阅读说明：本技术 嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用 (Application of stenotrophomonas rhizophila in improvement of rhizosphere soil and promotion of plant growth ) 是由 庄绪亮 刘颖 高婕 白志辉 吴尚华 于 2020-04-22 设计创作，主要内容包括：本说明书一个或多个实施例提供嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用。本说明书一个或多个实施例还提供一种改良根际土壤与促进植物生长的方法,在植物生长初期,在土壤中投加嗜根寡养单胞菌。本发明的嗜根寡养单胞菌可以提高根际土壤中硝态氮与磷等元素含量,改良根际土壤的理化性质,并且提高植物中氮元素的含量。因此,嗜根寡养单胞菌可以代替化肥的使用,在农业生产中发挥作用。(One or more embodiments of the present disclosure provide for the use of stenotrophomonas rhizophila for improving rhizosphere soil and promoting plant growth. One or more embodiments of the present disclosure also provide a method for improving rhizosphere soil and promoting plant growth, wherein stenotrophomonas rhizophila is added into the soil during the early stage of plant growth. The stenotrophomonas rhizophila can improve the content of elements such as nitrate nitrogen, phosphorus and the like in rhizosphere soil, improve the physicochemical property of the rhizosphere soil and improve the content of nitrogen elements in plants. Therefore, stenotrophomonas rhizophila can replace the use of chemical fertilizers and play a role in agricultural production.)

嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用

技术领域

本说明书一个或多个实施例涉及生物技术领域，尤其涉及嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用。

背景技术

植物的生长依赖于从土壤中吸收各种营养元素，限制植物生长的主要元素是氮(N)和磷(P)。氮与磷是植物体内的重要元素之一，是蛋白质核酸的重要组成元素，对于植物的生长与产量有直接的影响。我国是世界上最大的氮肥生产与消费国，但氮肥的利用率低；磷肥在农业生产中也普遍存在施用量大、利用率低的现象。

发明内容

有鉴于此，本说明书一个或多个实施例的目的在于提出嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用。

基于上述目的，本说明书一个或多个实施例提供了嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了嗜根寡养单胞菌在制备植物生长调节剂中的应用。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了嗜根寡养单胞菌在制备生物菌肥中的应用。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌为嗜根寡养单胞菌DSM14405^T，保藏编号为ATCC BAA-473^T。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌能够提高根际土壤中硝态氮、铝、钾、磷和钙的含量。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌能够提高植物中总氮的含量。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌为嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物，通过液体发酵或固体发酵得到。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，在所述嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物中加入表面活性剂，或将所述嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物与吸附载体混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了一种改良根际土壤与促进植物生长的方法，在植物生长初期，在土壤中投加嗜根寡养单胞菌。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌加入土壤中的含量为0.5×10⁷～1.5×10⁷CFU/g。

从上面所述可以看出，本说明书一个或多个实施例提供的嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用，本发明的嗜根寡养单胞菌可以提高根际土壤中硝态氮与磷等元素含量，改良根际土壤的理化性质，并且提高植物中氮元素的含量。因此，嗜根寡养单胞菌可以代替化肥的使用，在农业生产中发挥作用。

附图说明

为了更清楚地说明本说明书一个或多个实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本说明书一个或多个实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本说明书的一个或多个实施例的实验组Sr组与对照组CK组植物长势；

图2为本说明书的一个或多个实施例的普通土壤样本与根际土壤样本采集示意图；

图3为本说明书的一个或多个实施例的实验组Sr组与对照组CK组植物理化性质图。

具体实施方式

为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本公开进一步详细说明。

需要说明的是，除非另外定义，本说明书一个或多个实施例使用的技术术语或者科学术语应当为本公开所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

如背景技术部分所述，我国是世界上最大的氮肥生产与消费国，但氮肥的利用率低；磷肥在农业生产中也普遍存在施用量大、利用率低的现象。过量的氮肥磷肥使用不仅导致作物减产，更对我国农业发展与环境造成了破坏，土壤的肥力与自我修复能力下降；土壤的微生物群落被改变，植物病原菌大量积累；通过土壤渗入河流的氮磷导致水体富营养化；温室气体的排放量增加等等，严重威胁土壤水体大气的生态平衡并产生恶性循环。

因此，除化肥的规范合理化施用外，大力推广发展生物肥料，如植物根际促生菌(PGPR)来代替或辅助无机肥的使用是当务之急。植物根际促生菌通过其直接的固氮溶磷能力，或是通过间接塑造根系微生物群落从而增加固氮溶磷益生菌的丰度等作用，来增加植物对于氮磷的利用率，改良土壤提高土壤肥力，促进植物生长，有利于农业种植的可持续发展。

本说明书一个或多个实施例提供了嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤与促进植物生长中的应用。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了嗜根寡养单胞菌在制备植物生长调节剂中的应用。本说明书一个或多个实施例提供了嗜根寡养单胞菌在促进植物生长中的应用，因此嗜根寡养单胞菌在制备植物调节剂中的应用也在本发明的保护范围内。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了嗜根寡养单胞菌在制备生物菌肥中的应用。本说明书一个或多个实施例提供了嗜根寡养单胞菌在改良根际土壤中的应用，因此嗜根寡养单胞菌在制备生物菌肥中的应用也在本发明的保护范围内。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，嗜根寡养单胞菌(StenotrophomonasrhizophilaDSM14405^T)购置于美国典型微生物菌种保藏中心，保藏编号：ATCC BAA-473^T。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌能够提高根际土壤中硝态氮(NO₃ ^-)、铝(Al)、钾(K)、磷(P)和钙(Ca)元素的含量。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌能够提高植物中总氮(TN)的含量。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌为嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物，通过液体发酵或固体发酵得到。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，在所述嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物中加入表面活性剂，或将所述嗜根寡养单胞菌菌悬液或嗜根寡养单胞菌菌体培养物与吸附载体混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，嗜根寡养单胞菌可以通过常规的液体或固体培养，获得包括细菌悬液、细菌菌体培养物，通过常规的液体发酵生产，然后加入表面活性剂如分散剂、稳定剂、湿润剂、粘结剂、消泡剂、崩解剂、抗冻剂等中的一种或几种，或吸附载体如草炭、褐煤、珍珠岩、蛭石、玉米粉、米糠和稻草粉等按一定比例混合后，制备成可湿性粉剂、水分散粒剂、悬浮剂、悬乳剂、水乳剂或微乳剂。

基于同一发明构思，本说明书一个或多个实施例还提供了一种改良根际土壤与促进植物生长的方法，在植物生长初期，在土壤中投加嗜根寡养单胞菌。可选的，在植物生长初期投加一次嗜根寡养单胞菌菌悬液，便可得到高效改良根际土壤与促进植物生长的效果，该嗜根寡养单胞菌作为生物肥料有很好的市场前景。可选的，嗜根寡养单胞菌菌悬液通过常规的液体发酵生产，例如，嗜根寡养单胞菌菌悬液采用以下方法制备得到：挑取冻存的甘油菌种，划线于LB固体培养基上，将平板倒置培养30℃，48h，待长出单菌落后。挑取一个单菌落至LB液体培养基中，30℃，150rpm，直至培养基中细菌数至2.0×10⁸CFU ml^-1，用无菌水将菌液离心洗涤两次后去除培养基成分，制备成菌悬液。

本说明书一个或多个实施例中，可选的，所述嗜根寡养单胞菌加入土壤中的含量为0.5×10⁷～1.5×10⁷CFU/g。

由上述内容可知，本发明具有以下有益效果：

1、嗜根寡养单胞菌的加入使得根际土壤中硝态氮(NO₃ ^-)、铝(Al)、钾(K)、磷(P)、钙(Ca)的含量显著高于普通土壤，其中根际土壤中硝态氮(NO₃ ^-)的含量高出65.45％，磷(P)含量高出24.38％。

2、嗜根寡养单胞菌的加入显著提高了植物中总氮(TN)的含量。

3、只需在植物生长初期投加一次菌悬液，便可得到高效改良根际土壤与促进植物生长的效果，该菌作为生物肥料有很好的市场前景。

以下，通过具体的实施例来详细说明本说明书一个或多个实施例的技术方案。

以下实例中所涉及到的菌株来源为：嗜根寡养单胞菌(Stenotrophomonasrhizophila DSM14405^T)购置于美国典型微生物菌种保藏中心，保藏编号：ATCC BAA-473^T。

以下实例中所涉及到的培养基和试剂为：

LB液体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH7.0。

LB固体培养基：胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，琼脂(Agar)13g/L，pH 7.4。

PBS缓冲液：氯化钠(NaCl)8g/L，磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)1.44g/L，磷酸二氢钾(KH₂PO₄)0.24g/L，pH值至7.4。

以下实例中所涉及到的植物来源为：油菜(Brassica campestris L.cv.)，京冠1号，购自国家蔬菜工程技术研究中心。

实施例1盆栽实验中嗜根寡养单胞菌的加入

(1)嗜根寡养单胞菌菌悬液的配制

挑取冻存的甘油菌种，划线于LB固体培养基上，将平板倒置培养30℃，48h，待长出单菌落后。挑取一个单菌落至LB液体培养基中，30℃，150rpm，直至培养基中细菌数至2.0×10⁸CFU ml^-1，用无菌水将菌液离心洗涤两次后去除培养基成分，制备成菌悬液，至于4℃短期保存。

(2)植物种子消毒

将油菜种子放入2％次氯酸钠(NaClO)溶液中震荡10min，用无菌水冲洗3次，然后将种子置于4℃中，在黑暗处春化48h后，将种子放入光照培养箱(20℃，12h/12h昼/夜)中培养7天。

(3)实验组与对照组设置

选取长41cm，宽27cm，高16cm的容器在大棚中进行盆栽实验，将大棚中的土壤过筛使其均质化，再将土壤加入盆栽中，每个盆栽内约14169.6g土壤。设置实验组与对照组，分别命名为Sr组与CK组，实验组与对照组各设置三个平行生物重复。

将嗜根寡养单胞菌的菌悬液用无菌水稀释，倒入Sr组中并使其均匀分布，每克土壤含1×10⁷CFU的嗜根寡养单胞菌。CK组加入等量的无菌水。将植物幼苗移栽至盆栽中，种植过程历时59天，见图1。从图1中可以看出，Sr组油菜的长势明显好于CK组的油菜长势。

实施例2嗜根寡养单胞菌对于根际土壤的改良

一、方法

(1)普通土壤样本采集

在每个盆栽未种植植物的土壤(地下1-10cm)区域取样，采用五点采样法后将采集土壤混合后定义为一个普通土壤样本。

(2)根际土壤样本采集

每个盆栽收集10株植物，抖落掉植物根部附着的松动土壤，将根系剪下，用无菌PBS缓冲液彻底冲洗三次，将全部的洗液收集并过0.22μm的滤膜，过滤后附着在膜上的土壤定义为根际土壤，采样示意图见图2。

(3)土壤理化性质检测

检测Sr组与CK组普通土壤和根际土壤的理化性质，包括土壤pH、总氮(TN)、铵态氮(NH₄ ⁺)、硝态氮(NO₃ ^-)、铝(Al)、钾(K)、磷(P)、钙(Ca)元素的含量。

土壤pH的检测：称取过100目筛的土壤样品10g，加入25ml超纯水，20℃，180rpm/min震荡5min，静置1小时，滤纸过滤。使用pH测定仪(LE438,METTLER TOLEDO,瑞士)检测滤液中的pH。

土壤总氮(TN)的检测：过100目筛的土壤样品25mg包入锡纸中，使用元素分析仪(Vario EL III,Elementair,德国)检测。

土壤中铵态氮(NH₄ ⁺)与硝态氮(NO₃ ^-)的检测：称取过100目筛的土壤样品1g，加入10ml 2M氯化钾(KCl)溶液，20℃，180rpm/min震荡30min，静置1小时，上清液过0.45μm滤膜。通过流动分析仪(SAN++,Skalar,Breda,荷兰)测定。

土壤铝(Al)、钾(K)、磷(P)和钙(Ca)的检测：称取过100目筛的土壤样品0.25g，根据标准【HJ832-2017】方法进行赶酸与消解，用1％的硝酸(HNO₃)溶液定容至25ml，通过电感耦合等离子体光谱仪(ICPE-9820,Shimadzu,日本)进行测定。

二、结果

嗜根寡养单胞菌的加入对于根际土壤的改良结果如表1所示，在CK组中，根际土壤与普通土壤的理化性质没有显著差异；Sr组根际土壤中硝态氮(NO₃ ^-)、铝(Al)、钾(K)、磷(P)、钙(Ca)的含量显著高于普通土壤，且根际土壤中的硝态氮(NO₃ ^-)比普通土壤的含量高出65.45％，磷(P)比普通土壤的含量高出24.38％。故而，嗜根寡养单胞菌的加入显著改良了根际土壤的理化性质。

表1 Sr与CK组根际与普通土壤的理化性质

注：数值为平均数±标准误；n＝3；“§”为HSD检验；显著性水平为ns P>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

实施例3嗜根寡养单胞菌对植物生长的影响

一、方法

(1)植物样品的采集

每个盆栽收集10株植物，即每个处理组共收集30株植物，冰上放置移送至实验室。

(2)植物理化性质的检测

测定植株最年轻全开放叶片中叶绿素、可溶性淀粉和可溶性蛋白的含量；其余的植物地上组织，用于测定生物量和总氮(TN)含量。

植物叶绿素(Chlorophyll)的测定：使用叶绿素计(SPAD-502 plus,KONICAMINOLTA,日本)测定。

植物可溶性淀粉(Soluble starch)的测定：蒽酮法。

植物可溶性蛋白(Soluble protein)的测定：考马斯亮蓝法。

植物生物量(Biomass)的测定：将植物放置105℃烘箱内杀青30min后，在60℃下烘干两天后用电子分析天平(ME104E,METTLER TOLEDO,瑞士)称重计算生物量。

植物总氮(TN)的测定：将完全干燥的植物研磨过100目筛，称取6至8mg植物叶片粉末包入锡纸，采用元素分析仪(Vario EL III,Elementair,德国)测定。

二、结果

从表2和图3中可以看出嗜根寡养单胞菌对于植物生长的影响，Sr组的植物生长状态优于CK组，尤其是嗜根寡养单胞菌的加入显著提高了植物中总氮(TN)的含量，故而，嗜根寡养单胞菌的加入促进了植物的生长。

表2 Sr与CK组植物理化性质

注：数值为平均数±标准误；n＝3；“#”数值为平均数±标准误；n＝30；独立样本T检验；显著性水平为ns P>0.05,*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001

所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本公开的范围(包括权利要求)被限于这些例子；在本公开的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本说明书一个或多个实施例的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

本说明书一个或多个实施例旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本说明书一个或多个实施例的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本公开的保护范围之内。