一种用于微滴式数字pcr仪的计数校准装置、制备方法及使用方法
阅读说明：本技术 一种用于微滴式数字pcr仪的计数校准装置、制备方法及使用方法 (Counting calibration device for droplet type digital PCR instrument, preparation method and use method ) 是由 林挺 于祥春 冯晓燕 黄慧 龚建 于 2020-05-09 设计创作，主要内容包括：本发明提出的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置,采用封闭式的单层腔体,即腔体1、腔体2、腔体3、腔体4内分别放入效仿数字PCR中微滴结构的、具有固定数量的FITC标记的基底微球、红色荧光标记的微球、绿色荧光标记的微球、蓝色荧光标记的微球。通过单层腔体内具有固定数量并标记有不同颜色荧光的微球对数字PCR的计数系统先进行计数校准,形成校准文件,从而进一步提高对样本进行检测时的准确度及精密度。(The invention provides a counting and calibrating device for a micro-drop digital PCR instrument, which adopts a closed single-layer cavity, namely a cavity 1, a cavity 2, a cavity 3 and a cavity 4 are respectively filled with a fixed number of FITC marked substrate microspheres, red fluorescence marked microspheres, green fluorescence marked microspheres and blue fluorescence marked microspheres which imitate the micro-drop structure in digital PCR. The counting system of the digital PCR is firstly counted and calibrated through the microspheres which are fixed in number and marked with different colors of fluorescence in the single-layer cavity to form a calibration file, so that the accuracy and precision of the sample in detection are further improved.)
技术领域
本发明涉及数字PCR检测，具体为一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置、制备方法及使用方法。
背景技术
数字PCR技术是将一个样本分成几十到几万份后分配到不同的反应单元，对于微滴式数字PCR仪生成的每个微滴就是一个反应单元。每个反应单元内包含一个或多个拷贝的目标分子(DNA模板)，之后在每个反应单元中分别对目标分子进行PCR扩增，扩增结束后再对各个反应单元的荧光信号进行统计学分析。迄今为止，基于分液方式的不同，数字PCR技术主要有三类：微反应室/孔板、大规模集成微流控芯片以及微滴式数字PCR系统，三类数字PCR技术分别通过微孔板、微流体芯片或微液滴实现分液，分隔开的每个微小区域都可进行单独的PCR反应，其中微滴式数字PCR中所形成的微滴直径大概在100微米左右。数字PCR技术的提出至今虽然只有20年时间，但是由于其独特的技术优势和应用前景，使得其产业化发展相当迅速。目前此项技术已经应用于基因拷贝数变异、感染检测、基因测序、基因突变检测等研究领域。数字PCR技术属于对DNA分子的绝对定量，检测是依靠微滴数量或者微反应室数量的真实占比来实现，因此尽可能的校准分液数量并精准计算所形成的微滴数量可以大幅度降低分液误差，从而大幅度提高数字PCR仪检测的准确度和精密度，尤其是对于微滴式数字PCR仪，每种微滴式数字PCR仪对于微滴数量的计数都会因为仪器构造的不同而有所偏差，因此当前急需一种能够对微滴式数字PCR仪对微滴计数准确性进行核实的校准装置及使用方法。目前与此相关的技术还未见有报道及公布。
发明内容
本发明的目的之一是提供一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置及其制备方法；本发明的另一目的是提供一种能够多次、无需其他装置就能使用的用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的使用方法。
本发明提供一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置，包括腔体1、腔体2、腔体3、腔体4，腔体1至腔体4中放置有聚甲基丙烯酸甲酯薄片，聚甲基丙烯酸甲酯薄片内封闭有固定数量的不同颜色荧光标记的微球。
所述腔体1至腔体4为单层封闭式腔体，腔体高度为90微米～130微米；
所述腔体1内放置的以聚甲基丙烯酸甲酯为载体的薄片，聚甲基丙烯酸甲酯薄片内封闭有FITC标记的基底微球30000个；腔体2内放置的以聚甲基丙烯酸甲酯为载体的薄片，聚甲基丙烯酸甲酯薄片内封闭有FITC标记的基底微球27000个，蓝色荧光标记的微球1000个、绿色荧光标记的微球1000个、红色荧光标记的微球1000个；腔体3内放置的以聚甲基丙烯酸甲酯为载体的薄片，聚甲基丙烯酸甲酯薄片内封闭有FITC标记的基底微球24000个，蓝色荧光标记的微球2000个、绿色荧光标记的微球2000个、红色荧光标记的微球2000个；腔体4内放置的以聚甲基丙烯酸甲酯为载体的薄片，聚甲基丙烯酸甲酯薄片内封闭有FITC标记的基底微球18000个，蓝色荧光标记的微球4000个、绿色荧光标记的微球4000个、红色荧光标记的微球4000个。
所述FITC标记的基底微球、蓝色荧光标记的微球、绿色荧光标记的微球、红色荧光标记的微球的直径为80微米～120微米；标记有不同颜色荧光的微球在聚甲基丙烯酸甲酯薄片中呈单层排列。
一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的制备方法，包括以下步骤：
(1)使用微机电系统技术(Micro-Electro-Mechanical System，MEMS)在长度为18毫米～26毫米，宽度为14毫米～20毫米的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面分别蚀刻出30000个规则排列的小坑，每个小坑的直径为84微米～124微米，高度为42微米～62微米；
(2)在荧光显微镜视野下，将一定数量并标记有不同颜色荧光的微球使用固化剂充分混合制成微球悬液后，均匀滴加到已经蚀刻出直径为84微米～124微米小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面并均匀刮抹后在荧光显微镜下观察微球进入小坑的状态；
(3)将另一块只蚀刻有小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料边界涂抹上固化剂并覆盖到上述载有微球的聚甲基丙烯酸甲酯材料上，使用365nm的UVA紫外光进行照射，使两块聚甲基丙烯酸甲酯材料固化粘合在一起制成含有固定数量并标记不同颜色荧光微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片；
(4)将制好的腔体1至腔体4所需要使用的聚甲基丙烯酸甲酯薄片在荧光成像扫描仪上进行全视野扫描并进行各种荧光微球的精准计数统计并筛选出最接近于载有固定数量并标记不同颜色荧光微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片；
(5)按照上述(1)至(4)的步骤分别制得4张含有不同数量并标记不同颜色荧光微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片，并将4张聚甲基丙烯酸甲酯薄片按照一定顺序放入腔体1至腔体4的模具中，密封模具制得本申请所述的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置。
一种微滴式数字PCR仪的计数校准装置的使用方法，包含以下步骤：
(1)将腔体高度分别为90微米～130微米的微滴式数字PCR仪的计数校准装置分别放置于数字PCR仪器内，激发光源激发后，发出的荧光被图像传感器收集成像；
(2)使直径为80微米～120微米的不同颜色荧光标记的微球在图像传感器的表面分别成像；
(3)通过计算机进行数据采集后，与微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体1至腔体4中已知的固定数量并标记不同颜色荧光微球进行数量的比对分析；
(4)分析比对结果，对仪器的计数系统进行校准并形成校准文件；
(5)进行样本的数字PCR检测后，首先引入校准文件对计数系统进行校准后，再对发出荧光的微滴进行计数并完成后续的数据分析工作。
本发明具有如下显著性特点：
采用封闭式的单层腔体内放入效仿数字PCR中微滴结构的、具有固定数量的FITC标记的基底微球、红色荧光标记的微球、绿色荧光标记的微球、蓝色荧光标记的微球，通过单层腔体内具有固定数量并标记有不同颜色荧光的微球对数字PCR的计数系统先进行计数校准，形成校准文件，从而进一步提高对样本进行检测时的准确度及精密度。
附图说明
图1荧光显微镜下微球溶液的状态。
图2使用荧光显微镜(SapphireTM Biomolecular Imager，Azure Biosystems，美国)观察标记有不同颜色荧光并混合后的微球状态。
图3一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置中微球数量及分布俯视图。从左到右分别为载有全部为基底微球、载有红绿蓝荧光标记的微球分别为1000个、载有红绿蓝荧光标记的微球分别为2000个、载有红绿蓝荧光标记的微球分别为4000个的聚甲基丙烯酸甲酯材料薄片。
图4一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体结构俯视示意图。
图5一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体结构侧面示意图。
具体实施方式
下面结合附图以及具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。
实施例1一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的制备方法
1、使用微机电系统技术(Micro-Electro-Mechanical System，MEMS)在长为22毫米，宽为17毫米的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面分别蚀刻出30000个规则排列的小坑，每个小坑的直径为104微米，高度为52微米。
2、从中科雷鸣(北京)科技有限公司定制了直径为100微米的FITC标记的基底微球、100微米蓝色荧光标记的微球、100微米绿色荧光标记的微球、100微米红色荧光标记的微球溶液，如图1所示。
3、定制好的微球溶液首先在荧光显微镜下进行微球溶液体积相对应的微球数量的粗略计数。100微米微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数表参见表1。
表1微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数对应表
微球直径(微米)
10微升微球溶液含有的微球个数(个)
100
50
4、按照粗略计数后，计算高度为110微米的腔体中装入的聚甲基丙烯酸甲酯薄片中需要装入的100微米微球溶液的体积，需要微球溶液的体积量参见表2。
表2腔体高度为110微米装入的聚甲基丙烯酸甲酯薄片中需装入的100微米微球溶液的体积
5、将表2中腔体1至腔体4中所示体积的标记不同颜色荧光标记的100微米微球溶液充分混合后，2000rpm进行离心并去除上清溶液。
6、使用50微升固化剂溶液重新充分悬浮100微米微球，制备成100微米微球悬液。
7、使用微量注射器将100微米微球悬液均匀滴在其中一块已经蚀刻出105微米小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面上并均匀刮抹，将微球刮抹至小坑中并在显微镜下观察微球进入小坑的状态，如图2所示；
8、将另一块只蚀刻有小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料边界涂抹上固化剂并覆盖到上述载有微球的聚甲基丙烯酸甲酯材料上，使用365nm的UVA紫外光进行照射，使两块聚甲基丙烯酸甲酯材料固化粘合在一起分别制成腔体1至腔体4所示的不同颜色荧光标记的含有固定数量微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片；
9、将制好的腔体1至腔体4所需要使用的聚甲基丙烯酸甲酯薄片在SapphireBiomolecular Imager(Azure Biosystems，美国)仪器上进行全视野扫描并进行各种荧光微球的精准计数统计并筛选出最接近于表3中所示的载有不同颜色荧光标记的并具有准确微球数量的聚甲基丙烯酸甲酯薄片(图3)。
表3腔体高度为110微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置
10、将筛选出的载有固定数量并且不同颜色荧光标记的微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片按照图4所示腔体1至腔体4的顺序放入腔体模具中之后密封模具制得腔体高度为110微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置(图5中图)。
实施例2一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的制备方法
1、使用MEMS技术在长为18毫米，宽为14毫米的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面分别蚀刻出30000个规则排列的小坑，每个小坑的直径为84微米，高度为42微米。
2、从中科雷鸣(北京)科技有限公司定制了直径为80微米的FITC标记的基底微球、80微米蓝色荧光标记的微球、80微米绿色荧光标记的微球、80微米红色荧光标记的微球。
3、定制好的微球溶液首先在荧光显微镜下进行微球溶液体积相对应的微球数量的粗略计数。80微米微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数表参见表4。
表4 80微米微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数对应表
微球直径(微米)
10微升微球溶液含有的微球个数(个)
80
63
4、按照粗略计数后，计算高度为90微米的腔体中装入的聚甲基丙烯酸甲酯薄片中需要装入的80微米微球溶液的体积，需要80微米微球溶液的体积量参见表5。
表5腔体高度为90微米装入的聚甲基丙烯酸甲酯薄片中需装入的80微米微球溶液的体积
5、将表5中腔体1至腔体4中所示体积的标记不同颜色荧光的80微米微球溶液充分混合后，2000rpm进行离心并去除上清溶液。
6、使用50微升固化剂溶液重新充分悬浮80微米微球，制备成80微米微球悬液。
7、使用微量注射器将80微米微球悬液均匀滴在其中一块已经蚀刻出84微米小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面上并均匀刮抹，将微球刮抹至小坑中并在显微镜下观察微球进入小坑的状态；
8、将另一块只蚀刻有小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料边界涂抹上固化剂并覆盖到上述载有微球的聚甲基丙烯酸甲酯材料上，使用365nm的UVA紫外光进行照射，使两块聚甲基丙烯酸甲酯材料固化粘合在一起分别制成腔体1至腔体4所示的不同颜色荧光标记的含有固定数量微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片；
9、将制好的腔体1至腔体4所需要使用的聚甲基丙烯酸甲酯薄片在SapphireBiomolecular Imager(Azure Biosystems，美国)仪器上进行全视野扫描并进行各种荧光微球的精准计数统计并筛选出最接近于表6中所示的准确微球数量的聚甲基丙烯酸甲酯薄片。
表6腔体高度为90微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置
10、将腔体1至腔体4所示的制好的聚甲基丙烯酸甲酯薄片按照顺序放入腔体模具中，密封模具制得腔体高度为90微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置(图5上图)。
实施例3一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的制备方法
1、使用MEMS技术在长为26毫米，宽为20毫米的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面分别蚀刻出30000个规则排列的小坑，每个小坑的直径为124微米，高度为62微米；
2、从中科雷鸣(北京)科技有限公司定制了直径为120微米的FITC标记的基底微球、120微米蓝色荧光标记的微球、120微米绿色荧光标记的微球、120微米红色荧光标记的微球。
3、定制好的微球首先在荧光显微镜下进行微球溶液体积相对应的微球数量的粗略计数。120微米微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数表参见表7。
表7 120微米微球溶液体积相对应的微球数量的精准计数对应表
微球直径(微米)
10微升微球溶液含有的微球个数(个)
120
40
4、按照粗略计数后，计算高度为130微米的腔体中装入的聚甲基丙烯酸甲酯材料薄片中需要装入的120微米微球溶液的体积，需要微球溶液的体积量参见表8。
表8 130微米高的腔体中装入的聚甲基丙烯酸甲酯薄片中需装入的120微米微球溶液的体积
5、将表8中腔体1至腔体4中所示体积的并标记有不同颜色荧光的120微米微球溶液充分混合后，2000rpm进行离心并去除上清溶液。
6、使用50微升固化剂溶液重新充分悬浮120微米微球，制备成120微米微球悬液。
7、使用微量注射器将120微米微球悬液均匀滴在其中一块已经蚀刻出124微米小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料表面上并均匀刮抹，将微球刮抹至小坑中并在显微镜下观察微球进入小坑的状态；
8、将另一块只蚀刻有小坑的聚甲基丙烯酸甲酯材料边界涂抹上固化剂并覆盖到上述载有微球的聚甲基丙烯酸甲酯材料上，使用365nm的UVA紫外光进行照射，使两块聚甲基丙烯酸甲酯材料固化粘合在一起分别制成腔体1至腔体4所示的不同颜色荧光标记的含有固定数量微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片；
9、制成的腔体1至腔体4所示的120微米微球数量的聚甲基丙烯酸甲酯薄片，在Sapphire Biomolecular Imager(Azure Biosystems，美国)仪器上进行全视野扫描并进行各种荧光微球的精准计数统计并筛选出最接近于表9中所示的准确微球数量的聚甲基丙烯酸甲酯薄片。
表9腔体高度为130微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置
10、将筛选出的载有不同数量荧光微球的聚甲基丙烯酸甲酯薄片按照将腔体1至腔体4所示的顺序放入腔体模具中，密封模具制得腔体高度为130微米的一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置(图5下图)。
实施例4一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的使用方法
1、将实施例1中制备好的腔体高度为110微米的用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置放置于数字PCR仪器内，激发光源激发后，发出的荧光被图像传感器收集成像。
2、使直径为100微米的不同颜色荧光标记的微球在图像传感器的表面成像；
3、通过计算机进行数据采集后，与微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体1至腔体4中已知的固定数量并标记不同颜色荧光的100微米的微球进行数量的比对分析；
4、分析比对结果，对仪器的计数系统进行校准并形成校准文件；
5、进行样本的数字PCR检测后，首先引入校准文件对计数系统及进行校准后，再对发出荧光的微滴进行计数并完成后续的数据分析工作。
实施例5一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的使用方法
1、将实施例2中制备好的腔体高度为90微米的用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置放置于仪器内，激发光源激发后，发出的荧光被图像传感器收集成像。
2、使直径为80微米的不同颜色荧光标记的微球在图像传感器的表面成像；
3、通过计算机进行数据采集后，与微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体1至腔体4中已知的固定数量并标记不同颜色荧光的80微米的微球进行数量的比对分析；
4、分析比对结果，对仪器的计数系统进行校准并形成校准文件；
5、进行样本的数字PCR检测后，首先引入校准文件对计数系统及进行校准后，再对发出荧光的微滴进行计数并完成后续的数据分析工作。
实施例6一种用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置的使用方法
1、将实施例3中制备好的腔体高度为130微米的用于微滴式数字PCR仪的计数校准装置放置于仪器内，激发光源激发后，发出的荧光被图像传感器收集成像。
2、使直径为120微米的不同颜色荧光标记的微球在图像传感器的表面成像；
3、通过计算机进行数据采集后，与微滴式数字PCR仪的计数校准装置的腔体1至腔体4中已知的固定数量并标记不同颜色荧光的120微米的微球进行数量的比对分析；
4、分析比对结果，对仪器的计数系统进行校准并形成校准文件；
5、进行样本的数字PCR检测后，首先引入校准文件对计数系统及进行校准后，再对发出荧光的微滴进行计数并完成后续的数据分析工作。