阅读说明：本技术 一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法 (Rapid visual detection method based on water-soluble perylene bisimide derivative ) 是由 姚志轶 黄昆仑 李伊宁 蒋燕萍 贺晓云 于 2020-05-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及叶酸检测领域,公开了一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法。具体的,公开了一种检测叶酸的方法,以式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物作为探针。所述苝酰亚胺衍生物具有良好的水溶性,并且能够实现高灵敏度、特异性且可视化地检测叶酸。本发明提供的检测方法具有较高的检测效率和灵敏度。<Image he="220" wi="700" file="DDA0002488171000000011.GIF" imgContent="drawing" imgFormat="GIF" orientation="portrait" inline="no"></Image>(The invention relates to the field of folic acid detection, and discloses a rapid visual detection method based on a water-soluble perylene bisimide derivative. Specifically, disclosed is a method for detecting folic acid, which uses perylene bisimide derivatives with the structure shown in formula (I) as a probe. The perylene bisimide derivative has good water solubility, and can realize high-sensitivity, specificity and visual folic acid detection. The detection method provided by the invention has higher detection efficiency and sensitivity.)

一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法

技术领域

本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法。

背景技术

叶酸，又称酰谷氨酸，是一种水溶性B族维生素，广泛存在于一些新鲜水果、绿叶蔬菜、动物肝脏和豆类中。其作为一碳单位的辅因子，在维持人体生长和代谢的许多生化过程中起着重要作用。许多研究证实，叶酸缺乏会导致生理功能障碍和某些疾病，如巨幼细胞贫血、精神退行性疾病、新生儿神经管畸形、骨质疏松等症状。

目前，叶酸缺乏被认为是一个世界性的健康问题，世界卫生组织(WHO)已明确规定了每日叶酸的推荐摄入量。随着对健康的重视，叶酸被添加到各种特殊的饮食和保健食品中。因此，对食品中叶酸的快速准确检测，对于指导叶酸的摄入，保证安全性和有效性具有重要意义。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法，具体公开了一种检测叶酸的方法，克服现有检测叶酸的方法中存在的检测效率低，且灵敏度低的缺陷。

为了实现上述目的，本发明提供了以下的技术方案：

第一，本发明提供了式(I)所示的苝酰亚胺衍生物在检测叶酸中的应用：

上述式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测叶酸，在检测中呈现出明显的特异性和抗干扰能力。

本发明的式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物在溶液中构象和聚集状态对外界刺激展现出不同的状态，进而引起其光学特性的变化，如溶液颜色的变化和荧光的开启或淬灭现象。

因此上述苝酰亚胺衍生物用于叶酸的检测时，能够实现荧光响应的效果，即苝酰亚胺衍生物的荧光发生淬灭，并且在紫外灯照射下该淬灭效果肉眼可见。

并且，上述苝酰亚胺衍生物的检测限低至29.2nmol/L，且在溶液中的可视化效果明显，肉眼检测限低至6μmol/L。

本发明提供的苝酰亚胺衍生物之所以具有优异的叶酸检测性能，可能是基于如下原理：本发明的苝酰亚胺衍生物与叶酸可通过多重非共价作用进行识别，在水溶液中二者形成稳定的超分子聚集体，导致探针荧光信号的改变。

本发明对于上述式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物的来源并无特殊限定，可以为一般市售或按照本领域技术人员熟知的方法制备。

为了获得更高质量和收率的式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物，本发明提供如下所述的优选的制备方法制备式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物，具体地：

第二，本发明提供了上述苝酰亚胺衍生物的制备方法，包括以下步骤：

(1)将式(II)所示的化合物与式(III)所示的化合物进行第一接触反应，得到式(IV)所示的化合物；

(2)在溶剂存在下，将所述式(IV)所示的化合物与甲醛、甲酸进行第二接触反应，得到式(V)所示的化合物；

(3)在溶剂存在下，将所述式(V)所示的化合物与甲醇、碳酸钠、碘甲烷进行第三接触反应，得到式(I)所示的化合物；

本发明对式(II)所示的化合物的来源没有特别的限制，例如可以通过商购获得，也可以通过采用现有技术提供的方法合成得到。

优选的，所述第一接触反应的条件包括：反应温度为90-110℃时反应24h，再在120℃下反应4h。

优选的，所述第二接触反应的条件包括：室温下搅拌1h，然后在110-130℃，优选120℃下加热16h。

优选的，所述第三接触反应的条件包括：在室温下搅拌12h，加入碘甲烷后加热至50-70℃，优选60℃，反应时间为12h。

优选的，所述第一接触反应后还包括：所得反应混合物依次进行除溶剂处理和第一沉淀处理，得到式(IV)所示的化合物。

优选的，所述第一沉淀处理具体包括：

将除溶剂处理后所得粗产物固体分别用甲苯和乙酸乙酯清洗后真空干燥。

优选的，所述第二接触反应后还包括：所得反应混合物依次进行除溶剂处理和第二沉淀处理，得到式(V)所示的化合物。

优选的，所述第二沉淀处理具体包括：

将除溶剂处理后所得粗产物固体用无水乙醚清洗后真空干燥。

优选的，所述第三接触反应后还包括：所得反应混合物依次进行除溶剂处理和第三沉淀处理，得到式(I)所示的化合物。

优选的，所述第三沉淀处理具体包括：

将除溶剂处理后所得粗产物固体用无水乙醚清洗后真空干燥。

第三，本发明提供了一种检测叶酸的试剂、试纸或试剂盒，包括上述苝酰亚胺衍生物或上述制备方法制备的苝酰亚胺衍生物。

第四，本发明提供了一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法，具体的，本发明提供了一种检测叶酸的方法，以上述苝酰亚胺衍生物或上述制备方法制备的苝酰亚胺衍生物作为探针。

本发明优选的，所述探针的浓度为3μmol/L。

具体的，本发明具体检测方法如下：在1mmol/L pH＝9.0的三羟甲基氨基甲烷(Tris)缓冲液中，上述探针浓度为3μmol/L进行叶酸的光谱测试，检测时激发波长为498nm，激发光和发射光的狭缝宽度为5.0nm。选择发射波长为548nm处的荧光强度计算探针荧光淬灭效率，以叶酸浓度为横坐标，以探针荧光淬灭效率为纵坐标，建立检测标准曲线。在1mmol/L pH＝9.0的Tris缓冲液中，上述探针浓度为10μmol/L进行叶酸的可视化检测，在紫外灯照射下探针发生肉眼可识别的荧光淬灭。

与现有技术相比，本发明提供了一种基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法，以式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物作为探针。上述苝酰亚胺衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测叶酸。本发明提供的检测方法具有较高的检测效率和灵敏度。

附图说明

图1为Tris缓冲液中(1mmol/L pH＝9.0)加入不同浓度叶酸后苝酰亚胺衍生物探针(3μmol/L)的荧光淬灭效率(λ_ex＝498nm，λ_em＝548nm)；

图2为Tris缓冲液中(1mmol/L pH＝9.0)苝酰亚胺衍生物探针(10μmol/L)与不同物质(10μmol/L)的相对荧光强度(λ_ex＝498nm，λ_em＝548nm),(1-blank,2-叶酸,3-丝氨酸,4-苏氨酸,5-甘氨酸,6-苯丙氨酸,7-谷氨酸,8-组氨酸,9-烟酸,10-维生素C,11-维生素B6,12-维生素B1,13-K⁺,13-Cl^-,14-Ca²⁺,15-Mg²⁺,16-Na⁺,17-NO₃ ^-,18-H₂PO₄ ^-,19-SO₄ ^2-,20-CO₃ ^2-)；

图3为加入不同浓度FA后(0,2,4,6,8,10,15,20μmol/L)，苝酰亚胺衍生物探针(10μmol/L)在紫外灯照射下荧光变化；

图4为加入不同物质(10μmol/L)后苝酰亚胺衍生物探针(10μmol/L)在紫外灯照射下荧光变化(1-blank,2-叶酸,3-丝氨酸,4-苏氨酸,5-甘氨酸,6-苯丙氨酸,7-谷氨酸,8-组氨酸,9-烟酸,10-维生素C,11-维生素B6,12-维生素B1,13-K⁺,13-Cl^-,14-Ca²⁺,15-Mg²⁺,16-Na⁺,17-NO₃ ^-,18-H₂PO₄ ^-,19-SO₄ ^2-,20-CO₃ ^2-)；

图5为在含10％胎牛血清的Tris缓冲液中(1mmol/L pH＝9.0)加入不同浓度叶酸后苝酰亚胺衍生物探针(3μmol/L)的荧光淬灭效率(λ_ex＝498nm，λ_em＝548nm)。

具体实施方式

为了进一步说明本发明，下面结合实施例对本发明提供的基于水溶性苝酰亚胺衍生物的快速可视化检测方法进行详细描述。

备用物质的制备：

缓冲液的制备：称取三羟甲基氨基甲烷固体，用蒸馏水配制成500mL浓度为1mmol/L的Tris缓冲溶液，用1mol/L的氢氧化钠标准溶液调节其pH值为9.0。将其放于4℃冰箱中保存备用。

探针母液的制备：称取式(I)所述的固体，用蒸馏水配制成浓度为1mmol/L的母液，将其分装成相同体积的溶液于小瓶中备用。光谱测试时用配好的Tris缓冲溶液(1mmol/L,pH＝9.0)稀释至一定浓度用于测试。

待测物及干扰物的制备：将叶酸用蒸馏水配制成浓度为1mmol/L储备液备用。其他干扰物用蒸馏水配制成1mmol/L的储备液。将这些溶液放于4℃冰箱中保存备用。

实际样品的制备：叶酸片由北京麦海迪药业有限责任公司生产，将5片(其规格为0.4mg×31片/瓶，每片质量约0.125g)的叶酸片溶解在10mL的超纯水中，于40℃条件下超声4分钟，将物质全部转移至25mL容量瓶中定容，经0.22μm微孔滤膜过滤，滤液用于实验。

实施例1

式(I)所示化合物的制备。取784mg苝酸酐与6mL三(2-氨基乙基)胺反应，在100℃下搅拌反应24h，然后在120℃下反应4h。反应结束后冷却至室温，加入乙醇/乙醚(1:3)使产物沉淀后抽滤。抽滤后，分别用甲苯和乙酸乙酯洗涤三次，在40℃下真空干燥，得到(IV)中所述化合物。取276mg(IV)中所述物质，向其中加入1.28mL85％甲酸和0.88mL 30％甲醛，在室温下搅拌1h，然后在120℃下加热16h。冷却至室温后，加入30mL无水乙醚清洗，反复清洗3次，得到(V)中所述化合物。取150mg(V)中所述化合物，向其中加入6mL甲醇及100m碳酸钠，在室温下搅拌12h，然后向其中加入0.3mL碘甲烷，加热至60℃后反应12h。冷却至室温后，加入40mL无水乙醚清洗，反复清洗3次，得到(Ⅰ)所示化合物(以下简称为探针或苝酰亚胺衍生物)。

其表征如下：¹H NMR(400MHz,CF₃COOD)δ8.88(d,8H),4.97(s,4H),4.43(s,20H),4.18(s,6H),3.48(s,36H)。¹³C-NMR(100MHz,CF₃COOD),δppm：166.0,136.7,133.2,129.6,126.6,124.5,121.6,59.2,54.3,54.1,53.6,48.5,47.3,35.2。

该探针在水中溶解良好，加水即可溶解。

实施例2

荧光光谱的测试：

取3μL的探针母液和950μL 1mmol/L的Tris缓冲液混合加入到1mL的样品池中，混合均匀后，测定探针缓冲液的荧光光谱，记波长为548nm下荧光强度为I₀。随后，向样品池中逐渐加入一定浓度梯度的叶酸，混合均匀后测定相应的荧光光谱，并记录548nm下荧光强度为I。

结果如图1所示(也即，图1表示，Tris(1mmol/L,pH＝9.0)缓冲液中，前述苝酰亚胺衍生物在548nm处的荧光随叶酸浓度的淬灭程度。QI＝[(I₀-I)/I₀]×100％，λ_ex＝498nm，激发光和发射光的狭缝宽度为5.0nm。)

前述苝酰亚胺衍生物在498nm的激发波长下被激发，发射出在548nm处最大发射峰，随着叶酸的加入，前述苝酰亚胺衍生物的荧光发射强度逐渐降低，当叶酸浓度滴加至4μmol/L时，前述苝酰亚胺衍生物的淬灭程度达到了90％。根据检测限的推算方法可知，苝酰亚胺衍生物对叶酸的检测限为29.2nmol/L。

实施例3

选择性研究：

选取检测叶酸时常见干扰物，包括硫胺素(维生素B₁)、维生素B₆、维生素C、烟酸、谷氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、丝氨酸、苏氨酸、Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、SO₄ ^2-、CO₃ ^2-、NO₃ ^-、H₂PO₄ ^-。测试中前述苝酰亚胺衍生物浓度为3μmol/L，所有干扰物浓度均为10μmol/L，在相同的测试条件下进行荧光光谱的测试。将加入干扰物前后苝酰亚胺衍生物在548nm处的吸收值作比值，I₀/I作为衡量前述苝酰亚胺衍生物对待测物的影响程度的参数。

结果如图2所示(也即，图2表示，Tris(1mmol/L,pH＝9.0)缓冲液中，前述苝酰亚胺衍生物与叶酸以及其他干扰物作用的相对吸收值图)。

从图中可以看出，除了叶酸之外，所有其它物质的I₀/I≈1，而叶酸的I₀/I＝16.8，远高于其它化合物，此结果表明前述苝酰亚胺衍生物对叶酸具有优异的选择性。

实施例4

可视化检测：

前述苝酰亚胺衍生物浓度为10μmol/L，加入不同浓度的叶酸。

图3是加入不同浓度叶酸在365nm的紫外灯照射下的照片，可以看出，随着叶酸浓度的增加，相应的溶液荧光从黄色逐渐变暗直到完全淬灭，肉眼检测限为6μmol/L。

实施例5

为了更直观的观察前述苝酰亚胺衍生物与叶酸及其干扰物相互作用后的效果图，在365nm的紫外灯照射下监测了前述苝酰亚胺衍生物在水溶液中对叶酸选择性考察过程中的溶液荧光变化。

选择叶酸以及前述干扰物质，如图4所示，当向10μmol/L前述苝酰亚胺衍生物中加入浓度为10μmol/L的干扰物后，溶液的荧光没有发生变化，而当叶酸加入后，溶液荧光发生强烈淬灭。

实施例6

实际样品的应用：

为了验证该检测方法在实际样品中的可行性，选择叶酸片用于回收率的测定。

在添加0.25μmol/L和0.50μmol/L叶酸后，加标回收率分别为101.4％和101.0％(RSD<6％)，结果表明该方法具有较好的准确度。

实施例7

选择胎牛血清探究生理条件下叶酸的检测，检测方法及指标与前述检测步骤类似。

图5为含10％胎牛血清的Tris缓冲液中叶酸滴定的荧光响应。发现在1.0-10μmol/L的范围内存在良好线性，说明前述苝酰亚胺衍生物一定程度上可用于生理条件下叶酸的定量检测。

由上述结果可知，本发明的式(I)所示结构的苝酰亚胺衍生物具有良好的水溶性，并且能够实现高灵敏度且特异性地检测叶酸，能够进行叶酸的可视化检测。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。