阅读说明：本技术 一种细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法 (Method for detecting phosphorylation level of tyrosine in cell ) 是由 范子彦 熊巍 杨飞 陶晓秋 王颖 唐纲岭 卫民 庞夙 于 2020-04-24 设计创作，主要内容包括：本发明公开一种细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法,包括如下步骤：烟气冷凝物制备、细胞处理、免疫荧光标记与样品处理、检测。本发明通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平,用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响,对烟气成分的安全性进行生物学评价,反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。(The invention discloses a method for detecting intracellular tyrosine phosphorylation level, which comprises the following steps: preparing a smoke condensate, processing cells, carrying out immunofluorescence labeling and sample processing, and detecting. The method is used for evaluating the influence of smoke exposure on the oxidative stress reaction of cells by researching the active oxygen concentration level in the cells after the smoke exposure, biologically evaluating the safety of smoke components, and reversely providing scientific reference for the research and development and production of safe cigarettes.)

一种细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法

技术领域

本发明属于细胞内磷酸化络氨酸的生化分析技术领域，涉及细胞内磷酸化络氨酸的检测方法。

背景技术

吸烟引起基因损伤、蛋白异常表达、外源性化合物代谢异常等多个生理反应，表观反映是多个生物效应的发生，如氧化应激、炎症反应、细胞内络氨酸磷酸化等。

流式细胞术(Flow cytometry，FCM)是一种集合了光学、电子学、流体力学、细胞化学、免疫学和计算机科学等多门学科和技术为一体的细胞分析技术，其不受分子生物学异常的影响，可以直观地对细胞内磷酸化络氨酸进行准确定量分析。

吸烟引起基因损伤、蛋白异常表达、外源性化合物代谢异常等多个生理反应，表观反映是多个生物效应的发生，如氧化应激、炎症反应、外源物质代谢异常等。发明人希望通过研究烟气暴露后细胞内的活性氧浓度水平，用于评估烟气暴露对细胞的氧化应激反应的影响，对烟气成分的安全性进行生物学评价，反向为安全卷烟的研发和生产提供科学参考。目前，还未有相关的研究。

发明内容

针对上述情况，本发明提供了一种细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法，包括如下步骤：

步骤1)烟气冷凝物制备：

按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用吸烟机抽吸，收集烟气总粒相物，根据烟气总粒相物的质量加入相应体积的DMSO，得到烟气总粒相物储备液；

步骤2)细胞处理：细胞铺板，过夜培养；用添加烟气冷凝物的细胞培养基继续培养1 小时；

步骤3)免疫荧光标记与样品处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤；加入70％乙醇溶液进行固定，低温过夜；使用PBS洗涤，使用含有triton-X100的PBS溶液透化，PBS清洗；加入荧光标记的磷酸化抗体37℃反应，加入胰酶消化，使用培养基终止消化；分离出细胞并重新分散，待流式细胞仪测定；

步骤4)检测：使用流式细胞仪检测对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析1×10⁴个细胞；或者，使用激光共聚焦显微镜对荧光标记的磷酸化抗体的染色强度进行检测。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤1) 中，用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤1) 中，用剑桥滤片收集烟气总粒相物。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤2) 中，铺板细胞密度为2.5×10⁵cells/mL。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤2) 中，分离细胞的具体方式为，终止消化后，加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3-5次。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤3) 中，荧光标记的磷酸化抗体是Cy3标记的磷酸化酪氨酸抗体。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤4) 中，使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤2) 具体为：细胞密度为2.5×10⁵cells/mL进行铺板，过夜培养；分别添加ISO和HCI抽吸条件下分别制备的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤3) 中，加入荧光标记的磷酸化抗体前，先使用羊血清37℃封闭30分钟。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤3) 具体为：处理后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟；加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜；使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-100的PBS溶液透化10分钟，PBS清洗三次；加入荧光标记的磷酸化抗体37℃反应1h，加入胰酶消化，使用培养基终止消化；加入1mLPBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。

根据本发明细胞内络氨酸磷酸化水平的检测方法的一个进一步实施方式，所述步骤4) 具体为：使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析1×10⁴个细胞。

本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。

本发明检测方法的一个实施方式中，通过Cy3标记的特异抗体对细胞内的磷酸化络氨酸进行荧光标记，使用激光共聚焦显微镜实时观察胞内荧光信号的变化，实现磷酸化过程中监控，进一步获取不同暴露条件下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

附图说明

图1为利用流式细胞仪检测不同抽吸模式得到的不同浓度的烟气冷凝物刺激下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

图2为KB口腔细胞系的典型细胞形态(上图为485nm，下图为505nm)。

图3为加拿大深度抽吸模式下制备的烟气冷凝物暴露后细胞内酪氨酸磷酸化水平的可视化检测(冷凝物浓度为40μg/mL，上图是CY3检测器，下图是CY5检测器)。

图4为ISO抽吸模式下制备的烟气冷凝物暴露后细胞内酪氨酸磷酸化水平的可视化检测 (冷凝物浓度为40μg/mL，上图是CY3检测器，下图是CY5检测器)。

图5为加拿大深度抽吸模式下制备的烟气冷凝物暴露后细胞内酪氨酸磷酸化水平的可视化检测(冷凝物浓度为80μg/mL，上图是CY3检测器，下图是CY5检测器)。

图6为ISO抽吸模式下制备的烟气冷凝物暴露后细胞内酪氨酸磷酸化水平的可视化检测 (冷凝物浓度为80μg/mL，上图是CY3检测器，下图是CY5检测器)。

具体实施方式

下面将结合附图和具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。除非另有说明，下列实施例中所使用的药品、试剂、仪器均可通过商业手段获得。

实施例一

采用流式细胞仪检测不同抽吸模式的低浓度烟气冷凝物暴露下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在 ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，烟气总粒相物(Total Particulate Matter，TPM)用 mm剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的 TPM储备液；

细胞染毒：细胞密度为2.5×10⁵cells/mL进行铺板，过夜培养。分别添加120μg/mL(ISO 和HCI抽吸条件下分别制备)的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时；

免疫荧光标记与样品处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10分钟，PBS清洗三次。加入10μg/mL荧光标记的磷酸化抗体37℃反应1h，加入胰酶消化，使用培养基终止消化。加入1mL PBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落， 2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。

检测：使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析1×10⁴个细胞。

实施例二

采用流式细胞仪检测不同抽吸模式的高浓度烟气冷凝物暴露下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在 ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，烟气总粒相物(Total Particulate Matter，TPM)用 mm剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的 TPM储备液；

细胞染毒：细胞密度为2.5×10⁵cells/mL进行铺板，过夜培养。分别添加300μg/mL(ISO 和HCI抽吸条件下分别制备)的烟气冷凝物的细胞培养基进行细胞培养1小时；

免疫荧光标记与样品处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-X100的PBS溶液透化10分钟，PBS清洗三次。加入荧光标记的磷酸化抗体37℃反应1h，加入胰酶消化，使用培养基终止消化。加入1mL PBS溶液，吹打培养板底部，使细胞脱落，2500转/分钟离心，重复操作3次，重新分散待流式细胞仪测定。

检测：使用流式细胞仪检测在488nm和530nm条件下对荧光探针的染色强度进行检测，检测前进行三色荧光补偿，检测时用CD45-PerCP/SSC设门，用于将异常细胞群与正常细胞群分开，将异常细胞群圈出设门后，每份样品捕获分析1×10⁴个细胞。

为了比较两种抽吸模式制备的烟气冷凝物对细胞内酪氨酸磷酸化的影响，采用流式细胞仪对细胞内的磷酸化酪氨酸进行定量。结果如图1所示，在同时计数10000个细胞的情况下，细胞内的酪氨酸磷酸化水平逐渐增加，而且ISO模式下酪氨酸磷酸化水平增加的幅度大于 HCI模式。图1中，HCI120:表示加入120μg/mL HCI抽吸模式下收集的烟气冷凝物；HCI300: 表示加入300μg/mL HCI抽吸模式下收集的烟气冷凝物；ISO120:表示加入120μg/mL ISO抽吸模式下收集的烟气冷凝物；ISO300:表示加入300μg/mL ISO抽吸模式下收集的烟气冷凝物；KB：表示空白对照组，为加入烟气冷凝物染毒。

由上述实施例可以看出，本发明的检测方法中的操作步骤简单、便捷，检测周期短，仅需数小时即可完成检测，极大地缩短了检测周期，有利于加快相关研究的进度，节省了时间成本。

实施例三

采用激光共聚焦显微镜检测不同抽吸模式的低浓度烟气冷凝物暴露下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，TPM用剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的TPM储备液。

细胞培养及处理：人口腔表皮样癌KB细胞培养于含10％胎牛血清的a-MEM完全培养基中，在37℃，5％CO₂条件下培养。当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度至4×10⁴个/mL，按每孔100μL接种到96孔板，过夜培养。加入含有40μg/mL烟气冷凝物染毒培养1个小时。

染毒细胞处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-100的PBS溶液透化10min，PBS清洗三次。使用羊血清37℃封闭30分钟，加入荧光标记的磷酸化抗体37℃反应1h， PBS清洗三次，晾干封片，待激光共聚焦显微镜测定；

检测：使用激光共聚焦显微镜对荧光标记的磷酸化抗体的染色强度进行检测；

通过激光共聚焦显微镜检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下络氨酸磷酸化蛋白在口腔细胞表面表达，其结果如图3/图4所示。与空白相比(图2)，ISO和HCI模式下低浓度烟气冷凝物刺激后，细胞内酪氨酸磷酸化水平显著增加。

实施例四

采用激光共聚焦显微镜检测不同抽吸模式的高浓度烟气冷凝物暴露下细胞内酪氨酸磷酸化水平。

烟气冷凝物制备：按照GB/T 5606.1—2004抽取卷烟样品，并用RM20H转盘型吸烟机在 ISO和HCI两种抽吸条件下分别抽吸，TPM用剑桥滤片收集，根据TPM的质量加入相应体积的DMSO，得到最终浓度为10mg/mL的TPM储备液。

细胞培养及处理：人口腔表皮样癌KB细胞培养于含10％胎牛血清的a-MEM完全培养基中，在37℃，5％CO₂条件下培养。当细胞汇合率为70％～80％时，用胰酶消解，培养基重悬制成单细胞悬液，调节细胞浓度至4×10⁴个/mL，按每孔100μL接种到96孔板，过夜培养。加入含有80μg/mL烟气冷凝物染毒培养1个小时。

染毒细胞处理：染毒后的细胞使用PBS洗涤三次，每次三分钟。加入70％乙醇溶液进行固定，4℃过夜。使用PBS洗涤三次后，使用含有1％triton-100的PBS溶液透化10min，PBS清洗三次。使用羊血清37℃封闭30分钟，加入荧光标记的磷酸化抗体37℃反应1h，PBS清洗三次，晾干封片，待激光共聚焦显微镜测定；

检测：使用激光共聚焦显微镜对荧光标记的磷酸化抗体的染色强度进行检测；

通过激光共聚焦显微镜检测不同抽吸模式得到的烟气冷凝物刺激下络氨酸磷酸化蛋白在口腔细胞表面表达，其结果如图5/图6所示。与低浓度烟气冷凝物的刺激相比(图3/图4)， ISO和HCI模式下高浓度烟气冷凝物刺激后，细胞内酪氨酸磷酸化水平逐渐增加，并且随烟气冷凝物浓度的增加而表达量增加。

本发明使用标记有Cy3的磷酸化酪氨酸抗体对细胞内的磷酸化酪氨酸进行表征，利用激光共聚焦显微镜构建了一种细胞内酪氨酸磷酸化水平的可视化分析检测技术，该技术可以有效地可视化研究烟气暴露后细胞内的酪氨酸磷酸化水平，用于评估烟气暴露对细胞的蛋白质磷酸化的影响，为吸烟的致病机制研究提供技术支撑。

本发明通过细胞内酪氨酸磷酸化水平的检测，可对烟气的安全性进行评价，指导卷烟生产方对烤烟的生产调制工艺进行调整。