阅读说明：本技术 一种尿酸检测专用微流控纸芯片及检测分析方法 (Special micro-fluidic paper chip for uric acid detection and detection analysis method ) 是由 刘青叶 张剑 苗延青 靖会 于 2020-03-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种用于尿酸检测的微流控纸芯片及尿酸检测方法。纸质微流控芯片由纸基和沉积在纸基上的疏水材料构成；使用喷蜡打印机打印纸芯片文档,再于热压机上得测试用纸芯片。用纸质微流流控芯片对尿酸进行含量测定的方法采取微流控纸芯片技术对尿酸进行含量测定,利用尿酸的还原性,以三氯化铁为氧化剂组成氧化还原体系,以邻二氮菲对反应产物Fe<Sup>2+</Sup>进行显色,根据显色强度对尿酸含量进行检测,包括8大步骤：同现有技术相比,样品用量少、准确、简便、快速、重复性好,可用于血浆中尿酸的含量检测。表明此发明所用方法可靠、有效。此发明对尿酸的临床检测及相关疾病预防具有较为深远的意义。(The invention relates to a micro-fluidic paper chip for uric acid detection and a uric acid detection method. The paper microfluidic chip consists of a paper base and a hydrophobic material deposited on the paper base; and printing a paper chip document by using a wax-spraying printer, and then obtaining a paper chip for testing on a hot press. The method for measuring the content of uric acid by using a paper microfluidic chip adopts the microfluidic paper chip technology to measure the content of uric acid, utilizes the reducibility of uric acid, takes ferric chloride as an oxidant to form an oxidation-reduction system, and takes o-diazepine phenanthrene as a reaction product Fe 2+ Carrying out color development, and detecting the content of uric acid according to color development intensity, comprising 8 steps: compared with the prior art, the method has the advantages of less sample dosage, accuracy, simplicity, convenience, rapidness and good repeatability, and can be used for detecting the content of uric acid in blood plasma. The method is reliable and effective. The invention has far-reaching significance for clinical detection of uric acid and prevention of related diseases.)

一种尿酸检测专用微流控纸芯片及检测分析方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，涉及一种检测分析专用微流控纸芯片及检测方法，特别涉及一种用于尿酸检测的微流控纸芯片及尿酸检测方法。

背景技术

在药物分析技术中，根据各种被分析物的检测方法众多。仅就尿酸检测方法，在本发明以前的现有技术中，文献报道过的就有酶法、尿酸生物传感器检测法、伏安法、高效液相色谱法、磷钨酸还原法等。酶法操作简便,样品处理简单,但操作过程复杂。尿酸生物传感器检测法的发展和酶固定化技术的迅速发展密切相关。酶固定化技术是制作酶电极的关键,它对电极的各项性能起决定作用,目前已开发了吸附法、载体偶联法、交联法和包埋法等各种固定的方法。伏安法是目前常用的检测尿酸的方法,近年来,伏安法检测尿酸在理论研究和实际运用于临床诊断上都取得了很大的发展。高效液相色谱检测法虽然简单,但常常需要繁琐的样品预处理或使用复杂的柱切换设备。磷钨酸还原法操作简单,准确性好,是经典的临床检验方法,也是最常用的检测方法。近年来用于各种分析检测目的的微流控芯片技术发展很快，如电泳芯片、硅基微通道芯片、液滴发生芯片、细胞芯片、纸芯片等。纸质微流控芯片是微流控分析系统的新成员，与普通意义上的微流控芯片相比，它成本低、制备简便、无需复杂外围设备，能够进行真正意义上一次性、价格低廉、便携式的分析，已经越来越受到关注，被普遍视为未来现场实时诊断发展趋势之一。此方法相对于其他传统方法具有分析速度快、耗低，物耗少，污染小，廉价，安全等优点。由于它在生物、化学、医学等领域的巨大潜力，已经发展成为一个生物、化学、医学、流体、电子、材料、机械等学科交叉的崭新研究领域。目前，本发明所用纸芯片及其检测尿酸方法尚未见相关报道。

发明内容

针对上述现有技术状况，本发明的目的，首先提供一种专用于尿酸检测的纸质微流控芯片，本发明的另一个目的是提供一种用该纸芯片进行尿酸检测分析的方法。

现将本发明构思及技术解决方案叙述如下：

本发明的基本构思是，利用纸质微流控芯片成本低、制备简便、无需复杂外围设备，能够进行真正意义上的一次性、价格低、便携式的检测分析特点，设计一种专用于动物尿液的尿酸检测分析的纸质微流控芯片；同时利用尿酸的还原性，以三氯化铁为氧化剂组成氧化还原体系，以邻二氮菲对反应产物Fe²⁺进行显色，根据显色强度对尿酸含量进行检测分析的专用方法。

本发明一种专用于尿酸测定的纸质微流控芯片，其特征在于：由纸基和沉积在纸基上的疏水材料构成；所述的纸基采用空隙率低、孔径小、且分布均匀的色谱纸，或者采用硝基纤维滤膜以适用血尿酸和尿尿酸的检测；所述的疏水材料采用蜡；使用喷蜡打印机，通过电脑安装的绘图软件，根据所设计得微流控纸芯片的微通道网络(见附图1)，在色谱纸上根据设计好的微流控纸芯片的微通道网络打印纸芯片文档，再于热压机上得测试用纸芯片。

本发明进一步提供一种专用于尿酸测定的纸质微流控芯片，其特征在于：所述的纸基孔隙率在65～85％之间；所述的纸基孔径在10μm～11μm之间；所述的色谱纸为：厚度180μm，基本重量88g/m²，空气流速10.5s/100mL/in²，灰份含量0.06％，拉伸模量39.1N/15mm，最低α-纤维素含量98％的纤维素纸；所述的硝基纤维滤膜为：孔径0.7～0.8μm，厚度105～140μm，爆裂强度＞2psi，重量3.6～5.5mg/cm²，最高操作温度80℃，孔隙率66～84％，经蒸汽高压灭菌的亲水性滤膜。

本发明进一步提供一种专用于尿酸测定的纸质微流控芯片，其特征在于：样品加载区I和II直径4mm，检测区III直径6mm，I区与III区之间通道长度7mm，通道宽度2mm，尿酸溶液和显色剂分别在I区和II区进行加载，在毛细作用下相向移动，于III区混合并反应。

本发明还同时提供一种用纸质微流流控芯片对尿酸进行含量测定的方法，包括以下步骤：

步骤1：采用绘图软件，设计出微流控纸芯片的微通道网络，使用喷蜡打印机、在色谱纸上打印设计好的纸芯片文档，再于热压机上加热得实验用纸芯片；

步骤2：检测前配制尿酸储备液、磷酸缓冲液、FeCl₃溶液和邻二氮菲溶液；

步骤3：分别在反应时间1～20min、显色剂pH5～8、尿酸和三氯化铁比例1:1.2～1:2条件下进行检测，得到最佳检测条件；

步骤4：检测前制作尿酸标准曲线

取尿酸储备液分别稀释成1.19mmol/L、2.38mmol/L、3.57mmol/L、4.76mmol/L、5.95mmol/L，再以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应；

步骤5：绘制RGB(红R、绿G、蓝B)值与浓度之间的工作曲线；

步骤:6：对动物血清中尿酸的含量进行检测；

步骤7：不加尿酸溶液的血清作为空白对照号，加入不同尿酸标准品后所得样品溶液分别与FeCl₃混合反应后，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应；

步骤8：计算血清中的尿酸的回收率。

本发明同现有技术相比，制作的纸芯片用于尿酸的测定无需进行特殊的样品预处理，可直接进行定量分析，与基于紫外分光光度法检测尿酸含量的结果进行对比，样品用量少、准确、简便、快速、重复性好，可用于血清中尿酸的含量检测。表明此发明所用方法可靠、有效。此发明对尿酸的临床检测及相关疾病预防具有较为深远的意义。

附图说明

图1：微通道纸芯片设计(A)单通道纸芯片设计(B)空白对照纸芯片(C)样品检测纸芯片(D)六通道纸芯片(E)八通道纸芯片(F)

图2：反应时间对显色反应影响

图3：pH值对显色反应影响

图4：FeCl₃与尿酸的比例对显色反应影响

图5：最低检测限测定

图6：基于纸芯片建立标准曲线

图7：干扰离子的影响

图8：尿酸检测的重复性实验

图9：加样回收

图10：动物血清中尿酸的含量测定

具体实施方式

下面结合附图对本发明具体实施方式作进一步详细说明。

实施例1：

步骤1，采用inkscape-0.91绘图软件，设计出微流控纸芯片的微通道网络，使用喷蜡打印机、在色谱纸上打印设计好的纸芯片文档，再于热压机上于176.7℃+2℃下加热120秒+5秒，得实验用纸芯片；

步骤2：检测前配制尿酸储备液(59.49mmol/L)、磷酸缓冲液(20mmol/L)、1％FeCl₃溶液和0.2％邻二氮菲溶液；

步骤3：分别在反应时间1～20min、显色剂pH5～8、尿酸和三氯化铁比例1:1.2～1:2条件下进行检测，得到最佳检测条件；

步骤4：检测前制作尿酸标准曲线

取尿酸储备液分别稀释成1.19mmol/L、2.38mmol/L、3.57mmol/L、4.76mmol/L、5.95mmol/L，再以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应；

步骤5：绘制RGB值与浓度之间的工作曲线

精密吸取6μL样品溶液缓慢滴至图1B中的上样区I，待其扩散至检测区III时，精密移取6μL显色剂溶液加载至II区，两种溶液在III区相遇反应并显色,显色效果在photoshopCS5分析，得RGB值；以RGB为纵坐标，尿酸浓度为横坐标，绘制工作曲线；

步骤:6：对动物血清中尿酸的含量进行检测

取血清0.1mL，加入0.2mL乙腈，振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，再次振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，氮气挥干溶剂，用去离子水溶解并定容至4mL。所得样品溶液与FeCl₃以1:1.6混合反应10min后，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应；显色效果在photoshop CS5分析，得RGB值，代入工作曲线，计算血清中尿酸含量。

步骤7：计算血清中的尿酸的回收率

不加尿酸溶液的血清作为空白对照0号，A-C为加入不同尿酸标准品后所得样品溶液分别与FeCl₃以1:1.6混合反应10min后，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应；计算回收率。

实施例2：

参见图1、结合步骤1、步骤2：

步骤1，采用inkscape-0.91绘图软件，设计出微流控纸芯片的微通道网络，其中(A)为可多个式样同时进行的多通道设计；(B)单通道设计；(C)为空白对照通道设计；(D)为样品检测通道设计；

步骤2，精密吸取6μL样品溶液缓慢滴至附图1B中的上样区I，待其扩散至检测区III时，精密移取6μL显色剂溶液加载至II区，两种溶液在III区相遇反应并显色,显色效果在photoshop CS5分析，得RGB值，可绘制RGB值与浓度的曲线。该设计可使显色均匀，克服了色带在疏水通道壁堆积的“贴壁”现象，保证了方法的可靠性，图形E和F中区域直径及通道尺寸均与图形A相同。

实施例3：

参见图2、3、4、结合步骤3：

步骤3，分别在反应时间1～20min、显色剂pH5～8、尿酸和三氯化铁比例1:1.2～1:2条件下进行检测，得到最佳检测条件。

实施例4：

参见图5，结合步骤3：最低检测限试验

取尿酸储备液分别稀释后并标号，以1:1.6的比例与三氯化铁反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，结果得到纸芯片检测尿酸的最低检测限为0.236μmol/L。

实施例6：

参见图6，结合步骤3、4、5：微流控纸芯片检测尿酸溶液抗干扰离子影响试验

取尿酸储备液将其稀释成一定浓度的尿酸溶液，取0.5ml离心管14个分别标号0-13。0号不加共存离子，1-13号分别与1000倍量的氯化钠溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、亚硫酸锌溶液、硝酸铝溶液，100倍量的氯化铵溶液、淀粉溶液、葡萄糖溶液，10倍量的硫酸锌溶液、氯化钙溶液、氯化钡溶液、无水碳酸钠溶液，等倍量的维生素C溶液和多巴胺溶液。干扰离子分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，结果表明，Na⁺、K⁺、SO₄ ^2-、SO₃ ^2-、NO₃ ^-、NH₄ ⁺、淀粉、葡萄糖、Zn²⁺、Ca²⁺、Ba²⁺、CO₃ ^2-、Vc和多巴胺等14种干扰物质的误差都在5％范围内，不会影响尿酸的含量测定。

实施例7：

参见图8，结合步骤3、4、5、6：尿酸检测的重复性实验

取尿酸储备液稀释成四个不同浓度，分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，可知不同浓度的尿酸的日内平均精密度为0.42％，日间平均精密度为0.47％。

实施例8：

参见图9，结合步骤6、7、8：尿酸检测加样回收实验

取尿酸样品溶液(5.9×10^-2mol/L)液稀释成1.78mmol/L，精密移取1mL，分别标号1-3，分别加入0.15mg、0.3mg、0.45mg尿酸标准品；取尿酸样品溶溶液液(5.9×10^-2mol/L)稀释成3.56mmol/L，精密移取1mL，分别标号4-6，分别加入0.3mg、0.6mg、0.9mg尿酸标准品；取尿酸样品溶溶液液(5.9×10^-2mol/L)稀释成5.34mmol/L，精密移取1mL，分别标号7-9，分别加入0.45mg、0.9mg、1.35mg尿酸标准品。

1-9分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应。低、中、高三种浓度的尿酸的回收率分别为99.97％、98.85％、99.24％。

实施例9：

参见图10，结合步骤6：对动物血清中尿酸的含量进行检测

取血清样品0.1mL，加入0.2mL乙腈，振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，再次振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，氮气挥干溶剂，定容至4mL；在纸芯片上进行检测，得RGB值，代入工作曲线，计算血清中尿酸含量；通过计算得血清中尿酸的含量为0.238mmol/L。

实施例10：

参见图10，结合步骤6、7、8：对血清中的尿酸的回收率进行测定：

取尿酸储备液3份，各加入血清0.1mL，0.2mL乙腈，振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，再次振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，氮气挥干溶剂，定容至4mL(此处为样品的前处理步骤)；不加尿酸溶液的血清作为空白对照0号，A-C为加入不同尿酸标准品后所得样品溶液分别与FeCl₃以1:1.6混合反应10min后，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，血清中的尿酸的回收率为96.53％。

实施例11：

加样回收实验：取尿酸样品溶液进行加样回收实验，对紫外分光光度法进行准确性考察，结果显示，低中高三种不同浓度的尿酸的加样回收率分别为99.39％、98.84％、99.08％，说明该方法准确性良好。

紫外法检测动物血清中尿酸含量试验：取尿酸储备液，稀释到分别置于7个1.5mL离心管中，分别标号0-6，各加入血清0.1mL，0号加入0.1mL去离子水，1-6号分别加入0.1mL尿酸，0-6号分别加入0.2mL乙腈，振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，再次振荡离心10min(1000r/min)，取上清液，氮气挥干溶剂；0号作为空白对照，1号用去离子水溶解后，稀释为4mL并从新标号为A号，2号和3号混合后用去离子水溶解后，稀释为4mL并从新标号为B号，4号、5号和6号混合后用去离子水溶解后，稀释为4mL并从新标号为C号，A-C号分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应，与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应运用紫外分光光度计对其分析，分析结果表明，血清中尿酸回收率为89.58％，紫外检测法无法计算出空白血清中的尿酸含量。

确定反应时间：精密移取尿酸储备液200μL、FeCl₃溶液400μL混合，分别反应1min、5min、10min、15min、20min，根据纸芯片上随时间变化显色强度变化，确定最佳尿酸检测反应时间为9min～11min；

确定显色剂FeCl₃、邻二氮菲溶液的pH值；精密移取尿酸储备液200μL、FeCl₃溶液400μL混合反应10min，在纸芯片上与邻二氮菲等比例反应，pH不同，纸芯片上显色强度也随之变化，根据显色强度变化，确定显色剂pH值为7.3～7.5。

实施例12：

参见图4、结合步骤4、5：确定显色剂FeCl₃、邻二氮菲溶液的浓度范围

精密移取尿酸储备液100μL、分别与FeCl₃溶液120μL、140μL、160μL、180μL、200μL(比例1:1.2、1:1.4、1:1.6、1:1.8、1:2)混合反应10min。在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，反应结果见图4，由图4可见，比例不同，纸芯片上显色强度也随之变化，确定FeCl₃的百分浓度范围为：0.60％～0.62％，邻二氮菲溶液的百分浓度范围为：0.1％～0.2％。

实施例13：

参见图5、步骤4、步骤5：最低检测限考察

取尿酸储备液分别稀释成5.9×10^-1mmol/L、5.9×10^-2mmol/L、5.9×10^-3mmol/L、5.9×10^-4mmol/L、5.9×10^-5mmol/L、1.18×10^-4mmol/L、1.77×10^-4mmol/L、2.36×10^{- 4}mmol/L、2.85×10^-4mmol/L、3.42×10^-4mmol/L、3.92×10^-4mmol/L、4.39×10^-4mmol/L、4.96×10^-3mmol/L、5.90×10^-4mmol/L，分别以1:1.6的比例与三氯化铁反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，结果见附图5；

实施例14：

参见图7、结合步骤4、5：溶液干扰离子的影响

图7中，从左至右依次为：未加干扰离子(UA)；加入1000倍量Na+、K+、SO42-、SO32-、NO3-；加入100倍量NH4+、淀粉、葡萄糖；加入10倍量Zn2+、Ca2+、Ba2+、CO32-；及等倍量Vc和多巴胺；

取尿酸储备液将其稀释成一定浓度的尿酸溶液，取0.5mL离心管14个分别标号0-13，0号不加共存离子，1-13号分别与1000倍量的氯化钠溶液、氯化钾溶液、硫酸钠溶液、亚硫酸锌溶液、硝酸铝溶液，100倍量的氯化铵溶液、淀粉溶液、葡萄糖溶液，10倍量的硫酸锌溶液、氯化钙溶液、氯化钡溶液、无水碳酸钠溶液，等倍量的维生素C溶液和多巴胺溶液，干扰离子分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，结果见附图7；

实施例15：

参见图8、结合步骤4、5：尿酸的重复性实验

图8A中，1-4尿酸浓度依次为1.49μmol/L、3.68μmol/L、3.87μmol/L、5.06μmol/L，图8B中RGB依次为0.77％、0.39％、0.46％及0.27％；

取尿酸储备液稀释成四个不同浓度，分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应，重复进样结果见附图8，可知不同浓度的尿酸的日内平均精密度为0.42％(图8A)、日间平均精密度为0.47％(图8B)；

实施例16：

参见图9、结合步骤4、5：加样回收实验

图9中：1-3样品中尿酸含量分别为0.3mg、0.6mg、0.9mg；

取尿酸样品溶溶液液(5.9×10^-2mol/L)液稀释成1.78mmol/L，精密移取1mL，分别标号1-3，分别加入0.15mg、0.3mg、0.45mg尿酸标准品；取尿酸样品溶溶液液(5.9×10^-2mol/L)稀释成3.56mmol/L，精密移取1mL，分别标号4-6，分别加入0.3mg、0.6mg、0.9mg尿酸标准品；取尿酸样品溶溶液液(5.9×10^-2mol/L)稀释成5.34mmol/L，精密移取1mL，分别标号7-9，分别加入0.45mg、0.9mg、1.35mg尿酸标准品；1-9分别以1:1.6的比例与FeCl₃反应10min，在纸芯片上与pH7.4邻二氮菲显色剂等比例反应。