阅读说明：本技术 基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物及其制备方法与应用 (Neutral mitochondrial fluorescent marker based on nitrogen-containing heterocycle and preparation method and application thereof ) 是由 葛健锋 王越 孙如 于 2020-02-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物及其制备方法与应用,本发明首次公开的中性荧光团为含有N-H键的杂环,靶向线粒体解决了现有中性结构的荧光染料细胞器靶向能力是随机的且不确定的问题,也避免中性荧光团是细胞中脂滴的商业标记物的问题,本发明改善荧光团良好的光学性能的同时,通过对其结构创造性的修饰来调控原荧光团的细胞器靶向能力,而且标记物改善荧光团的生物学性能,含氮杂环砌块廉价易得,有利于控制新染料的成本,具有重大的科学意义和商业价值。(The invention discloses a neutral mitochondrial fluorescent marker based on nitrogen-containing heterocycle and a preparation method and application thereof, the neutral fluorophore disclosed for the first time is a heterocycle containing N-H bonds, the targeted mitochondria solves the problems that the cellular organelle targeting capability of the existing fluorescent dye with a neutral structure is random and uncertain, and the neutral fluorophore is a commercial marker of lipid droplets in cells.)

基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于荧光标记技术，具体涉及基于含氮杂环的新型中性线粒体荧光标记物。

背景技术

线粒体是细胞中最基础的细胞器之一。它除了作为有氧呼吸的主要场所为细胞提供能量外，也参与细胞遗传物质传递和细胞分化（参见：Levenson, R.; Macara, I. G.;Smith, R. L.; Cantley, L.; Housman, D. Cell 1982, 28, 855.）等重要的生理活动。因此在科学研究中，对线粒体进行实时监控显得尤为重要。在各种技术手段中，荧光标记技术因其操作简便、制备成本低等优势脱颖而出。各种具有线粒体靶向功能的荧光探针和染料也随之孕育而生。纵观已经被报道的线粒体靶向荧光探针和染料，不难发现他们的主体结构中绝大部分都包含三苯基膦盐、吡啶盐和吲哚盐（参见：Angew Chem Int Ed2016, 55,13658.）。即便是最常用的商业用线粒体红色和绿色标记物亦是如此。这是因为线粒体内膜上存在质子泵使得的这些阳离子染料更容易穿透线粒体膜而在线粒体中聚集。但问题也随之而来，这些阳离子进入线粒体后会改变线粒体的膜电位，造成细胞凋亡（参见：Sens Actuators B2019, 292, 16.）。

发明内容

本发明公开了基于含氮杂环的一类新型中性线粒体荧光标记物，可以作为线粒体荧光标记物，本发明首次解决了现有中性结构的荧光染料细胞器靶向能力是随机的且不确定的问题，也避免中性荧光团是细胞中脂滴的商业标记物的问题，本发明改善荧光团良好的光学性能的同时，通过对其结构创造性的修饰来调控原荧光团的细胞器靶向能力，而且标记物改善荧光团的生物学性能，含氮杂环砌块廉价易得，有利于控制新染料的成本。

本发明采用如下技术方案：

基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物，为以下化学式中的一种：

、、

其中，X¹、X²独立的选自CH或者杂原子；M、E、E¹、B₁独立的选自碳原子数小于6的烷基；本发明基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物含有N-H键。

优选的，所述基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物为以下化学式中的一种：

X¹选自CH或N；X²选自CH或N。

本发明公开了上述基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物在线粒体荧光标记中的应用；或者上述基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物在制备线粒体荧光标记试剂中的应用。

本发明公开了上述基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物的制备方法，其特征在于，为以下制备方法中的一种：

（1）化合物6与化合物7反应得到化合物8；化合物8脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物；

（2）化合物9与化合物7反应得到化合物10；化合物10脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物；

（3）化合物13与化合物7反应得到化合物14；化合物14脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物。

本发明公开了一种细胞成像方法，包括以下步骤：

（1）化合物6与化合物7反应得到化合物8；化合物8脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物；

（2）化合物9与化合物7反应得到化合物10；化合物10脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物；

（3）化合物13与化合物7反应得到化合物14；化合物14脱保护，得到基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物；

（4）将步骤（1）或者步骤（2）制备的基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物与细胞共培养后加入线粒体红色标记物，继续培养后，进行细胞成像；

或者将步骤（3）制备的基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物与细胞共培养后加入线粒体绿色标记物，继续培养后，进行细胞成像。所述细胞包括正常细胞、癌细胞。

本发明中，脱保护在盐酸存在下进行；化合物6与化合物7的反应在贵金属盐催化剂存在下进行，优选在碱性条件下反应；化合物9与化合物7的反应在贵金属盐催化剂存在下进行，优选在碱性条件下反应；化合物13与化合物7的反应在贵金属盐催化剂存在下进行，优选在碱性条件下反应。优选的，贵金属盐催化剂包括钯盐催化剂。

本发明中，化合物的化学结构式如下：

化合物14的化学结构式如下：

其中，这些杂环含有N-H键，X¹、X²独立的选自CH或者杂原子；M、E、E¹、B₁为取代基，独立的选自碳原子数小于6的烷基。本发明所述的烷基表示碳原子为1～6的饱和支链或者直链单价烃基，比如甲基（Me）、正丁基（Bu）、乙基（Et）等。

本发明中，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像；蓝光通道使用405nm激发，收集410～500 nm范围内的荧光信号；红光通道使用561nm激发，收集570～750 nm范围内的荧光信号；绿光通道使用488 nm激发，收集500～550 nm范围内的荧光信号。

本发明首次公开了用于细胞中性粒荧光标记的基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物，与细胞共培养后，可以实现细胞成像。本发明改善荧光团良好的光学性能的同时，通过对其结构创造性的修饰来调控原荧光团的细胞器靶向能力，进行细胞成像时细胞毒性低、对生物样品损坏小、不受其他细胞器的影响、可以对细胞样品进行长时间观测，而且标记物改善荧光团的生物学性能，含氮杂环砌块廉价易得，有利于控制新染料的成本。

附图说明

图1为本发明涉及的染料的合成路线；

图2为染料1a的核磁共振氢谱图；

图3为染料1a在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图4为染料1b在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图5为染料1c在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图6为染料2a在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图7为染料2b在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图8为染料2c在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图9为染料3a在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图10为染料3b在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图11为染料3c在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图12为染料3d在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图13为染料4在氯仿中的紫外-可见吸收光谱和荧光光谱；

图14为染料1a在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图15为染料1b在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图16为染料1c在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图17为染料2a在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图18为染料2b在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图19为染料2c在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图20为染料3a在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图21为染料3b在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图22为染料3c在L929细胞和HeLa细胞中的细胞成像图；

图23为染料3d在L929细胞中的细胞成像图；

图24为染料3d在HeLa细胞中的细胞成像图；

图25为染料4在HeLa细胞中的细胞成像图。

具体实施方式

本发明实施例的合成路线参见附图1，化学式下方的数字表示化合物。本发明化合物合成中，原料比例以及纯化方法采用常规比例或者常规纯化方法，实施例为示意性表述。

实施例

取化合物5（2.0毫摩尔，618.1毫克）、联硼酸频那醇酯（2.5毫摩尔，634.8毫克）、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.2毫摩尔，146.3毫克）和磷酸钾（4.0毫克，849.1毫克）溶解于25.0毫升1,4-二氧六环中；氮气置换三次，于100℃反应12小时；降至室温后，将反应后的混合物抽滤，滤液通过旋转蒸发仪除去溶剂，经柱层析（洗脱剂：石油醚/乙酸乙酯（5/1，v/v））分离后得到淡黄色中间体6，244.9毫克，产率35%；核磁测试：(400 MHz, DMSO-d₆)¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 7.52 (d, 1H, J = 9.0, Ar-H), 6.67 (d, 1H, J =8.9, Ar-H), 6.48 (s, 1H, Ar-H), 3.43 (q, J = 6.9 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 2.37 (s,3H, CH ₃), 1.30 (s, 12H, 4 × CH ₃), 1.12 (t, J = 6.1 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 163.4, 159.1, 156.4, 150.8,125.9, 109.5, 108.1, 97.4, 84.0, 44.7, 24.8, 18.0, 12.5.

取中间体6（1.0mmol，357.2mg）、化合物7a（叔丁基 5-溴-1H-吲唑-1-羧酸酯，1.2mmol，355.2mg）、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1mmol，73.1mg）和磷酸钾（2.0mmol，424.5mg）溶于15.0mL1,4-二氧六环中，反应体系由氮气置换三次，随后在回流条件下反应12小时；降至室温后，将反应后的混合物进行抽滤，滤液通过旋转蒸发仪除去溶剂；纯净中间体8a经柱层析分离后得到，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v），淡黄色固体，192.3mg，产率43%。中间体8a的核磁测试：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ(ppm)8.23 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.19 (s, 1H, Ar-H), 7.68 (s, 1H, Ar-H), 7.48(d, J = 8.8 Hz, 2H, Ar-H), 6.64 (d, J = 9.0 Hz, 2H, Ar-H), 6.57 (s, 1H, Ar-H), 3.44 (q, J = 7.0 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 1.74 (s, 9H, 3 × CH ₃) 2.24 (s, 3H,CH ₃), 1.22 (t, J = 6.0 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz,CDCl₃) δ(ppm) 162.2, 155.1, 150.4, 149.1, 148.8, 139.6, 139.0, 131.7, 131.0,126.1, 126.0, 123.0, 120.2, 114.4, 109.4, 108.7, 97.5, 84.9, 44.8, 28.2,24.8, 16.4, 12.4.

将中间体8a（0.3mmol，134.2mg）溶解于1.0 mL浓盐酸和3.0mL1,4-二氧六环的混合溶液中，在室温下搅拌，利用薄层色谱监测反应，当原料反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液，然后用三氯甲烷（3×30.0mL）萃取，收集有机层，加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂；粗产物经柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v），得到98.9mg纯产物，淡黄色固体，产率95%，称为染料1a。图2为染料1a的核磁共振氢谱图(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 13.13 (s, 1H, N-H), 8.09 (s, 1H, Ar-H), 7.65 (s, 1H, Ar-H), 7.59 (d, J = 5.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.57 (d, J = 4.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.24 (d,J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 6.74 (d, J = 8.5, 1H, Ar-H), 6.57 (s, 1H, Ar-H), 3.46(q, J = 7.3 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 2.20 (s, 3H, CH ₃), 1.14 (t, J = 6.1 Hz, 6H, 2× CH ₃)；染料1a的核磁共振碳谱图(151 MHz, CDCl₃) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm)162.6, 155.1, 150.2, 148.8, 139.5, 135.0, 129.4, 128.0, 126.1, 123.3, 122.6,121.1, 109.7, 109.5, 108.6, 97.5, 44.7, 16.4, 12.5.

取中间体6（1.0毫摩尔，357.2毫克）、化合物7b（叔丁基 5-溴-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-1-羧酸酯，1.2毫摩尔，355.2毫克）、[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和磷酸钾（2.0毫摩尔，424.5毫克）溶于15.0毫升1,4-二氧六环中，氮气置换三次后在回流条件下反应8小时，降至室温后，将反应后的混合物进行抽滤，滤液通过旋转蒸发仪除去溶剂，中间体8b经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v），淡黄色固体，176.8毫克，产率40%。中间体8b的核磁测试：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.38 (s, 1H, Ar-H), 7.93 (s, 1H, Ar-H), 7.66 (d, J =3.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.47 (d, J = 8.9 Hz, 1H, Ar-H), 6.64 (d, J = 8.9 Hz, 1H,Ar-H), 6.56 (s, 1H, Ar-H), 6.54 (d, J = 3.3 Hz, 1H, Ar-H), 3.44 (q, J = 7.0Hz, 4H, 2 × CH ₂), 2.27 (s, 3H, CH ₃), 1.69 (s, 9H, 3 × CH ₃), 1.23 (t, J = 6.7Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 162.1,155.2, 150.4, 149.3, 147.9, 147.5, 146.7, 131.4, 126.9, 126.2, 126.1, 122.7,117.9, 109.4, 108.7, 104.7, 97.5, 84.1, 44.8, 28.1, 16.5, 12.4.

将中间体8b（0.3毫摩尔，134.2毫克）溶解于1.0毫升浓盐酸和3.0毫升1,4-二氧六环的混合溶液中，在室温下搅拌1.5小时，利用薄层色谱监测反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应体系，然后用三氯甲烷（3 × 30.0毫升）萃取，收集有机层，加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂，粗产物经随后进行柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v），得到97.9毫克纯产物，淡黄色固体，产率94%，称为染料1b；核磁: (400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 11.73 (s, 1H, N-H), 8.09 (s, 1H, Ar-H), 7.86 (s,1H, Ar-H), 7.60 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.51 (s, 1H, Ar-H), 6.75 (d, J =8.6 Hz, 1H, Ar-H), 6.58 (s, 1H, Ar-H), 6.48 (s, 1H, Ar-H), 3.46 (q, J = 6.9Hz, 4H, 2 × CH ₂), 2.22 (s, 3H, CH ₃), 1.15 (t, J = 6.7 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151MHz, DMSO-d₆) ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 161.7, 155.1, 150.5, 149.4,148.0, 144.6, 130.4, 127.2, 126.9, 123.2, 119.5, 118.5, 109.2, 109.1, 100.3,97.0, 44.4, 16.7, 12.8.

取中间体6（1.0毫摩尔，357.2毫克），化合物7c（叔丁基5-溴-1H-吡唑并[3,4-b]吡啶-1-羧酸酯，1.2毫摩尔，356.4毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和磷酸钾（2.0毫摩尔，424.5毫克）溶于15.0毫升1,4-二氧六环中。氮气置换三次后在回流条件下反应8小时。降至室温后，将反应后的混合物进行抽滤，滤液通过旋转蒸发仪除去溶剂。中间体8c经柱层析分离后得到纯净产物，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v），淡黄色固体，147.9毫克，产率33%。中间体8c的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.65 (s, 1H, Ar-H), 8.20 (s, 1H, Ar-H), 8.15 (s, 1H, Ar-H), 7.49 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar-H), 6.67 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 6.57 (s,1H, Ar-H), 3.45 (q, J = 7.0 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 2.29 (s, 3H, CH ₃), 1.75 (s, 9H,3 × CH ₃), 1.24 (t, J = 7.0 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151MHz, CDCl₃) δ(ppm) 162.2, 156.1, 152.9, 151.6, 150.5, 150.3, 147.5, 136.3,132.2, 125.5, 119.3, 115.4, 109.1, 108.8, 108.4, 97.7, 85.9, 44.7, 28.1,18.4, 12.5.

将中间体8c（0.3毫摩尔，134.5毫克）溶解于1.0毫升浓盐酸和3.0毫升1,4-二氧六环的混合液中，室温搅拌1.5小时。利用薄层色谱监测反应完全后加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应体系。然后用三氯甲烷（3×30.0毫升）萃取，收集有机层。加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂后进行柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v）。得到100.3毫克淡黄色固体，为染料1c。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 13.74 (s,1H, N-H), 8.42 (s, 1H, Ar-H), 8.18 (s, 1H, Ar-H), 8.16 (s, 1H, Ar-H), 7.62(d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 6.76 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.59 (s, 1H, Ar-H), 3.46 (q, J = 6.1 Hz, 4H, 2×CH ₂), 2.23 (s, 3H, CH ₃), 1.15 (t, J = 6.9 Hz,6H,2×CH ₃)；(151MHz,DMSO-d₆)¹³CNMR(151MHz,DMSO-d₆)δ(ppm) 161.6,155.2,151.2,151.1,150.78,150.1,133.8,132.1,127.3,124.5,117.4,114.4,109.3,109.0,97.0,44.4,16.7,12.8。

取化合物9（1.0毫摩尔，379.2毫克），化合物7a（1.2毫摩尔，355.2毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于15.0毫升1,4-二氧六环中。氮气置换三次后回流6小时，反应完成后，冷却至室温抽滤，滤液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂。通过柱层析提出产物，洗脱剂为二氯甲烷。得到白色固体300.3毫克中间体10a，产率64%。核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.66 (t, J = 8.0 Hz, 2H, Ar-H), , 8.37 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 8.29(s, 1H, Ar-H), 8.21 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 7.88 (s, 1H, Ar-H), 7.75(d, J= 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.72(d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.68(d, J = 7.8 Hz, 1H,Ar-H), 4.22 (t, J = 7.4 Hz, 2H, CH ₂), 1.78 (s, 9H, 3 × CH ₃), 1.76-1.71 (m,2H, CH ₂), 1.50-1.44 (m, 2H, CH ₂), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH ₃)；(151 MHz,CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 164.2, 164.0, 149.1, 146.0, 139.5,139.5, 134.4, 132.2, 131.2, 130.8,130.7,130.2,128.7,128.2,127.0,126.1,123.0,122.2,122.1,114.8, 85.4,40.3,30.2,28.2,20.4, 13.8.

取中间体10a（0.5毫摩尔，234.6毫克）溶于2.0毫升浓盐酸和6.0毫升1,4-二氧六环的混合溶液中。室温搅拌过夜，将析出的白色固体抽滤，随后用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，即得到162.4毫克纯产物2a，白色固体，产率88%，称为染料2a。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 8.56-8.54 (m, 2H, Ar-H), 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H,Ar-H),, 8.22 (s, 1H, Ar-H),, 7.94 (s, 1H, Ar-H), 7.82 (t, J = 7.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.76 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.51 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 4.07 (t,J = 7.3 Hz, 2H,CH ₂), 1.67-1.63 (m,2H,CH ₂), 1.41-1.35 (m, 2H, CH ₂), 0.94 (t, J=7.2 Hz, 3H,CH ₃)；(151 MHz, DMSO-d₆) ¹³C NMR (151MHz, DMSO-d₆)δ(ppm) 163.9,163.7, 147.2, 140.1, 134.5, 132.9, 131.1, 130.8, 130.8, 130.1, 128.7, 128.4,127.8, 123.5, 122.8, 122.4, 121.3, 111.0, 40.5, 30.1, 20.2, 14.2.

取化合物9（1.0毫摩尔，379.2毫克），化合物7b（1.2毫摩尔，355.2毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于15.0毫升1,4-二氧六环中。反应在氮气氛围下回流6小时。反应结束后冷却至室温，抽滤得到滤液。滤液蒸干后，通过柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）。得到白色固体，243.9毫克，产率52%。中间体10b的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ(ppm) 8.68 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.66-8.64 (m, 2H, Ar-H), 8.22(d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.04 (s, 1H, Ar-H), 7.78 (d, J = 3.8 Hz, 1H, Ar-H), 7.75 (d, J = 7.6Hz, 1H, Ar-H), 7.71 (d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 4.23 (t, J= 7.5 Hz, 2H, CH ₂), 1.79-1.75 (m, 2H, CH ₂), 1.72 (s, 9H, 3 × CH ₃), 1.50-1.45(m, 2H, CH ₂), 1.00 (t, J = 7.2 Hz, 3H, CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz,CDCl₃) δ(ppm) 164.2, 164.0, 148.1, 147.8, 145.7, 143.7, 132.1, 131.3, 130.7,130.4, 130.1, 129.55, 128.6, 128.5, 127.9, 127.1, 123.0, 122.8, 122.3, 104.5,84.6, 40.3, 30.2, 28.1, 20.4, 13.8.

取中间体10b（0.5mmol，234.6mg）溶于2.0ml浓盐酸和6.0ml1,4-二氧六环的混合液中。室温搅拌过夜，有固体析出。抽滤，滤饼用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，得164.3mg白色固体，产率89%，称为染料2b。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆)δ(ppm) 11.95(s, 1H, N-H), 8.57 (d, J = 4.1 Hz, 1H, Ar-H), 8.55 (d, J = 3.5 Hz, 1H, Ar-H),8.37 (s, 1H, Ar-H), 8.31 (d, J = 8.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.16 (s, 1H, Ar-H), 7.88-7.83 (m, 2H, Ar-H), 7.63 (s, 1H, Ar-H), 6.59 (s, 1H, Ar-H), 4.08 (t, J = 7.3Hz, 2H, CH ₂), 1.69-1.61 (m,2H, CH ₂), 1.42-1.35 (m, 2H, CH ₂), 0.95 (t, J = 7.3Hz, 3H, CH ₃)；(151 MHz, DMSO-d₆) ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆)δ(ppm) 163.8, 163.6,148.7, 145.0, 143.6, 132.8, 131.2, 130.7, 130.3, 129.7, 129.1, 128.4, 127.9,127.9, 126.3, 122.8, 121.4, 119.8, 100.8, 40.5, 30.1, 20.2 14.2.

取化合物9（1.0毫摩尔，379.2毫克），化合物7c（1.2毫摩尔，356.4毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于15.0毫升1,4-二氧六环中。在氮气保护下，回流4小时。待反应结束冷却至室温后，通过抽滤得到滤液。将滤液旋转蒸发后，通过柱层析分离提纯，展开剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）.得到白色固体，150.5毫克，产率32%。中间体10c的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.91 (s, 1H, Ar-H), 8.70 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.68(d, J = 7.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.31 (s, 1H, Ar-H), 8.26 (s, 1H, Ar-H), 8.13 (d, J= 8.4Hz, 1H, Ar-H), 7.77-7.73 (m, 2H, Ar-H), 4.23 (t, J = 7.5 Hz, 2H, CH ₂) ,1.78 (s, 9H, 3 × CH ₃), 1.74-1.71 (m, 2H, CH ₂), 1.52-1.45 (m, 2H, CH ₂), 1.00(t, J = 7.3 Hz, 3H, CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃,) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm)164.0, 163.8, 151.6, 151.5, 147.7, 142.1, 137.4, 131.4, 131.4, 131.0, 130.6,130.6, 130.2, 128.7, 127.5, 123.2, 122.9, 117.6, 85.9, 40.4, 30.2, 28.1,20.4, 13.8.

取中间体10c（0.3毫摩尔，141.1毫克）溶于1.0毫升浓盐酸和3.0毫升1,4-二氧六环的混合溶液中。室温搅拌过夜，有固体析出。抽滤，滤饼用饱和碳酸氢钠溶液洗涤，得到119.9毫克白色固体，产率85%，称为染料2c。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 13.94 (s, 1H, N-H), 8.69 (s, 1H, Ar-H), 8.59-8.56 (m, 2H, Ar-H)8.48 (s, 1H, Ar-H), 8.29-8.27 (m, 2H, Ar-H), 7.92 (d, J = 7.3 Hz, 1H, Ar-H),7.87 (t, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 4.09 (t, J = 6.2 Hz, 2H, CH ₂) , 1.67-1.64 (m,2H, CH ₂), 1.41-1.35 (m, 2H, CH ₂), 0.95 (t, J = 6.8 Hz, 3H, CH ₃)； (151 MHz,DMSO-d₆) ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 163.8, 163.6, 151.8, 149.9, 143.8,134.3, 132.5, 131.6, 131.3, 130.7, 130.2, 129.3, 128.4, 128.1, 127.5, 122.9,121.9, 114.6, 40.5, 30.1, 20.2, 14.2。

取化合物11（2.0毫摩尔，668.3毫克）溶解于30.0毫升无水四氢呋喃溶液中，随后加入N-苯基双(三氟甲烷磺酰)亚胺（4.0毫摩尔，1.4克）和三乙胺（4.0毫摩尔，0.6毫升）。在氮气下室温搅拌24h。反应结束后，真空蒸发溶剂，柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（50/1，v/v）。得到559.3毫克绿色固体，产率60%。中间体12的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.70 (d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar-H), 8.15 (s, 1H, Ar-H),7.58 (d, J = 5.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.55 (d, J = 5.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.66 (d, J =9.1 Hz, 1H, Ar-H), 6.43 (s, 1H, Ar-H), 6.38 (s, 1H, Ar-H), 3.48 (q, J = 7.1Hz, 4H, 2 × CH ₂), 1.26 (t, J = 7.1 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, DMSO-d₆) ¹³CNMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 181.3, 152.3, 151.4, 150.5, 147.0, 137.6,133.4, 131.7, 131.5, 126.5, 125.2, 124.0, 118.1, 110.3, 105.5, 96.1, 45.2,12.6.

取中间体12（2.0毫摩尔，932.2毫克），联硼酸频那醇酯（2.5毫摩尔，634.8毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.2毫摩尔，146.3毫克）和乙酸钾（4.0毫摩尔，392.6毫克）溶解于40.0毫升1,4-二氧六环中。混合物在氮气氛围下，回流8小时。反应结束后，降至室温，抽滤，所得滤液旋转蒸发除去溶剂。通过柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）。得到绿色固体，790.7毫克，产率89%。中间体13的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹HNMR (400 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 8.78 (s, 1H, Ar-H), 8.61 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.10 (d, J = 7.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.58 (d, J = 8.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.63 (d,J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 6.43 (s, 1H, Ar-H), 6.37 (s, 1H, Ar-H), 3.45 (q, J =6.7 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 1.38 (s, 12H, 4 × CH3), 1.25 (t, J = 7.1 Hz, 6H, 2 ×CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 183.8, 152.2, 150.8,146.7, 139.9, 136.9, 134.1, 132.7, 131.2, 130.8, 125.0, 122.8, 109.7, 105.8,96.2, 84.1, 83.1, 45.1, 24.9, 24.5, 12.6.

取中间体13（1.0毫摩尔，444.2毫克），化合物7a（1.2毫摩尔，355.2毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于35.0毫升1,4-二氧六环中。氮气置换3次后，加热回流12小时。反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液蒸干溶剂后，通过柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）。得到192.3毫克红棕色固体，产率43%。中间体14a的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ(ppm) 8.72 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 8.59 (s, 1H, Ar-H), 8.28 (d, J = 8.9Hz, 1H, Ar-H), 8.25 (s, 1H, Ar-H), 8.10 (s, 1H, Ar-H), 8.00 (d, J = 8.3 Hz,1H, Ar-H), 7.95 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.63 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar-H),6.69 (d, J = 9.1 Hz, 1H, Ar-H), 6.49 (s, 1H, Ar-H), 6.43 (s, 1H, Ar-H), 3.47(q, J = 6.9 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 1.76 (s, 9H, 3 × CH ₃). 1.27 (t, J = 7.0 Hz,6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 183.5, 152.2,150.7, 149.1, 146.7, 141.7, 139.8, 139.4, 139.3, 135.9, 132.1, 131.1, 130.9,129.8, 128.6, 126.68, 125.1, 124.6, 124.1, 119.5, 114.9, 109.8, 105.7, 96.2,85.1, 45.1, 28.2, 12.6.

取中间体14a（0.3毫摩尔，160.3毫克）溶于2.0毫升浓盐酸和6.0毫升1,4-二氧六环的混合溶液中。在室温下搅拌。利用薄层色谱监测反应完全后，加入饱和碳酸氢钠溶液中和反应体系。然后用三氯甲烷（3 × 30.0毫升）萃取，收集有机层。加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂后进行柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v）。得到121.1毫克墨绿色固体，产率93%，称为染料3a。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm)13.21 (s, 1H, N-H), 8.57 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 8.35 (s, 1H, Ar-H), 8.16-8.12 (m, 3H, Ar-H), 7.76 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 7.63 (d, J = 8.7 Hz, 1H,Ar-H), 7.60 (d, J = 9.2 Hz, 1H, Ar-H), 6.81 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.64(s, 1H, Ar-H), 6.29 (s, 1H, Ar-H). 3.51 (q, J = 6.9 Hz, 4H, 2 × CH ₂), 1.17(t, J = 6.8 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz, DMSO-d₆) ¹³C NMR (151 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 181.8, 151.8, 150.7, 146.3, 142.0, 138.0, 134.2, 131.4, 131.3, 130.8,129.8, 129.7, 129.5, 125.4, 124.3, 124.2, 122.5, 118.8, 110.8, 110.3, 109.4,104.5, 96.0, 44.4,12.4.

取中间体13（1.0毫摩尔，444.2毫克），化合物7b（1.2毫摩尔，355.2毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于35.0毫升1,4-二氧六环中。在氮气氛围下回流7小时。反应结束后，冷却至室温，抽滤。所得滤液在旋转蒸发仪上除去溶剂。柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）得到棕色固体204.1毫克，产率47%。中间体14b的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ(ppm) 8.86 (s, 1H, Ar-H), 8.74 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 8.57 (s, 1H, Ar-H), 8.24 (s, 1H, Ar-H), 7.98 (d, J = 8.2 Hz, 1H, Ar-H), 7.70 (d, J = 3.8 Hz,1H, Ar-H), 7.63 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar-H), 6.68 (d, J = 8.9 Hz, 1H, Ar-H),6.60 (d, J = 3.9 Hz, 1H, Ar-H), 6.43 (s, 1H, Ar-H), 3.47 (q, J = 7.0 Hz, 4H,2 × CH ₂), 1.70 (s, 9H, 3 ×CH ₃), 1.26 (t, J = 6.8 Hz, 6H, 2 × CH ₃)；(151 MHz,CDCl₃) ¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 183.5, 152.3, 150.8, 148.0, 147.9,146.8, 144.1, 140.1, 139.5, 132.2, 131.2, 131.1, 131.0, 129.9, 127.7, 127.4,125.1, 124.7, 124.2, 123.2, 109.8, 105.8, 104.7, 96.3, 84.2, 45.1, 28.1,12.6.

取中间体14b（0.3mmol，160.3mg）溶于2.0ml浓盐酸和6.0ml1,4-二氧六环的混合溶液中。在室温下搅拌。利用薄层色谱监测反应完全后加入饱和碳酸氢钠溶液。然后用三氯甲烷（3×30.0ml）萃取，收集有机层。加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂后进行柱层析分离提纯，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v）。得到118.5mg绿色固体，产率91%，称为染料3b。核磁:(400 MHz, DMSO-d₆) ¹H NMR (400 MHz, DMSO-d₆) δ(ppm) 11.82 (s, 1H, N-H), 8.66-8.63 (m, 2H, Ar-H), 8.40 (d, J = 5.6 Hz, 1H, Ar-H), 8.21 (d, J = 7.0 Hz, 1H,Ar-H), 7.67 (d, J = 9.0 Hz, 1H, Ar-H), 7.56 (s, 1H, Ar-H), 6.87 (d, J = 9.0Hz, 1H, Ar-H), 6.71 (s, 1H, Ar-H), 6.56 (s, 1H, Ar-H), 6.36 (s, 1H, Ar-H),3.52 (q, J = 7.0 Hz, 4H, 2×CH ₂), 1.17 (t, J = 6.8 Hz, 6H, 2 ×CH ₃)；(151 MHz,TFA-d) ¹³C NMR (151 MHz, TFA-d) δ(ppm) 150.8, 148.0, 138.0, 137.1,136.8,134.3,131.3,130.6,130.5,130.2,130.0,127.6,125.8,123.4,120.0,115.7,114.9,113.7,113.0,104.0,101.9,50.5,10.2.

取中间体13（1.0毫摩尔，444.2毫克），化合物7c（1.2毫摩尔，356.4毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于35.0毫升1,4-二氧六环中。在氮气氛围下回流7小时。反应结束后，冷却至室温，抽滤。所得滤液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂。柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）得到棕色固体183.8mg，产率35%。中间体14c的核磁：(400 MHz, CDCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 9.11 (s, 1H, Ar-H), 8.75 (d, J = 7.0 Hz, 1H, Ar-H), 8.56 (s, 1H, Ar-H),8.41 (s, 1H, Ar-H), 8.26 (s, 1H, Ar-H), 7.96 (d, J = 7.9 Hz, 1H, Ar-H), 7.63(d, J = 7.8 Hz, 1H, Ar-H), 6.69 (d, J = 8.7 Hz, 1H, Ar-H), 6.48 (s, 1H, Ar-H), 6.43 (s, 1H, Ar-H), 3.48 (q, J = 5.8 Hz, 4H, 2×CH ₂), 1.77 (s, 9H, 3×CH ₃). 1.27 (t, J = 5.4 Hz, 6H, 2×CH ₃)；(151 MHz, CDCl₃) ¹³C NMR (151 MHz,CDCl₃) δ(ppm) 183.2, 152.4, 151.5, 151.0, 150.1, 147.8, 146.9, 139.2, 138.7,137.6, 132.3, 132.1, 131.6, 131.3, 129.8, 128.4, 125.2, 125.0, 124.4, 118.0,110.0, 105.7, 96.3, 85.5, 45.1, 28.1, 12.6.

取中间体14c（0.3毫摩尔，166.0毫克）溶于2.0毫升浓盐酸和6.0毫升1,4-二氧六环的混合液中。室温下搅拌。利用薄层色谱监测至反应完全后加入饱和碳酸氢钠溶液。用三氯甲烷（3×30.0毫升）萃取，收集有机层。加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂后进行柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v）。得到113.6毫克紫色固体，产率87%，称为染料3c。(400MHz,DMSO-d₆) ¹H NMR (400MHz,DMSO-d₆)δ(ppm) 13.81 (s,1H,N-H), 8.97(s,1H,Ar-H), 8.66-8.64 (m, 2H, Ar-H), 8.43 (s, 1H, Ar-H), 8.24-8.22 (m, 2H, Ar-H),7.66(d,J = 8.9 Hz, 1H, Ar-H), 6.87 (d, J = 8.3 Hz, 1H, Ar-H), 6.70 (s,1H,Ar-H),6.36(s,1H,Ar-H), 3.51 (q,J=6.5Hz,4H,2×CH ₂),1.17(t,J=6.0Hz,6H,2×CH ₃)；(151MHz,TFA-d) ¹³CNMR(151MHz,TFA-d)δ(ppm)180.9,150.5,143.5,143.2,142.9,137.3,134.9,134.6,132.7,132.1,131.9,130.0,125.9,123.5,120.2,115.5,114.8,113.6,112.9,49.7,18.5,10.4。

上述制备的染料1a、染料1b、染料1c、染料2a、染料2b、染料2c、染料3a、染料3b、染料3c为本发明实施例的基于含氮杂环的中性线粒体荧光标记物。

对比例

取中间体13（1.0毫摩尔，444.2毫克），化合物15（1.2毫摩尔，249.6毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于35.0毫升1,4-二氧六环中。在氮气下回流4小时。反应结束后，冷却至室温，抽滤。所得滤液在旋转蒸发仪上蒸干溶剂。柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（100/1，v/v）得到棕色固体298.9毫克，产率67%，为染料3d。核磁共振氢谱(400 MHz, CHCl₃) ¹H NMR (400 MHz,CDCl₃) δ(ppm) 8.90 (s, 1H, Ar-H), 8.86 (s, 1H, Ar-H), 8.78 (d, J = 8.2 Hz,1H, Ar-H), 8.72 (s, 1H, Ar-H), 8.47 (s, 1H, Ar-H), 8.23 (s, 2H, Ar-H), 8.13(d, J = 8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.64 (d, J = 8.9 Hz, 1H, Ar-H), 6.69 (d, J = 8.8Hz, 1H, Ar-H) 6.49 (s, 1H, Ar-H), 6.44 (s, 1H, Ar-H), 3.48 (q, J = 6.9 Hz,4H, 2×CH₂), 1.28 (t, J = 6.8 Hz, 6H, 2×CH₃)；碳谱：(151 MHz, CDCl₃) ¹³C NMR(151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 183.4, 152.3 150.9, 146.8, 145.5, 144.9, 143.3,142.6, 141.6, 140.6, 139.3, 132.2, 131.7, 131.2, 130.0, 129.9, 129.7, 127.3,125.2, 124.8, 124.6, 109.9, 105.8, 96.3, 45.1, 12.6.

取化合物15（1.2毫摩尔，355.2毫克），[1,1'-双(二苯基膦基)二茂铁]二氯化钯（0.1毫摩尔，73.1毫克）和乙酸钾（2.0毫摩尔，196.3毫克）溶于35.0毫升1,4-二氧六环中。氮气置换3次后，加热回流4小时。反应结束后冷却至室温，抽滤，滤液蒸干溶剂后，通过柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷。得到118.9毫克橙色固体，产率22%。中间体16的核磁：(400 MHz,CHCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ(ppm) 8.29 (d, J = 8.5 Hz, 1H, Ar-H), 8.24 (s,1H, Ar-H), 8.01 (s, 1H, Ar-H), 7.86 (d, J = 8.6 Hz, 1H, Ar-H), 7.79 (d, J =7.6 Hz, 2H, Ar-H), 7.39 (d, J = 7.6 Hz, 2H, Ar-H), 6.01 (s, 2H, Ar-H), 2.57(s, 6H, 2×CH₃), 1.76 (s, 9H, 3×CH₃), 1.47 (s, 6H, 2×CH₃)；(151 MHz, CDCl₃)¹³C NMR (151 MHz, CDCl₃) δ(ppm) 155.6, 149.1, 143.0, 141.3, 141.2, 139.7,139.3 136.0 134.1, 131.4, 128.7, 128.5, 127.8, 126.5, 121.3, 119.2 115.0,85.1, 28.2, 14.6.

取中间体16（0.2mmol，108.1mg）溶于1.0ml三氟乙酸和2.0ml二氯甲烷的溶液中。室温搅拌20分钟后用饱和碳酸钠溶液中和并用三氯甲烷（3×30.0毫升）萃取，收集有机层。加入无水Na₂SO₄干燥后，蒸干溶剂。进行柱层析分离，洗脱剂：二氯甲烷/甲醇（30/1，v/v）得到橙色固体20.1mg，为染料4。核磁共振氢谱(400 MHz, CHCl₃) ¹H NMR (400 MHz, CDCl₃)δ(ppm) ¹H NMR (400 MHz, DMSO)δ13.12 (s, 1H, Ar-H), 8.11 (d, J = 9.9 Hz, 2H, Ar-H), 7.88 (d, J = 6.9 Hz, 2H, Ar-H), 7.74 (d, J = 7.4 Hz, 2H, Ar-H), 7.61 (d,J = 7.8 Hz, 2H, Ar-H), 7.41 (d, J = 7.1 Hz, 2H, Ar-H), 6.15 (s, 2H, Ar-H),2.42 (s, 6H, 2×CH₃), 1.40 (s, 6H, 2×CH₃)。

对上述实施例以及对比例制备的染料在氯仿中（浓度10 μM）的紫外吸收和荧光发射进行了测试，横坐标为波长，纵坐标分别为吸光度和荧光强度，结果如图3至13所示。

在紫外-可见吸收光谱图中，染料1a在378 nm处有最大吸收；在荧光光谱图中，染料1a在452 nm处有最高的荧光强度，此时的激发波长为370 nm，狭缝宽度为3 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1b的最大吸收波长为382 nm；在荧光光谱图中，染料1b的最大发射波长为485 nm，此时的激发波长为374 nm，狭缝宽度为3 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料1c的最大吸收波长为385 nm；在荧光光谱图中，染料1c的最大发射波长为454 nm，此时的激发波长为380 nm，狭缝宽度为3 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料2a在364 nm处有最大吸收；在荧光光谱图中，染料2a在480 nm处有最高的荧光强度，此时的激发波长为374 nm，狭缝宽度为3 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料2b的最大吸收波长为360 nm；在荧光光谱图中，染料2b的最大发射波长为458 nm，此时的激发波长为370 nm，狭缝宽度为3 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料2c的最大吸收波长为356 nm；在荧光光谱图中，染料1c的最大发射波长为441 nm，此时的激发波长为360nm，狭缝宽度为3 nm/3 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料3a在548 nm处有最大吸收；在荧光光谱图中，染料3a在606 nm处有最高的荧光强度，此时的激发波长为560 nm，狭缝宽度为1.5 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料3b的最大吸收波长为549 nm；在荧光光谱图中，染料3b的最大发射波长为608 nm，此时的激发波长为540 nm，狭缝宽度为1.5 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料3c的最大吸收波长为554 nm；在荧光光谱图中，染料3c的最大发射波长为611 nm，此时的激发波长为540 nm，狭缝宽度为1.5 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料3c的最大吸收波长为556 nm；在荧光光谱图中，染料3d的最大发射波长为619 nm，此时的激发波长为570nm，狭缝宽度为1.5 nm/1.5 nm。在紫外-可见吸收光谱图中，染料4的最大吸收波长为501 nm；在荧光光谱图中，染料4的最大发射波长为515 nm，此时的激发波长为495 nm，狭缝宽度为1.5 nm/1.5 nm。以上紫外吸收和荧光发射测试方法为常规方法。

使用DMSO(二甲基亚砜)将染料1a配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得染料1a在细胞培养基中的浓度为1 μM，再分别与L929细胞和HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5%CO₂培养箱共同培养（以下实验相同）10分钟，随后分别加入现有线粒体红色标记物MitoTracker^® Red CMXRos (100 nm)再培养10分钟; 然后经PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。蓝光通道选用405nm激发，收集410-500 nm范围内的荧光信号，红光通道使用561nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。结果表明染料1a在正常细胞和癌细胞中都具有线粒体标记能力，可作为线粒体蓝色标记物。结果如图14所示，其中(a),(g)为明场，(b),(h)为染料1a的细胞成像图，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像图，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加图，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，他们的共定位系数分别为0.90（L929）和0.84（HeLa）。

染料1b、染料1c、染料2a、染料2b、染料2c（都是1 μM）的实验方法与上述染料1a一样，仅将染料1a更换，其余不变。如图15，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料1b的细胞成像，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，共定位系数分别为0.81（L929）和0.83（HeLa）。如图16，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料1c的细胞成像，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，共定位系数均为0.77。如图17，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料2a的细胞成像，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，共定位系数分别为0.79（L929）和0.80（HeLa）。如图18，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料2b的细胞成像，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，共定位系数分别为0.85（L929）和0.79（HeLa）。如图19，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料2c的细胞成像图，(c),(i)为线粒体红色标记物的细胞成像图，(d),(j)为蓝光通道和红光通道的叠加图，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，共定位系数分别为0.82（L929）和0.84（HeLa）。表明染料1b、染料1c、染料2a、染料2b、染料2c在正常细胞和癌细胞中都具有线粒体标记能力，可作为线粒体蓝色标记物。

使用DMSO(二甲基亚砜)将染料3a配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得染料3a在细胞培养基中的浓度为1 μM，再分别与L929细胞和HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5%CO₂培养箱共同培养（以下实验相同）10分钟，随后分别加入现有线粒体绿色标记物MitoTracker^® Green FM (100 nm)再培养10分钟; PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。绿光通道使用488 nm激发，收集500-550 nm范围内的荧光信号。结果表明染料3a在正常细胞和癌细胞中都具有线粒体标记能力，可作为线粒体红色标记物。结果如图20所示，其中(a),(g)为明场，(b),(h)为染料3a的细胞成像图，(c),(i)为线粒体绿色标记物的细胞成像图，(d),(j)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，他们的共定位系数分别为0.91（L929）和0.90（HeLa）。

染料3b（1 μM）、染料3c（1 μM）的实验方法与上述染料3a一样，仅将染料3a更换，其余不变。结果表明染料3b、染料3c在正常细胞和癌细胞中都具有线粒体标记能力，可作为线粒体红色标记物。如图21，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料3b的细胞成像图，(c),(i)为线粒体绿色标记物的细胞成像图，(d),(j)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，他们的共定位系数分别为0.88（L929）和0.90（HeLa）。如图22，(a),(g)为明场，(b),(h)为染料3c的细胞成像图，(c),(i)为线粒体绿色标记物的细胞成像图，(d),(j)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e),(k)为叠加图中ROI线的荧光强度，(f),(l)为共定位实验，他们的共定位系数分别为0.89（L929）和0.87（HeLa）。

使用DMSO(二甲基亚砜)将染料3d配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得染料3d在细胞培养基中的浓度为1 μM，再分别与L929细胞和HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5%CO₂培养箱共同培养10分钟，随后分别加入线粒体绿色标记物Mito Tracker^® Green FM(100 nm)和脂滴绿色标记物（合成参见：Chen, Y.; Wei, X. R.; Sun, R.; Xu, Y. J.;Ge, J. F. Org Biomol Chem2018, 16, 7619.）再培养10分钟; PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm激发，收集570-750 nm范围内的荧光信号。绿光通道采用488 nm激发，收集500-550 nm范围内的荧光信号。结果表明，染料3d同时标记了线粒体和脂滴两个细胞器，不适合作为线粒体标记物进行细胞成像。如图23所示，其中(a),(f)为明场，(b),(g)为染料3d的细胞成像图，(c)为脂滴绿色标记物的细胞成像图，(h)为线粒体绿色标记物的细胞成像图，(d),(i)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e),(j)为叠加图中ROI线的荧光强度。如图24所示，其中(a),(f)为明场，(b),(g)为染料3d的细胞成像图，(c)为脂滴绿色标记物的细胞成像图，(h)为线粒体绿色标记物的细胞成像图，(d),(i)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e),(j)为叠加图中ROI线的荧光强度。

使用DMSO将染料4配制成母液，随后加入常规细胞培养基中，使得染料4在细胞培养基中的浓度为1 μM，再与HeLa细胞在饱和湿度、37℃、5%CO₂培养箱共同培养10分钟，随后加入线粒体红色标记物Mito Tracker^® Red CMXRos (100 nm)再培养10分钟; PBS缓冲液洗三次后，利用激光共聚焦显微镜进行细胞成像。红光通道使用561nm激发，收集570-750nm范围内的荧光信号。绿光通道采用488 nm激发，收集500-550 nm范围内的荧光信号。结果表明，染料4不能与线粒体红色标记物进行很好的叠加，不可作为线粒体标记物进行细胞成像。如图25所示，(a)为明场，(b)为染料4的细胞成像图，(c)为线粒体红色标记物的细胞成像图，(d)为红光通道和绿光通道的叠加图，(e)为叠加图中ROI线的荧光强度。

采用常规CCK-8法测试实施例制备的染料细胞毒性，测试时间为6小时，采用美仑CCK-8细胞增殖毒性检测试剂盒，结果显示，染料浓度为2μM至10μM时（DMSO为溶剂），L929细胞和HeLa细胞的存活率都大于95%。