一种信号放大的荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途
阅读说明:本技术 一种信号放大的荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途 (Signal amplification fluorescence detection system, fluorescence biosensor and application thereof ) 是由 周洁 许改霞 于 2020-05-11 设计创作,主要内容包括:本发明公开了一种信号放大的荧光检测体系,包括识别单元,标记有荧光分子,用于识别阿尔兹海默症的生物标志物分子,且与生物标志物分子结合形成生物复合体;荧光淬灭单元,吸附识别单元,使荧光分子的荧光淬灭;荧光淬灭单元与生物复合体解吸附,使荧光分子的荧光恢复;信号放大单元,用于降解生物复合体中的识别单元。以上述荧光检测体系对阿尔兹海默症的生物标志物分子进行检测,具有快速、简单、灵敏、高效的优势;同时,上述体系能够放大荧光分子信号,降低体系的检出限,具有高灵敏度。本发明还公开了一种荧光生物传感器,包括上述的荧光检测体系,能够为阿尔兹海默症的诊断与筛查提供有效信息。(The invention discloses a signal amplification fluorescent detection system, which comprises an identification unit, a signal amplification unit and a signal amplification unit, wherein the identification unit is marked with fluorescent molecules and used for identifying biomarker molecules of Alzheimer's disease and combining with the biomarker molecules to form a biological complex; a fluorescence quenching unit that adsorbs the recognition unit and quenches fluorescence of the fluorescent molecule; desorbing the fluorescence quenching unit and the biological complex to recover the fluorescence of the fluorescent molecules; and the signal amplification unit is used for degrading the identification unit in the biological complex. The fluorescence detection system is used for detecting the biomarker molecules of the Alzheimer's disease, and has the advantages of rapidness, simplicity, sensitivity and high efficiency; meanwhile, the system can amplify fluorescent molecular signals, reduces the detection limit of the system and has high sensitivity. The invention also discloses a fluorescence biosensor which comprises the fluorescence detection system and can provide effective information for the diagnosis and screening of the Alzheimer disease.)
技术领域
本发明涉及生物分子检测领域,具体涉及一种信号放大的荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途。
背景技术
阿尔兹海默症(Alzheimer’s disease,AD)是主要与年龄相关的不可逆转的神经退行性疾病。阿尔兹海默症影响病人的认知和短时记忆功能,随着疾病发展的进行,病人的日常生活能力会逐渐受到影响,最后丧失生活自理的能力。在流行病学方面,阿尔兹海默症随着年龄的增加发病几率会成倍增加。随着世界老龄化趋势的增加,阿尔兹海默症己经成为继肿瘤及心血管疾病之后最为严重的疾病和死亡原因。
由于阿尔兹海默症的潜伏期较长,可达10-20年左右,导致很多患者因为没被及时发现而错失了早期治疗的宝贵时机。该疾病如果可以在较早的阶段被发现并给予有效的治疗,将明显改善患者的健康状况和生活质量,并极大的提高患者的生存率。因此,早期诊断对阿尔兹海默症的治疗和预防具有十分重要的研究意义和应用价值。
现在已有的疾病进程诊断方法包括基于问卷的MMSE打分测试,以及针对Aβ淀粉样蛋白的神经元成像(neuron imaging)检测,还有一些有创方法比如通过分析脑脊液(CSF)中的相关生物分子(Aβ分子,tau蛋白等)来帮助进行AD的诊断,已有研究认为,通过脑脊液中生物标识物进行AD的诊断准确率较好,但是存在个明显的缺点:费用过高,相比外周血相关的生物组织获取过程较难;获取脑脊液对病人造成的痛苦较大,还有可能留下后遗症。与检测脑脊液中的生物标识物相比,AD患者的外周血容易获取,且不会为患者带来较大的身体与经济负担。因此,检测AD患者的外周血中生物标识物的变化对于AD诊断具有重要的临床应用价值。
MicroRNA(miRNA)是一类内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子,它们在动植物中参与转录后基因表达调控,调节生物体生长、发育和凋亡等过程。在医学研究领域,miRNA参与调控多种疾病的发生和发展进程,同时,miRNA基于其调控机制,也有望成为疾病诊断的新生物学标记物。AD特异血清miRNA的检测可为AD诊断提供强有力的依据。然而在人血清中,miRNA的含量较低,现有的高灵敏miRNA检测技术(Q-PCR、微阵列、高通量测序技术等)多依赖于大型的精密检测设备,检测成本较高,检测步骤繁琐,定量准确性有限,可推广性较差。
因此,如何实现对AD患者血清特异性miRNA的快速、简便、灵敏的定量检测,对于阿尔兹海默症的早期筛查与诊断具有重要意义。
发明内容
因此,本发明要解决的技术问题在于克服现有技术中的阿尔兹海默症的疾病诊断存在检测成本较高、检测步骤繁琐、定量准确性有限的缺陷。
为此,本发明提供如下技术方案:
第一方面,本发明提供了一种信号放大的荧光检测体系,包括:
识别单元,所述识别单元标记有荧光分子,用于识别阿尔兹海默症的生物标志物分子,且与所述生物标志物分子结合形成生物复合体;
荧光淬灭单元,所述荧光淬灭单元吸附所述识别单元,使所述荧光分子的荧光淬灭;所述荧光淬灭单元与所述生物复合体解吸附,使所述荧光分子的荧光恢复;
信号放大单元,所述信号放大单元用于降解所述生物复合体中的识别单元。
可选地,上述的荧光检测体系,
所述识别单元是荧光分子标记的单链DNA探针,所述生物标志物分子是miRNA,所述信号放大单元是脱氧核糖核酸酶I。
进一步可选地,上述的荧光检测体系,所述单链DNA探针具有SEQ ID NO.1-SEQ IDNO.3任一所示的核苷酸序列,所述miRNA具有SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6任一所示的核苷酸序列。
可选地,上述的荧光检测体系,所述识别单元包括:亲和素标记的荧光分子,和生物素标记的单链DNA分子,所述亲和素偶联所述生物素;
优选地,所述荧光分子为荧光量子点;
优选地,所述亲和素标记的荧光量子点,与所述生物素标记的单链DNA分子偶联的摩尔比为1:4。
可选地,上述的荧光检测体系,所述荧光淬灭单元选择石墨烯和氧化石墨烯中的任一种;
优选地,所述荧光淬灭单元为氧化石墨烯;
优选地,所述氧化石墨烯的浓度为100μg/mL。
可选地,上述的荧光检测体系,所述识别单元与所述荧光淬灭单元的体积比为10:1。
第二方面,本发明提供了一种荧光生物传感器,所述荧光生物传感器包括上述的荧光检测体系。
第三方面,本发明提供了上述的荧光检测体系,或者荧光生物传感器在制备用于诊断阿尔兹海默症的产品中的用途。
第四方面,本发明提供了一种用于诊断阿尔兹海默症的试剂盒,所试剂盒包括上述的荧光检测体系,或者荧光生物传感器。
本发明技术方案,具有如下优点:
1.本发明提供的荧光检测体系,包括:识别单元,识别单元标记有荧光分子,用于识别阿尔兹海默症的生物标志物分子,且与生物标志物分子结合形成生物复合体;荧光淬灭单元,荧光淬灭单元吸附荧光探针,使荧光分子的荧光淬灭;荧光淬灭单元与生物复合体解吸附,使荧光分子的荧光恢复;信号放大单元,信号放大单元用于降解生物复合体中的识别单元。
上述荧光检测体系中,以识别单元标记的荧光分子作为荧光供体,以荧光淬灭单元作为荧光供体,当荧光淬灭单元吸附识别单元后,两者的距离足够接近,发生荧光共振能量转移(resonance energy transfer,FRET),荧光供体的能量转移至荧光受体,使识别单元的荧光分子发生荧光淬灭。而向体系中加入含有阿尔兹海默症的生物标志物分子的目标检测物后,识别单元识别并结合阿尔兹海默症的生物标志物分子,形成生物复合体。由于荧光猝灭单元与生物复合体解吸附,生物复合体在离开荧光猝灭单元后,其中的荧光分子的荧光恢复。通过分析荧光检测体系中荧光强度的增强程度,能够实现对阿尔兹海默症相关的目标生物标志物分子的定量检测。
荧光检测体系中的信号放大单元能够特定地识别生物复合体,并降解生物复合体中的识别单元。识别单元降解后,释放出荧光分子与生物标志物分子,生物标志物分子被释放后会继续与荧光淬灭单元上吸附的识别单元结合为生物复合体,使更多的识别单元被降解,利用上述的循环反应能够使荧光分子在检测体系中被不断富集,从而起到荧光信号的放大作用,使荧光检测体系对目标生物标志物分子的检测具有高灵敏度。
以上述荧光检测体系对阿尔兹海默症的生物标志物分子进行检测,无需使用大型仪器或经过复杂的反应步骤,仅需将荧光检测体系加入目标检测物中,即能实现对阿尔兹海默症的生物标志物分子的快速检测,具有快速、简单、灵敏、高效的优势。同时,上述的荧光检测体系能够实现对生物标志物分子检测荧光信号的放大作用,具有高的检测灵敏度,有效提高了阿尔兹海默症的生物标志物分子检测的准确度。为阿尔兹海默症的早期诊断、筛查提供有效的临床信息,有利于疾病的早发现、早治疗,有效提高阿尔兹海默症患者的生存质量、提高患者生存率。
2.本发明提供的荧光检测体系,荧光淬灭单元选择石墨烯和氧化石墨烯(Graphene ocide,GO)中的任一种。石墨烯及氧化石墨烯具有大尺寸的二维芳香平面结构,石墨烯及氧化石墨烯可以作为良好的平台吸附特定的生物分子,由于其大面积的共轭结构,可以作为能量受体淬灭多种有机染料及量子点的荧光,是一种广适性的荧光猝灭剂。与传统的淬灭剂相比,石墨烯材料具有更高的淬灭效率,使FRET传感器具有背景低、信噪比高、可多重检测等显著优点。
本发明提供的荧光检测体系,荧光淬灭单元具体选择氧化石墨烯,氧化石墨烯具有良好的水分散性、优异的生物相容性、较高的稳定性、毒性低、成本低、易于进行表面修饰、易于进行大规模生产、具有远程猝灭效应,吸收光谱范围较广,几乎可以吸收所有的蓝紫光,对大多数荧光染料和量子点的荧光都具有较好的猝灭效应。
3.本发明提供的荧光检测体系,荧光探针是具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3任一所示核苷酸序列的单链DNA探针,生物标志物分子是具有SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6任一所示核苷酸序列的miRNA。本发明以单链DNA(ssDNA)作为探针,氧化石墨烯片层与单链DNA的碱基之间存在较强的π-π作用力,单链DNA探针可以吸附到氧化石墨烯的表面,使探针上标记的荧光分子发生荧光淬灭。而当荧光检测体系加入目标检测物后,荧光探针的单链DNA分子与其互补的miRNA发生杂交,得到双链DNA。氧化石墨烯对双链DNA分子的吸附力弱,双链DNA从氧化石墨烯上解吸附,荧光分子的荧光得到恢复,从而完成对目标生物标志物分子的检测。本发明通过研究发现,具有SEQ ID NO.4-SEQ ID NO.6所示核苷酸序列的miRNA分子在阿尔兹海默症的患病组与健康组之间存在较大的表达差异,为阿尔兹海默症的疾病诊断提供了一种特异性强、准确性高的生物标志物分子。具有SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.3核苷酸序列的单链DNA探针通过与上述miRNA分子互补结合,实现对miRNA分子表达水平的高灵敏度检测,进而实现对阿尔兹海默症的无创早期筛查、诊断。
4.本发明提供的荧光检测体系,所述识别单元包括:亲和素标记的荧光分子,和生物素标记的单链DNA分子,所述亲和素偶联所述生物素。识别单元是基于生物素-亲和素系统构建的荧光分子标记的单链DNA探针,生物素-亲和素系统有利于增加每条单链DNA分子标记的荧光分子数量,实现荧光信号的级联放大,进一步提高荧光检测体系的检测灵敏度、降低检测限。
进一步地,本发明提供了荧光检测体系中亲和素标记的荧光量子点与生物素标记的单链DNA分子偶联的摩尔比,以及识别单元与荧光淬灭单元的体积比,上述的荧光检测体系对阿尔兹海默症相关的miRNA分子检测的线性范围达10-1000nM,具有较好的线性度;荧光检测体系的检出限为17nM,具有低的检出限和高的灵敏度。
5.本发明提供的荧光生物传感器,包含上述的荧光检测体系,能够实现对对阿尔兹海默症的生物标志物分子的快速检测,具有快速、简单、灵敏、高效的优势,且检测结果准确,有利于阿尔兹海默症的早期筛查与诊断。
附图说明
为了更清楚地说明本发明
具体实施方式
或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实验例1中改变荧光检测体系中的氧化石墨烯浓度后,荧光强度随miRNA浓度的变化情况;
图2是本发明实验例1中改变荧光检测体系中的脱氧核糖核酸酶I的浓度后,荧光强度随miRNA浓度的变化情况;
图3显示本发明实验例2中荧光检测体系对不同浓度miRNA检测的线性检测结果图。
具体实施方式
下面将对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。此外,下面所描述的本发明不同实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互结合。
下述实施例使用的所有试剂均属于分析级。其中氧化石墨烯溶液购于南京先丰纳米科技有限公司。CdSe/ZnS量子点标记链霉亲和素标记的购于武汉珈源量子点开发技术有限公司。DEPC水购于北京索莱宝科技有限公司。三羟甲基氨基甲烷(Tris)、NaCl、KCl、CaCl2和MgCl2均购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司。脱氧核糖核酸酶I(DnaseI)购于北京全式金生物技术有限公司。检测缓冲液的配置方法:首先用DEPC水在超净环境下配置Tris-HCl溶液,溶液中含有10mM Tris、100mM NaCl、20mM KCl、10mM MgCl2和100μM CaCl2。用HCl将溶液pH调为7.5。
实施例1
本实施例提供一种荧光检测体系,包括如下成分:
1、识别单元,是荧光分子标记的单链DNA探针。具体地,识别单元包括:链霉亲和素标记的荧光分子,生物素标记的单链DNA分子(ssDNA),链霉素与生物素相偶联形成识别单元。其中,荧光分子具体为荧光量子点(CdSe/ZnS量子点),链霉亲和素标记的荧光分子与生物素标记的单链DNA分子的偶联摩尔比为1:4。单链DNA分子的核苷酸序列选自SEQ IDNO.1-SEQ ID NO.3所示的任一核苷酸序列,本实施例中具体地选择SEQ ID NO.1的核苷酸序列,具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列的识别单元能够识别并结合阿尔兹海默症的生物标志物分子miRNA1。
2、荧光淬灭单元,氧化石墨烯。
荧光检测体系的配制过程如下:
1)将链霉亲和素标记的量子点(SA-QD)与生物素标记的DNA(biotin-DNA)以摩尔量1:8的比例混合,37℃下孵育1h。使用100kDa超滤管过滤未反应的DNA,得到荧光量子点标记的单链DNA探针(QD-DNA)。通过检测过滤掉的溶液中DNA的浓度,得到SA-QD与biotin-DNA的偶联比是1:4。
2)使用DEPC水处理的PBS配制浓度为10nM的识别单元(荧光量子点标记的单链DNA探针,QD-DNA)溶液,取100μl 10nM的QD-DNA的溶液,向其中加入10μl浓度为100μg/mL的氧化石墨烯(GO)溶液,室温下孵育5分钟,得到荧光检测体系。
荧光检测体系以荧光量子点标记的单链DNA探针作为信号单元,以氧化石墨烯作为荧光淬灭单元,氧化石墨烯对荧光分子的发射光谱没有要求,能够淬灭多种荧光染料的荧光。因此,当单链DNA探针吸附于氧化石墨烯上后,发生荧光共振能量转移,单链DNA探针上标记的荧光量子点发生荧光淬灭。而上述的荧光检测体系加入到目标检测体系后,识别单元的单链DNA分子能够结合miRNA分子,两者互补杂交形成双链的生物复合体。氧化石墨烯对双链分子的吸附力较弱,双链DNA分子从氧化石墨烯上解吸附后,荧光量子点的荧光恢复。同时,检测体系中作为信号放大单元的脱氧核糖核酸酶I(Deoxyribonuclease I,DNaseI)识别双链的生物复合体,DNase I选择性切割生物复合体中DNA单链,对miRNA链没有消化活性。生物复合体中的单链DNA被切割后,释放荧光量子点与阿尔兹海默症的生物标志物分子miRNA到溶液中,miRNA继续结合氧化石墨烯片层上的单链DNA探针,进一步释放单链DNA探针上标记的荧光量子点。通过上述过程的循环往复,使荧光量子点在检测体系中富集,荧光信号强度显著增大,起到信号放大的作用。通过检测在加入目标检测体系前后,荧光强度的增强程度,能够实现对生物标志物分子miRNA的定量检测,由于荧光信号的富集放大,上述荧光检测体系对目标生物标志物分子检测的灵敏度大大提高、检出限降低,能够实现对生物标志物分子的精准检出。本实施例提供的荧光检测体系通过特异性识别并检测阿尔兹海默症的生物标志物分子,能够实现对阿尔兹海默症的无创诊断,且诊断过程不需要使用大型仪器或经过复杂的检测步骤,具有快速、简单、灵敏、高效的优势。上述信号放大的荧光检测体系结合目标miRNA分子的特异性强、灵敏度高,使荧光检测体系用于诊断阿尔兹海默症具有较好的准确性,为阿尔兹海默症的早期诊断、筛查提供有效的临床信息,有利于疾病的早发现、早治疗,有效提高阿尔兹海默症患者的生存质量、提高患者生存率。
实施例2
本实施例提供一种荧光生物传感器,包括实施例1中的荧光检测体系。荧光生物传感器能够实现对阿尔兹海默症的生物标志物分子的生物标志物分子的快速检测,具有快速、简单、灵敏、高效、准确的优势,能够用于阿尔兹海默症的疾病筛查与诊断。
实验例1
1、实验目的:对实施例1中荧光检测体系的条件进行优化,以提高检测性能。
2、实验过程和结果:
荧光检测使用多功能酶标仪Variokan Flash(Thermo Scientific,USA)测得,在全黑的96孔板中进行。向荧光检测体系中加入100μL不同浓度的miRNA(1000nM,500nM,200nM,100nM,50nM,20nM,10nM和0nM)加入到溶液中,孵育10分钟。接着在每孔中加入DnaseI,孵育30分钟。在检测过程中,520nm处(激发波长:380nm)的荧光发射强度每五分钟记录一次。改变荧光检测体系中氧化石墨烯(GO)的添加量以及Dnase I的添加量,比较3种浓度的GO(500μg/ml,200μg/ml,100μg/ml)和五种Dnase I添加量(10U,5U和1U)条件下的荧光检测结果,具体如下:
图1A显示不同氧化石墨烯(GO)浓度下,miRNA浓度与荧光强度变化量的关系,图1B为图1A中miRNA浓度为10-100nM的局部放大图。由图1A和图1B可知,当氧化石墨烯(GO)浓度较大时,GO与识别单元(QD-DNA)的结合较紧密,会更大程度抑制DNA酶对DNA的降解,也阻碍了miRNA与QD-DNA形成双链,因此检测不到较小浓度的miRNA。最后选择的GO浓度为100μg/ml。
图2A显示不同Dnase I酶量下,miRNA浓度与荧光强度变化量的关系,图2B为图2A中miRNA浓度为10-100nM的局部放大图。由图2A和图2B可知,当酶浓度较小时,酶很难对反应产生放大作用。当酶浓度较大时,石墨烯对单链DNA的保护能力变弱,酶会造成一部分QD-DNA的降解,使量子点的荧光得到恢复。因此当miRNA浓度较小时,miRNA与QD-DNA结合导致的量子点荧光恢复效应不明显,所以检测不到。最终选择的酶量为5U/孔。
实验例2
1、实验目的:检测实施例1中荧光检测体系的线性检测范围
2、实验过程:
荧光检测使用多功能酶标仪Variokan Flash(Thermo Scientific,USA)测得,在全黑的96孔板中进行。首先,10nM的QD-DNA的溶液加入到孔板中。接着,10μl浓度为100μg/mL的GO加入到溶液中。室温下孵育5分钟后,100μL不同浓度的miRNA(1000nM,500nM,200nM,100nM,50nM,20nM,10nM和0nM)加入到溶液中,孵育10分钟。接着在每孔中加入10μL总量为5U的DnaseI,孵育30分钟。在检测过程中,520nm处(激发波长:380nm)的荧光发射强度每五分钟记录一次。
图3A显示了识别单元(QD-DNA)和荧光淬灭单元(GO)的混合物与不同浓度的目标miRNA(0nM-1000nM)和信号放大单元(Dnase I)酶共同孵育后测得的520nm处的荧光强度随时间的变化曲线。正如图中描绘的那样,荧光量子点的荧光发射强度随着目标miRNA浓度的升高而升高,表明了目标miRNA引起的荧光恢复。荧光强度在30分钟内基本达到稳定,说明miRNA与QD-DNA的结合达到饱和。
荧光强度变化△F与目标miRNA浓度的关系曲线如图3B所示。可以看出,miRNA检测有两个线性区间,分别为10nM-200nM浓度范围和200nM-1000nM浓度范围,线性方程分别为△F=0.027*C-0.53(nM,r2=0.96)和△F=0.037*C+4.96(nM,r2=0.96)。△F对miRNA浓度的线性依赖度表明了该方法可以用于miRNA的定量检测。根据3σ/S(σ为空白样的测得的标准偏差,S为标定曲线的斜率)得到传感器的检出限为17nM,说明了DnaseI的使用增加了传感器的灵敏度。图3C和图3D分别显示在10-200nM范围内,以及200-1000nM范围内,荧光强度变化△F与目标miRNA浓度的标定曲线。由图3C和图3D可知,上述的荧光检测体系对miRNA检测呈良好的线性关系。
由此可知,利用DNase I对信号的放大作用,以荧光量子点作为FRET供体,GO作为FRET受体,构建荧光生物传感器用于microRNA的快速灵敏检测。传感器的线性检测区间为10nM-1000nM,检出限为17nM,线性检测区间大,检出限低,说明了DNase I的使用显著增加了传感器的灵敏度。
显然,上述实施例仅仅是为清楚地说明所作的举例,而并非对实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说,在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。而由此所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明创造的保护范围之中。
序列表
<110> 深圳大学
<120> 一种信号放大的荧光检测体系、荧光生物传感器及其用途
<130> ZHA201900568
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(pDNA1)
<400> 1
tcatagccct gtacaatgct gct 23
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(pDNA2)
<400> 2
agaaaggcag caggtcgtat ag 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(pDNA3)
<400> 3
cactggtaca agggttggga ga 22
<210> 4
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列(miRNA1)
<400> 4
agcagcauug uacagggcua uga 23
<210> 5
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(miRNA2)
<400> 5
cuauacgacc ugcugccuuu cu 22
<210> 6
<211> 22
<212> RNA
<213> 人工序列(miRNA3)
<400> 6
ucucccaacc cuuguaccag ug 22