阅读说明：本技术 一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用 (Application of ratio-type fluorescent polymer hydrogel in seafood freshness detection ) 是由 陈涛 刘浩 路伟 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用,利用蓝色有机荧光团和红色发射中心构建具有自校正能力的比率型荧光高分子水凝胶探针,当遇到海鲜变质所释放的生物胺时,红色会被选择性淬灭,进而改变红、蓝荧光强度比值和水凝胶颜色,实现可视化检测；该水凝胶可用于海鲜产品新鲜度的常规快速检验或用于实时指示货架期内海鲜的新鲜度。利用本发明方法及检测管可实现海鲜新鲜度快速、实时的检测,且其检测成本低、操作简便。(The invention discloses an application of ratio-type fluorescent polymer hydrogel in seafood freshness detection, wherein a ratio-type fluorescent polymer hydrogel probe with self-correcting capability is constructed by utilizing a blue organic fluorophore and a red emission center, when biogenic amine released by seafood deterioration is encountered, red is selectively quenched, and then the ratio of red fluorescence intensity to blue fluorescence intensity and the color of the hydrogel are changed, so that visual detection is realized; the hydrogel can be used for conventional quick detection of the freshness of seafood products or used for indicating the freshness of seafood in real time during the shelf life. The method and the detection tube can realize the quick and real-time detection of the freshness of the seafood, and have low detection cost and simple and convenient operation.)

一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用

技术领域

本发明涉及海鲜食品检测技术领域，具体涉及一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用。

背景技术

海鲜食品在储存运输过程中若存放不当，会产生腐坏变质现象，给工厂生产和消费者健康造成严重危害。海鲜腐坏变质主要是由于一些微生物酶的活性导致一些特定氨基酸的酶促脱羧反应，所述酶促脱羧反应发生时会释放生物胺类物质，尤其是尸胺。目前大多数检测海鲜新鲜度的方法主要是基于尸胺浓度，如早期J.T.Coyle利用高压液相色谱法，先将尸胺通过溶剂提取出来，再利用色谱柱来标定浓度，此方法虽然分辨率高，但过程比较复杂，且设备也比较昂贵(Journal of Neural Transmission 1982，53，1-5)；后来S.Annapoorni发明一种基于聚合物的方法，将苯胺溶解后原位生长在PET膜上，在提取后的胺的作用下其电阻可以发生变化，但此方法易受湿气干扰，不能用来实时检测海鲜新鲜度(Sensors and Actuators B2017，240，408-416)。因此，在本领域急需研发一种便捷、高效、可以实时检测海鲜新鲜度的检测装置。

目前，光学检测方法以高分辨率、高选择性以及高辨识度等特点，逐渐成为食品安全检测领域的主流检测方法，如韩道财等发明一种pH响应的检测试纸，根据其与鱼类体表粘液的显色反应判断鱼类的新鲜度(CN 104297235A)；Jose M.Garcia发明一种基于三硝基苯衍生物的聚合物薄膜，根据其与尸胺反应后的颜色变化来表征海鲜新鲜度(Chem.Eur.J.2015,21,8733-8736)；唐本忠等利用可以在尸胺作用下转换成拥有聚集诱导发光(AIE)效应的分子来检测海鲜新鲜度(ACS Sens.2016,1,179-184)。

但这些方法进行可视化检测时均只有一种发光团，检测精度容易受到一些因素的影响，比如：光漂白、周围微环境和光照下的稳定性等；且在大多数检测时荧光强度变化也不容易被肉眼察觉，容易增加误差。

发明内容

针对本领域存在的不足之处，本发明提供了一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用，利用蓝色有机荧光团和红色发射中心构建具有自校正能力的比率型荧光水凝胶探针，可以实现海鲜新鲜度的准确、高效、实时可视化检测，且操作简单、检测成本低。

一种比率型荧光高分子水凝胶在海鲜新鲜度检测中的应用，所述比率型荧光高分子水凝胶的制备方法包括：

(1)将水凝胶单体分子、蓝色荧光分子、吡啶羧酸类化合物、引发剂、交联剂溶解于去离子水和二甲基亚砜的混合溶液中，透析除去二甲基亚砜(DMSO)，形成均匀的水凝胶预聚液；

(2)将所述水凝胶预聚液于-5～0℃聚合8～12h，然后在Eu³⁺盐溶液中浸泡1～10min，取出并用去离子水冲洗即得所述比率型荧光高分子水凝胶；

所述蓝色荧光分子为以下任一结构：

所述吡啶羧酸类化合物与Eu³⁺配合形成红色荧光分子，结构如下任一所示：

本发明将蓝色有机荧光团(蓝色荧光分子)和对生物胺具有响应的红色发光中心(红色荧光分子)引入水凝胶，构建具有自校正能力的比率型荧光水凝胶探针，当遇到海鲜变质释放的生物胺时，红色被淬灭，进而红、蓝荧光强度比值和水凝胶颜色发生改变，实现可视化检测。所述生物胺可以为尸胺、二乙胺、苄胺及三乙胺等。

所述蓝色有机荧光团为可以在紫外光照射下发射蓝色荧光的分子，且对生物胺的响应程度相对较小。

作为优选，所述蓝色荧光分子的制备方法包括步骤：

(a)将4-溴-1,8-萘酐和丙胺或烯丙胺在乙醇存在条件下于75～85℃反应6～10h，然后抽滤得到中间体；

(b)将所述中间体和取代物以及碳酸钾在二甲基亚砜存在条件下于75～85℃、惰性气氛反应10～14h，反应结束后依次加入水和二氯甲烷萃取，最后旋蒸得到所述蓝色荧光分子；

所述取代物为苯酚、甲苯或乙苯。

所述惰性气氛可以是稀有气体或氮气气氛。

进一步优选，步骤(a)中，所述4-溴-1,8-萘酐和丙胺或烯丙胺的摩尔比为1:1～7；

步骤(b)中，所述中间体和取代物的摩尔比为1:1～5。

所述红色发光中心为可以在紫外光照射下发射红色荧光的分子，且对生物胺的响应程度较大，本发明采用吡啶羧酸-铕配合物。

作为优选，所述吡啶羧酸类化合物的制备方法包括步骤：

(A)在氮气保护的冰水浴中将6-氨基吡啶-2-羧酸甲酯溶解在二氯甲烷和三乙胺的混合溶液中，然后逐滴加入二氯甲烷和丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯的混合溶液，搅拌反应2～4h后旋蒸得到粗产品，再用正己烷和乙酸乙酯作为洗脱剂进行色谱柱提纯得到中间产物；

(B)将所述中间产物与氢氧化钠溶解在四氢呋喃(THF)和水的混合溶液中，搅拌20～40min后加入过量HCl溶液，旋蒸除去四氢呋喃，并用去离子水洗涤旋蒸后产物，干燥即得所述吡啶羧酸类化合物。

进一步优选，步骤(A)中，所述6-氨基吡啶-2-羧酸甲酯和丙烯酰氯或甲基丙烯酰氯的摩尔比为1:1.2～6，所述二氯甲烷和三乙胺的混合溶液中二氯甲烷和三乙胺的体积比为4～8:1，所述正己烷和乙酸乙酯的体积比为4～6:1；

步骤(B)中，所述中间产物与氢氧化钠的摩尔比为1:1.5～5，所述四氢呋喃和水的混合溶液中四氢呋喃和水的体积比为1:1～3。

作为优选，所述水凝胶单体分子为N-异丙基丙烯酰胺、聚乙烯醇或N,N-二甲基丙烯酰胺；

所述引发剂为过硫酸钾；

所述交联剂为N,N'-亚甲基双丙烯酰胺。

作为优选，所述海鲜为虾类、蟹类、鱼类或贝类。

在一优选例中，所述的应用具体为：将所述比率型荧光高分子水凝胶与海鲜一起封存，根据所述比率型荧光高分子水凝胶颜色变化判断海鲜新鲜度。

本发明与现有技术相比，主要优点包括：本发明采用比率型荧光水凝胶探针，可使颜色变化更加丰富，检测结果更加准确，且不需要昂贵的检测设备，用肉眼即可判断海鲜新鲜度，具有准确、高效、实时检测的特点，且检测成本低。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的操作方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。

发明人经长期研究和大量实践，提出了本发明的技术方案，主要是依据颜色复配的色度学原理，构建对海鲜变质所释放的尸胺具有响应性的比率型荧光水凝胶探针，实现海鲜变质过程中的可视化实时检测。

具体地，本发明利用蓝色有机荧光团和吡啶羧酸-铕红色发射中心构建具有自校正能力的比率型荧光水凝胶探针，蓝色作为参考色，红色作为响应色，在海鲜变质过程中释放的尸胺作用下，红色逐渐淬灭，导致红、蓝荧光强度比值和水凝胶颜色发生改变，实现可视化检测。

本发明中比色卡可采用下述方法制备：将制好的比率型荧光水凝胶与新鲜的虾类、蟹类及鱼类等一起封存，于室温或4℃冷藏条件下封存，每隔一段时间后拍照，得出凝胶颜色随时间变化的比色卡；同时根据GB/T5009.44-2003《肉与肉制品卫生标准的分析方法》中半微量定氮法测定不同时间下TVB-N的含量，以确定相应时间下肉类新鲜度，从而得到不同凝胶颜色对应海鲜新鲜度的比色卡。

实施例1

4-苯氧基-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺的合成：

1)中间产物的合成：将2.77g 4-溴-1,8-萘酐和0.634g烯丙胺加入到含有40mL乙醇的圆底烧瓶中，80℃下回流8h，冷却到室温后抽滤得到4-溴-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺。

2)将0.316g中间产物4-溴-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺，0.188g苯酚，0.414g碳酸钾在氮气保护下加入到20mL DMSO中，80℃下反应12小时后，反应结束后加入150mL去离子水形成乳浊液，再加入二氯甲烷萃取产物，加入无水硫酸镁后旋蒸得到固体产物4-苯氧基-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺。

实施例2

吡啶羧酸类化合物的合成：

1)中间产物的合成：在氮气保护的冰水浴中将4.6g 6-氨基吡啶-2-羧酸甲酯溶解在40mL二氯甲烷和10mL三乙胺的混合溶液中，然后逐滴加入10mL二氯甲烷和3mL丙烯酰氯的混合溶液，搅拌三小时后通过旋蒸出去溶剂，将得到的粗产物在洗脱剂正己烷和乙酸乙酯的作用下经色谱柱纯化得到6-丙烯酰胺基吡啶甲酸甲酯。

2)将50mg 6-丙烯酰胺基吡啶甲酸甲酯和15.1mg氢氧化钠溶解在体积比为1:1的THF与水的混合溶液中，搅拌30min后加入过量盐酸，然后旋蒸除去THF，产物用去离子水冲洗后再干燥，得到6-丙烯酰胺基吡啶甲酸。

实施例3

比率型荧光高分子水凝胶的制备

1)比率型荧光水凝胶预聚液的制备：将2g N,N-二甲基丙烯酰胺，200mg实施例1的4-苯氧基-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺，100mg实施例2的吡啶羧酸类化合物，30mg水溶性过硫酸钾，以及20mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在溶解在10mL去离子水和DMSO的混合溶液中，透析除去DMSO形成均匀的水凝胶预聚液。

2)将上述预聚液在-4℃的条件下聚合10h，然后在0.1mol L^-1的Eu(NO)₃溶液中浸泡5min后用去离子水冲洗后即得可直接使用的比率型荧光高分子水凝胶。

实施例4

比率型荧光高分子水凝胶的制备

1)比率型荧光水凝胶预聚液的制备：将2g N,N-二甲基丙烯酰胺，100mg实施例1的4-苯氧基-N-烯丙基-1,8-萘二甲酰亚胺，200mg实施例2的吡啶羧酸类化合物，30mg水溶性过硫酸钾，以及20mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在溶解在10mL去离子水和DMSO的混合溶液中，透析除去DMSO形成均匀的水凝胶预聚液。

2)将上述预聚液在-4℃的条件下聚合10h，然后在0.1mol L^-1的Eu(NO)₃溶液中浸泡5min后用去离子水冲洗后即得可直接使用的比率型荧光高分子水凝胶。

对比例1

单一荧光高分子水凝胶的制备

1)单一荧光水凝胶预聚液的制备：将2g N,N-二甲基丙烯酰胺，300mg实施例2的吡啶羧酸类化合物，30mg水溶性过硫酸钾，以及20mg N,N'-亚甲基双丙烯酰胺溶解在溶解在10mL去离子水和DMSO的混合溶液中，透析除去DMSO形成均匀的水凝胶预聚液。

2)将上述预聚液在-4℃的条件下聚合10h，然后在0.1mol L^-1的Eu(NO)₃溶液中浸泡5min后用去离子水冲洗后即得可直接使用的单一荧光高分子水凝胶。

实施例5

取实施例3制备的荧光水凝胶2个，分别与等重的2份海虾一起用保鲜膜封装，然后将2份海虾分别于室温及4℃冷藏条件下放置，于放置1、2、4、7天(d)时记录凝胶颜色；根据制备的比色卡判断海虾的新鲜度，其结果分别见表1和表2。

表1海虾室温存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	绀紫色	淡紫色	淡蓝色	蓝色
新鲜度	新鲜	次新鲜	变质	变质

表2海虾冷藏存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	绀紫色	雪青色	淡紫色	淡蓝色
新鲜度	新鲜	次新鲜	次新鲜	变质

实施例6

取实施例4制备的荧光水凝胶2个，分别与等重的2份海虾一起用保鲜膜封装，然后将2份海虾分别于室温及4℃冷藏条件下放置，于放置1、2、4、7d时记录凝胶颜色；根据制备的比色卡判断海虾的新鲜度，其结果分别见表3和表4。

表3海虾室温存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	黛紫色	淡紫色	淡蓝色	蓝色
新鲜度	新鲜	次新鲜	变质	变质

表4海虾冷藏存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	黛紫色	楝紫色	淡紫色	淡蓝色
新鲜度	新鲜	次新鲜	次新鲜	变质

实施例7

取对比例1制备的荧光水凝胶2个，分别与等重的2份海虾一起用保鲜膜封装，然后将2份海虾分别于室温及4℃冷藏条件下放置，于放置1、2、4、7d时记录凝胶颜色；根据制备的比色卡判断海虾的新鲜度，其结果分别见表5和表6。

表5海虾室温存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	红色	淡红色	暗红色	暗红色
新鲜度	新鲜	次新鲜	变质	变质

表6海虾冷藏存放不同时间后的新鲜度结果

放置时间	1d	2d	4d	7d
					凝胶颜色	红色	淡红色	淡红色	暗红色
新鲜度	新鲜	次新鲜	次新鲜	变质

从实施例5～7可知，本发明提供的基于比率型荧光高分子水凝胶可视化检测海鲜新鲜度的方法颜色变化更加丰富，检测精度更高，新鲜度的类别划分可以更细致，检测结果更加准确，可以高效检测，且检测成本低。本发明比率型荧光高分子水凝胶可用于海鲜产品新鲜度的常规快速检验或用于实时指示货架期内海鲜的新鲜度。

此外应理解，在阅读了本发明的上述描述内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。