阅读说明：本技术 高荧光铜纳米簇-铈（iii）荧光探针及其制备方法和应用 (High-fluorescence copper nanocluster-cerium (III) fluorescent probe and preparation method and application thereof ) 是由 梅鹤 王学东 周佩佩 黄宏 廖忠鹭 聂天银 吕梦雨 马伟 于 2020-04-30 设计创作，主要内容包括：本发明公开高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针及其制备方法和应用,属于荧光传感技术领域。基于过氧化氢能使铜纳米簇-铈(III)荧光探针的荧光发生线性猝灭的现象,将其用于构建过氧化氢和葡萄糖的荧光传感器。本发明采用了金属阳离子铈(III)增强谷胱甘肽稳定的铜纳米簇的荧光特性的方法,操作简单,荧光增强程度显著,用于过氧化氢和葡萄糖的检测时具有响应速度快,线性范围宽的特点,可实现过氧化氢和葡萄糖的可视化检测。(The invention discloses a high-fluorescence copper nanocluster-cerium (III) fluorescent probe as well as a preparation method and application thereof, and belongs to the technical field of fluorescence sensing. The method is used for constructing the fluorescent sensor of hydrogen peroxide and glucose based on the phenomenon that hydrogen peroxide can linearly quench the fluorescence of the copper nanocluster-cerium (III) fluorescent probe. The method for enhancing the fluorescence characteristic of the copper nanocluster stabilized by the glutathione by using the metal cation cerium (III) is simple to operate, has obvious fluorescence enhancement degree, has the characteristics of high response speed and wide linear range when being used for detecting the hydrogen peroxide and the glucose, and can realize the visual detection of the hydrogen peroxide and the glucose.)

高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于荧光传感技术领域，具体是指高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针及其制备方法和在过氧化氢和葡萄糖检测的应用。

背景技术

糖尿病以持续高血糖为临床特征，可使多种组织和脏器(眼、肾、心脏等)的功能受损或衰竭。由于缺少有效的治疗方法，只有实时监测并严格地控制血糖浓度，才能减少并发症的发生。过氧化氢是氧活性物种中具有代表性的一种，体内过量的过氧化氢会引起各种生物损伤，如衰老、阿尔茨海默病、神经退行性变，甚至癌症。因此，开发高灵敏、高选择性、快速的葡萄糖、过氧化氢的检测方法对疾病的预防、诊断和监控是至关重要的。荧光传感器法具有灵敏度高、选择性好、响应速度快、操作简单等优点而被广泛地研究和开发。

金属纳米簇是由几个至几百个金属原子组成的，具有优异的光稳定性，大的斯托克位移，这有利于提高荧光传感器的灵敏度，避免背景荧光和激发光的干扰。与金纳米簇、银纳米簇相比，由于制备铜纳米簇的前驱体原料丰富且价格便宜，研究者致力于研究制备不同发射波长和良好荧光特性的铜纳米簇及其应用。虽然基于铜纳米簇的荧光传感器表现出良好的灵敏度和选择性，但是所制备的铜纳米簇的发光性能较差，荧光量子产率较低(通常小于10％)，这不利于铜纳米簇的实际运用和拓展。

聚集诱导发光是指一类溶液中不发光或者发光微弱的分子聚集后发光显著增强的现象，是唐本忠院士团队于2001年偶然发现的。聚集诱导发光是因为分子内部的运动在聚集状态下受到限制而使荧光强度增强，解决了荧光探针应用效率降低的难题，可降低背景、提高信噪比和灵敏度。锌离子、铝离子等常用于诱导铜纳米簇发生聚集诱导效应，导致铜纳米簇的荧光得到显著的提高。然而以铈(III)离子作为诱导剂促使铜纳米簇发生聚集诱导效应制备高荧光的铜纳米簇-铈(III)荧光探针，并将其用于构建过氧化氢和葡萄糖荧光传感器，实现过氧化氢和葡萄糖的可视化检测却未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提高铜纳米簇的荧光，实现过氧化氢和葡萄糖的快速、灵敏检测，提供了一种高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针的制备方法，并将其用于构建过氧化氢和葡萄糖荧光传感器，该荧光探针的制备方法简单、省时且可以实现过氧化氢和葡萄糖的可视化检测。

为实现上述目的，本发明的第一个方面是提供一种高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针，其技术方案是高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针的制备方法，在醋酸-醋酸钠缓冲溶液，加入铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入三价铈离子，反应得到高荧光铜铜纳米簇-铈(III)荧光探针。

进一步设置是所述的铜纳米簇通过以下方法制备：将10mL浓度为50mg/mL谷胱甘肽滴加到盛有10mL摩尔浓度为10mM CuSO₄的反应容器中，于37℃，650rpm的转速下反应1小时，然后用1M的NaOH溶液调节上述反应液的pH，对照pH试纸调节pH为5，继续反应2小时，制得铜纳米簇。

进一步设置是所述的醋酸-醋酸钠缓冲溶液的pH为3.6～5.6。

进一步设置是所述三价铈离子的浓度为1～70mM。

本发明的第二个目的是提供一种如所述的制备方法所制得的高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针。

本发明的第三个目的提供一种如所述的高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针在用于过氧化氢检测的应用方法，向所述的荧光探针中加入待检测的过氧化氢，通过测试体系的荧光强度获得过氧化氢检测数据。

本发明的第四个目的提供一种如所述的高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光探针在用于葡萄糖检测的应用方法，将待检测的葡萄糖与葡萄糖氧化酶反应，然后将反应液加入到所述荧光探针，通过测试体系的荧光强度获得葡萄糖的检测数据。

本发明的第四个目的提供一种高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光试纸的制备方法，在醋酸-醋酸钠缓冲溶液中加入铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入三价铈离子，涡旋混匀，反应后，以0.22μm的滤膜为载体，将上述混合溶液真空抽滤，将过滤后的滤膜室温晾干并用打孔器打成圆形试纸。

本发明涉及的过氧化氢检测应用中，所述的过氧化氢的浓度为0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，15mM，测试体系在激发波长为350nm下，该荧光探针在650nm处荧光发射峰的强度。

本发明涉及的葡萄糖检测应用中，所述的葡萄糖与葡萄糖氧化酶(1.25mg/mL)的体积比为1:4～4:1，且总体积为200μL，葡萄糖的浓度为0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20mM。

本发明涉及的过氧化氢的检测范围为10-3000μM，最低检测限为3μM，葡萄糖的检测范围为16-3200μM，最低检测限为4.8μM。

此外，本发明所提供基于高荧光铜纳米簇-铈(III)的荧光检测方法具有较高的选择性，能有效的避免共存生物小分子(D-果糖、α-乳糖、D-(+)-麦芽糖、抗坏血酸、蔗糖、尿酸、赖氨酸、色氨酸)和离子(Ca²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺)的干扰。

本发明以铈(III)作为诱导剂促使铜纳米簇发生聚集诱导效应而制备高荧光铜纳米簇-铈(III)探针，并基于过氧化氢能淬灭其荧光来实现对过氧化氢和葡萄糖的定量检测。该方法操作简单，选择性好，线性范围宽，为过氧化氢和葡萄糖的灵敏检测提供了一种新方法，且可实现过氧化氢和葡萄糖的可视化检测。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，根据这些附图获得其他的附图仍属于本发明的范畴。

图1铜纳米簇的高倍透射电子显微镜图；

图2铜纳米簇、铜纳米簇-铈(III)荧光对比图；

图3不同浓度过氧化氢下，铜纳米簇-铈(III)的荧光响应图；

图4过氧化氢检测的线性图；

图5不同浓度葡萄糖下，铜纳米簇-铈(III)的荧光响应图；

图6葡萄糖检测的线性图；

图7基于高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光试纸可视化检测葡萄糖。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作进一步地详细描述。

实施例1

铜纳米簇的制备：将10mL谷胱甘肽(50mg/mL)滴加到盛有10mL CuSO₄(10mM)的圆底烧瓶(50mL)中，于37℃，650rpm的转速下反应1小时，生成乳白色悬浮液。然后用NaOH(1M)溶液调节上述反应液的pH，对照pH试纸调节至pH为5，溶液颜色变成淡黄色，继续反应2小时，制备好的铜纳米簇保存于4℃的冰箱。由图1可知，所制备的铜纳米簇的粒径为2nm左右，且均匀分散。

铜纳米簇-铈(III)荧光探针的制备：向1mL离心管中加入600μL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 5.6)，100μL实施例1中所制备的铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入100μL铈(III)离子(20mM)，反应10min。

实施例2

采用实施例1的铜纳米簇的制备方法所制备的铜纳米簇。

铜纳米簇-铈(III)荧光探针的制备：向1mL离心管中加入600μL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 3.6)，100μL实施例1中所制备的铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入100μL铈(III)离子(10mM)，反应10min。

实施例3

采用实施例1的铜纳米簇的制备方法所制备的铜纳米簇。

铜纳米簇-铈(III)荧光探针的制备：向1mL离心管中加入600μL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 3.6)，100μL实施例1中所制备的铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入100μL铈(III)离子(20mM)，反应10min。如图2所示，当向铜纳米簇溶液中加入20mM铈(III)形成铜纳米簇-铈(III)后，其荧光较铜纳米簇增强了40倍。

应用例1

过氧化氢的检测：向实施例3所制备的铜纳米簇-铈(III)荧光探针混合溶液中加入200μL不同浓度的过氧化氢(0.05，0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，15mM)，反应10min，测试体系在激发波长为350nm下，该荧光探针在650nm处荧光发射峰的强度。如图3所示，铜纳米簇-铈(III)探针的荧光随着过氧化氢浓度升高而逐渐降低。荧光强度与过氧化氢浓度的对数成线性关系，线性范围为10μM到3mM，检出限为3μM(图4)。

应用例2

葡萄糖的检测：40μL不同浓度葡萄糖(0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20mM)与160μL葡萄糖氧化酶(1.25mg/mL)先于37℃条件下反应30分钟。然后将得到的葡萄糖和葡萄糖氧化酶反应液加入实施例3所制备的铜纳米簇-铈(III)荧光探针混合溶液，反应10min，测试体系在激发波长为350nm下，该荧光探针在650nm处荧光发射峰的强度。

应用例3

葡萄糖的检测：160μL不同浓度葡萄糖(0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20mM)与40μL葡萄糖氧化酶(1.25mg/mL)先于37℃条件下反应30分钟。然后将得到的葡萄糖和葡萄糖氧化酶反应液加入实施例3所制备的铜纳米簇-铈(III)荧光探针混合溶液，反应10min，测试体系在激发波长为350nm下，该荧光探针在650nm处荧光发射峰的强度。如图5所示，当葡萄糖的浓度逐渐增大时，铜纳米簇-铈(III)复合物的荧光逐渐降低，且在16μM到3.2mM范围内，其荧光强度与葡萄糖浓度的对数具有良好的线性关系(图6)，检出限为4.8μM。

应用例4

高荧光铜纳米簇-铈(III)荧光试纸检测葡萄糖：(1)向100mL离心管中加入60mL醋酸-醋酸钠缓冲溶液(pH 3.6)，10mL实施例1所制备的铜纳米簇，涡旋混匀，并向混合液中加入10mL 20mM铈(III)离子，涡旋混匀，反应10min，以0.22μm的滤膜为载体，将上述混合溶液真空抽滤，将过滤后的滤膜室温晾干并用打孔器打成直径3mm的圆形试纸。(2)160μL不同浓度葡萄糖(0.1，0.2，0.5，1，2，5，10，20mM)与40μL葡萄糖氧化酶(1.25mg/mL)先于37℃条件下反应30分钟。然后将得到的葡萄糖和葡萄糖氧化酶反应液滴加到所制备的圆形铜纳米簇-铈(III)荧光试纸上，反应10min。然后于365nm紫外灯下，照射拍照。如图7所示，当葡萄糖的浓度逐渐增大时，荧光亮斑逐渐变暗，说明基于铜纳米簇-铈(III)的荧光探针可实现葡萄糖的可视化检测。

以上所揭露的仅为本发明较佳实施例而已，当然不能以此来限定本发明之权利范围，因此依本发明权利要求所作的等同变化，仍属本发明所涵盖的范围。