低温浓缩-减压干燥”四个步骤，具有制备过程简单、周期短、成本低、收率高的优点。经过检测，可在短时间内得到纯度95％以上的前阿尔法骨化醇，满足作为对照品使用的要求。并且在高温制备条件下未被破坏的阿尔法骨化醇可收集后进行循环制备，极大的提高了利用度，降低了成本。

附图说明

图1阿法骨化醇与前阿法骨化醇互变异构

图2前阿尔法骨化醇粗品溶液HPLC检测

图3前阿尔法骨化醇粗品溶液HPLC检测

图4前阿尔法骨化醇化学结构图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明，但不应该理解为本发明上述主题范围仅限于下述实施例。在不脱离本发明上述技术思想的情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的保护范围内。

实施例1：

一种前阿尔法骨化醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1〕取得阿法骨化醇原料置于反应器(圆底烧瓶)中，用无水乙醇溶解。

阿法骨化醇原料重量为200mg，无水乙醇的体积为100mL。

2〕加热置步骤1所述反应器，80℃热水浴加热冷凝回流2小时。

3〕将步骤2〕反应器中的产物取出，60℃热水浴减压旋蒸除去乙醇。

4〕加入流动相使步骤3〕所得产物溶解，即进行液相制备

所述的流动相的各个成分的体积配比为

正庚烷 8份

乙酸乙酯 9份

二氯甲烷 3份

所述步骤3〕所得产物重量为约200mg，流动相的体积为20mL。

5〕参见图2，采用硅胶柱层析法，以5mL/min的流速，收集17min～20min的组分；硅胶柱(GRACE，ALLTIMA，SILICA，4.6×250mm，5μm)的柱温为30℃。

6〕浓缩步骤5〕获得的组分在冰浴条件下氮吹浓缩产物至凝胶状。

7〕减压冷冻干燥处理步骤6〕获得的凝胶状产物，得到前阿法骨化醇的白色粉末(约20mg)。

实施例2：

一种前阿尔法骨化醇的制备方法，其特征在于，包括以下步骤:

1〕取得阿法骨化醇原料置于反应器(圆底烧瓶)中，用无水乙醇溶解。

阿法骨化醇原料重量为400mg，无水乙醇的体积为100mL。

2〕加热置步骤1所述反应器，90℃热水浴加热冷凝回流1.5小时。

3〕将步骤2〕反应器中的产物取出，60℃热水浴减压旋蒸除去乙醇。

4〕加入流动相使步骤3〕所得产物溶解，即进行液相制备

所述的流动相的各个成分的体积配比为

正庚烷 8份

乙酸乙酯 9份

二氯甲烷 3份

所述步骤3〕所得产物重量约为400mg，流动相的体积为40mL。

5〕参见图2，采用硅胶柱层析法，以5mL/min的流速，收集17min～20min的组分；硅胶柱(GRACE，ALLTIMA，SILICA，4.6×250mm，5μm)的柱温为30℃。

6〕浓缩步骤5〕获得的组分在冰浴条件下氮吹浓缩产物至凝胶状。

7〕减压冷冻干燥处理步骤6〕获得的凝胶状产物，得到前阿法骨化醇的白色粉末(约40mg)。

检验：

1、纯度检测

采用高效液相色谱法检测实施例1所得的白色粉末，以面积归一化法计算前阿尔法骨化醇的含量(图3)。

色谱条件：色谱柱为硅胶柱(GRACE，ALLTIMA，SILICA，4.6×250mm，5μm)；流动相正庚烷:乙酸乙酯:二氯甲烷(400:450:150)；流速为2ml/min；检测波长为265nm；柱温为30℃。

取白色粉末适量，用流动相溶解，注入高效液相色谱仪检测，结果表明其HPLC纯度＞95％，满足对照品使用要求。

2、结构鉴定

将实施例1所得产物委托重庆大学药学院进行核磁共振及质谱等实验的相关检测。检测结果如下。

2.1核磁共振谱

前阿法骨化醇分子式为C₂₇H₄₄O₂，分子中有44个H，分别属于5个CH₃、9个CH₂、9个CH、2个OH，H谱检测结果为44个H，与分子中H个数相符，C-7和C-8上两个H的耦合常数J＝12Hz，故为顺势耦合，说明该双键为顺势构型；

分子中有27个碳，DEPT谱显示分别有5种伯碳(含5个伯碳)、9种仲碳(含9个仲碳)、9种叔碳(含9个叔碳)和3种季碳(含3个季碳)，共26个C。C谱中季碳(化学位移150ppm)未出峰，在HMBC谱中与C-14,15上的H相关。

将分子按C位置编号如本文图4结构所示，按C化学位移从大到小依次列于表1。DEPT谱数据用于确定C的种类，HSQC谱用于确定直接相连的C-H的归属，¹H-¹H COSY谱用于与目标H原子直接相连的C原子上的H的归属，HMBC谱用于与目标H原子相近的原子上C的归属，将¹³C-NMR、¹³C-DEPT-135、¹H-NMR、¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HMBC测定数据列于表1。

由测试数据可以推测出前阿法骨化醇结构，结构式如图4所示(注：图4结构式中的碳原子序号为非系统命名，仅用于谱图的解析)：

表1前阿法骨化醇的NMR测定数据

2.2高分辨质谱

解析：负离子模式下，ESI电离源激发样品主要得到分子离子峰或者相应化合物的减氢、加酸根峰。前阿法骨化醇分子式为C₂₇H₄₄O₂，理论分子量为400.6。供试品由高分辨质谱测定所得分子离子峰，精确分子量为399.32698，为分子离子峰为化合物的[M-H]^-峰。与理论分子量相符。