一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途
阅读说明：本技术 一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途 (Site-directed mutagenesis carrier protein and application thereof in preparation of vaccine ) 是由 王浩猛 严志红 晏巧玲 邵娟 史建明 隋秀文 李军强 朱涛 于 2020-07-07 设计创作，主要内容包括：本发明涉及定点突变、定点修饰的蛋白抗原。本发明还涉及定点突变和定点修饰蛋白抗原的方法,所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入到蛋白抗原特定位点,借助非天然氨基酸与修饰剂,所述修饰剂如三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A等受体激动剂,与蛋白抗原定点修饰。本发明进一步涉及定点突变、定点修饰的蛋白抗原的应用,如作为疫苗等用途。(The invention relates to a site-directed mutant and site-directed modified protein antigen. The invention also relates to a method for site-directed mutagenesis and site-directed modification of a protein antigen, which comprises site-directed introduction of an unnatural amino acid into a specific site of the protein antigen using genetic codon expansion techniques, with the aid of the unnatural amino acid and a modifying agent, such as receptor agonists tripalmitoyl-S-glycerocysteine, monophosphoryl lipid A, etc., and site-directed modification of the protein antigen. The invention further relates to the application of the protein antigen of site-directed mutation and site-directed modification, such as the application as vaccine and the like.)
技术领域
本发明涉及生物制药领域，具体地说，本发明涉及一种定点突变、定点修饰的蛋白质及其在制备疫苗，特别是脑膜炎球菌多价疫苗中的用途。
背景技术
脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningococcus,Nm）感染所致的流行性脑脊髓膜炎（流脑），是一种世界范围内致病的急性呼吸道传染病，至今仍严重危害着人类健康，尤其是儿童。脑膜炎奈瑟氏菌根据其荚膜多糖结构的差异可分为13个血清群，且所有血清群均可致病。其中A、B、C、Y、W135群脑膜炎奈瑟氏菌所致病约占脑膜炎奈瑟氏菌相关疾病的95%以上。
其中，基于A、C、Y、W135群脑膜炎球菌荚膜多糖和多糖-蛋白结合的各种单价（A或C）、双价（A\C）和四价（ACYW135）疫苗，在预防侵袭性疾病、控制疾病流行和爆发中起到了十分关键的作用和理想效果，有效控制了疫苗型疾病的发生。
而B群脑膜炎球菌荚膜多糖，由于其包含了与人类抗压潜在交叉免疫的表位，致使其免疫原性很弱，且能诱发自身免疫疾病，因此，以B群Nm荚膜多糖为免疫原的疫苗研究遇到了严重挑战。
目前国际上针对B群Nm疫苗的研究主要采用二种策略，一种是基于外膜蛋白的外膜囊泡（Outer Menbrane Vesicle OMV）疫苗，即针对某些特定流行菌株的克隆群；另一种是基于反向疫苗学技术的重组蛋白疫苗。
上世纪70年代，美国Zollinger、Frasch等首先报道了B群脑膜炎球菌外膜囊泡（OMV）疫苗的研究，随后分别有三种代表性OMV疫苗问世。
1986年，巴西、古巴等南美国家B群流脑开始流行，基于古巴流行B群脑膜炎球菌Cu385/83菌株（B4：P1.19，15），古巴Finlay研究所研制出VA-ENGOC-BC疫苗，含B群OMV、C群CPS（荚膜多糖 ）、AL（OH）3佐剂。1989年获得生产许可，1991年纳入免疫规划，已累计接种5500万剂次。
1991年，挪威公共卫生研究所（Norwegian Institute of Public Health，NIPH）采用流行的B群脑膜炎球菌44/76-SL（B15：P1.7,16）为疫苗株，研制出MenBvacTM B群OMV疫苗，后转让给凯龙（Chiron）公司，并开始研制及规模化生产。
1991年，新西兰出现B群流脑流行，并基于2004-2008年间爆发疾病分离株NZ98/254（CC41/44，B4：P1.7-2.4）研制出B群脑膜炎球菌疫苗MeNZB。
2000年，反向疫苗学技术在B群脑膜炎球菌疫苗上首次应用成功。该技术主要通过基因重组表达技术，分别克隆表达出fHbp、NadA和NHBA三种蛋白作为B群Nm蛋白疫苗的候选成分。目前国际上已有两种通过反向疫苗学技术研发的B群流脑蛋白疫苗，分别是诺华公司的4C MenB（Bexsero）和辉瑞公司的bivalent fHBp（r-fHBp）。4C MenB（Bexsero）含有FHbp1型蛋白、NadA蛋白和NHBA蛋白，之后又加入新西兰B群OMV疫苗（MeNZB）。Bivalent fHBp（r-fHBp）是含有fHbp1型和3型的双价蛋白疫苗。
另外，惠氏公司的rLP2086疫苗，含有单一脂蛋白（rLP2086）的两种重组的脂蛋白LP2086，即两种fHBp重组脂蛋白Subfamily A variant A05和Subfamily B variant01，也是4C MenB的一个组分，试验结果同样显示出能诱导出杀菌抗体。
其他的报道，例如Bruge等曾将纯化B群Nm荚膜多糖中的乙酰基团用丙酰基团取代，再与载体蛋白结合而制备多糖-蛋白结合疫苗，尽管试验证明该疫苗安全性良好，但诱导的抗体无功能活性。
尽管B群脑膜炎球菌疫苗研发历史久远，且已有多个上市或在研产品，仍然存在问题亟待解决。
1、目前尚无国际通用的B群脑膜炎球菌OMV疫苗
由于不同国家、地区B群流脑流行血清型别、亚型具有明显的地域特征，至今为止开发的OMV疫苗不具有通用性。因而，对于B群流脑OMV疫苗的研发，选择适合本地区疾病发病特征的菌株尤为重要。欧洲地区B群Nm以ST-41/44clonal complex（CC.克隆群）血清型15型为主，美洲和大洋洲B群Nm以ST-8CC、ST-11CC和ST-32CC血清型4型为主。我国流脑监测和Nm分子流行病学研究发现，我国B群流行菌型与国外B群流行型别不同，主要以ST-4821CC血清型3型为主，并在健康人群中大量定植。古巴、挪威、新西兰等国根据本国主要流行的B群流脑优势致病株作为疫苗株“定制”的B群Nm OMV疫苗，所用菌株如下：古巴：VA-MENGOC-BC®疫苗株：Cu385/83（PorA：P1.19，15，PorB：血清型4型）；挪威：MenBvac TM疫苗株：44/76-SL（PorA：P1.17，16，PorB：血清型15型）；新西兰：MenZB疫苗株：NZ98/254（PorA：P1.7-2.4，PorB：血清型4型）。GSK受让古巴VA-MENGOC-BC®疫苗技术，并将该疫苗推广至其他国家，在不同地区的临床研究保护率各有不同。在1987-1989年，Sierra报道在古巴对106000名10-14岁学生接种2针（间隔6-8周）其保护率为83%；在1989-1990年，Moraes报道在圣保罗进行的于24-47月龄儿童中保护率为47%；在47月龄以上儿童中的保护率为74%；1990-1991年，Moronha报道在里约热内卢进行的多个在47月龄以上儿童中的临床研究显示器保护率为58-74%。1992年在巴西进行的流行病学效果观察，其对4岁以上人群的保护率为74%，而对2岁以下人群无保护性，由此有学者提出该疫苗对4岁以下儿童缺乏保护作用。该疫苗自1989年被批准使用以来，在古巴、巴西、哥伦比亚、乌拉圭等美洲国家的使用，成功控制了流脑流行，尤其重要的是其中的一些流脑爆发是由不同的B群菌株引起的。由Cassio de Moraes开展的实验得出的结论是“这一发现提示，该疫苗能够提供针对一部分B群脑膜炎球菌感染的保护作用，而不仅仅是疫苗型菌株”。自1991年起，VA-MENGOC-BC®被列入部分古巴婴幼儿疫苗接种规划中。争论的焦点—对4岁以下人群保护作用低的假说，包括伦敦皇家医学院的许多学者、专家论证认为，VA-MENGOC-BC®即使用于婴幼儿接种也能引起适当的免疫应答。
VA-MENGOC-BC®是多年来唯一获得批准的B群脑膜炎球菌OMV疫苗，并在主要为拉丁美洲和加勒比海地区的15个国家共接种了约5500万剂，被证明是全球第一个安全、有效的商业化疫苗。随后各国研究的各自“定制”的OMV疫苗，也从中获得了重要经验。但至今仍没有一个国际通用的B群脑膜炎球菌OMV疫苗。
2、OMV疫苗的保护覆盖范围的局限性
B群脑膜炎球菌根据其PorA和PorB的蛋白分型相当复杂，血清型、亚型间彼此交叉保护性低，因此，有限价数的“定制”疫苗的保护覆盖范围有限。
B群脑膜炎球菌OMV中的PorA被确定是一个主要的免疫应答诱导物，并且是血清杀菌抗体的靶点，许多脑膜炎球菌都表达这一蛋白。然而，不同的PorA蛋白具有不同的抗原特异性，因此，一种PorA引起的免疫应答不能对异源PorA抗原的菌株起到防御作用。在美国进行的B群Nm菌株流行情况调查时发现，将20种不同的PorA蛋白组合起来将会覆盖80%流行菌株。MenB OMV疫苗已成功用于控制疾病的流行、爆发，但其有效性仅局限于控制疫苗型、亚型MenB疾病爆发，对于不同型、亚型MenB引起的疾病，其有效性受限。
3、MenB OMV生产工艺影响其抗原性
至今为止，各国MenB OMV疫苗生产工艺各不相同，导致疫苗成分、含量、纯度及抗原天然构象完整性，均有不同程度的差异和受损。
由于MenB的结构、成分比较复杂，其OMV抗原成分是从菌体细胞膜溶出、纯化而获得的。OMV是一种源自细菌细胞膜的，具有复杂立体构象的多种蛋白成分、LPS等组成的囊泡状结构的多位点抗原复合体，各抗原位点的协同作用而取得更好的免疫效果。
早期的研究过分强调蛋白纯度，而采用了比较复杂的物理、化学相结合的重复工艺，破坏了OMV的天然构象和减弱了丰富的抗原位点，因而影响了疫苗的免疫原性及抗体特异性，致使保护率和免疫持久性不佳。
4、“广谱”的B群脑膜炎球菌疫苗（如诺华4C MenB，Bexsero）难以达到广泛保护性
由于OMV疫苗具有所选流行菌株的地域特异性及以上因素的影响，因而难以具有广泛的通用性和有效性，因此，诺华和辉瑞公司基于反向疫苗学技术分别研发了包含多种蛋白成分的B群脑膜炎球菌疫苗4C MenB（Bexsero），以期达到更广泛的针对B群菌株的覆盖率。
4C MenB（Bexsero）含5种经反向疫苗学技术筛选的经大肠杆菌表达的蛋白抗原，分别为：fHbp（H因子结合蛋白，最初命名为LP2086）、NHBA（奈瑟菌肝素结合抗原）、NadA（脑膜炎球菌粘附素A），另外两种蛋白为GNA2091和GNA1030，分别与fHbp和NHBA结合形成融合抗原GNA2091-fHbp和GNA1030-NHBA，后又增加了一株新西兰流行菌株（NZ98/254；P1.7-2.4，ST41/44）的B群OMV（MeNZB®）组成。
作为一种广谱的B群脑膜炎球菌疫苗，4C MenB疫苗对不同B群Nm的广泛保护性一直备受争议。不同国家流行的代表性B群菌株不同，该疫苗中仅含有一种PorA蛋白的OMV，也只是针对P1.7-2.4型的B群菌株能产生保护力。不同国家流行的B群Nm PorA型别不同，4CMenB疫苗PorA菌株覆盖率受不同流行B群菌株PorA型别的影响，具有局限性。
4C MenB疫苗中的fHbp为Variant1型，免疫血清对于fHbp Variant1型菌株的有效性可达95%，但是对Variant 2型或3型菌株的保护性仅为56%。美国B群致病菌株中35%为Variant 2型或3型。我国B群脑膜炎球菌中约90%的菌株为Variant 2型。
此外，4C MenB疫苗中的NadA为主要的抗原成分，但是不同地区流行的B群脑膜炎球菌中大部分并不表达NadA，如美国36%的B群菌株不含NadA基因，我国超过90%流行的B群脑膜炎球菌菌株不含NadA基因。因此，4C MenB疫苗并不适合我国疾病的预防。
总体而言，回顾数十年来各国对B群Nm OMV蛋白疫苗的研发，临床应用效果显示，在不同地区差异较大，分析原因可能存在以下因素：
①B群Nm型别、亚型较多，彼此间交叉保护性弱；
②各地区流行菌株的抗原性具有地域特征差异及目前尚未被揭示的诸多因素影响；
③国外疫苗制备工艺的复杂性和过度纯化，改变了菌体抗原的立体天然构象（蛋白二、三、四级空间构象），所诱导的抗体针对自然界流行菌株侵袭缺乏特异性；
④多步纯化工艺也导致了丰富抗原位点的丢失、损伤、单一，影响其抗原性。
利用叠氮基和炔基的Click反应在生物分子体系中进行修饰是近年来研究的热门领域。Natalie W.Nairn等利用甲硫氨酸缺陷型菌在干扰素β中引入含有叠氮基团的非天然氨基酸，然后利用有铜催化的Click反应进行单位点的PEG修饰（Natalie W.Narinetal,Bioconjugate Chem.2012）。
遗传密码扩展技术，近年来遗传密码扩展技术发展迅速，利用琥珀终止密码子为有义编码子，通过引入相应的正交tRNA及氨酰tRNA合成酶，最终可以将设计好的非天然氨基酸引入蛋白质中，根据非天然氨基酸的性质，可以赋予蛋白质特殊的功能。到目前为止，这一技术已经将几十种非天然氨基酸成功地定点表达在活细胞的蛋白质当中，涉及的非天然氨基酸包括炔基和叠氮等，利用这些生物体重本来不存在的特殊基团，就可以特异性地对蛋白质进行定点修饰。面对现有技术中重组蛋白疫苗中脂质化程度不均一，分离纯化工艺复杂等问题，该领域迫切需要在特定位点特异性修饰功能基团的重组蛋白疫苗，以保证产品批间一致性。在疫苗领域，该技术也有所应用，例如CN106929482A描述了定点突变的流感病毒、其活疫苗及其制备方法和应用，使用基因密码子扩展技术和基因密码子拓展技术将非天然氨基酸定点引入流感病毒的任意基因中，从而提高其安全性和免疫原性。CN110845587A记载了定点突变的白喉类毒素、白喉毒素的载体蛋白及其在制备疫苗中的应用，所述免疫原性组合物在载体蛋白基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有交联性质的非天然氨基酸定点突变到载体蛋白的特定位点。在载体蛋白与多糖抗原相互反应过程中，形成共价键，同时结合物呈现连珠式状态，可有效避免载体蛋白与多糖抗原发生过度交联，结合物粒径分布显著均匀可控，为提高多糖蛋白结合疫苗质量提供了有效的手段。然而上述现有技术仅局限在将非天然氨基酸定点突变到目的蛋白的特定位点，未对其进行进一步修饰。
本发明的预修饰的重组蛋白fHBP已经证明可预防B群脑膜炎球菌的侵染，惠氏公司的Bivalent fHBp（r-fHBp）是含有fHbp1型和3型的双价蛋白疫苗，已经在青少年年人群证明，有杀菌作用，但在婴幼儿组中，有发烧、局部红肿等副作用人群比例明显增加，猜测为脂质化程度不均一，导致副作用增加。因此急需对B群脑膜炎球菌的重组蛋白fHBP进行进一步修饰，以提高其免疫原性，并降低副作用。
因此本发明提供了一种定点引入非天然氨基酸的fHBP蛋白及其定点修饰的方法，该突变方法为针对蛋白中特定位点引入的非天然氨基酸Lys-azido，其特有的叠氮基团可以特异性地和修饰剂发生Click反应，从而将非天然氨基酸定点偶联在目的蛋白上。
发明内容
本发明涉及一种定点突变和定点修饰的免疫原性组合物、其制备方法及其应用，所述免疫原性组合物在抗原蛋白基因的特定位点引入琥珀密码子TAG，利用正交的氨酰tRNA合成酶-tRNA将具有交联性质的非天然氨基酸定点突变到抗原蛋白的特定位点。抗原蛋白与脂质体经Click反应，形成共价键，所得脂质蛋白，可有效避免重组脂质蛋白在表达过程中脂质化不均一的缺点，所得定点修饰脂质蛋白，脂质体长度一致，质量显著可控，为提高脂质蛋白疫苗质量提供了有效的手段。
发明人经过对现有技术的思考和研究，利用古甲烷球菌的tRNA（tRNAPyl）和吡咯赖氨酸-tRNA合成酶（tRNAPyl/PylRS）的蛋白质翻译系统使非天然氨基酸定点掺入到蛋白中，从而得到定点突变的目的肽或蛋白，如B群脑膜炎球菌fHBP蛋白Subfamily A中variant2、3 ，Subfamily B中variant 1，后将所述定点突变的抗原蛋白作为可被进一步定点修饰的原料，对该定点突变的抗原蛋白与脂质体进行缀合进而得到定点修饰的脂质蛋白疫苗。
据此，本发明提供了一种定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原，其中所述的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原选自Subfamily A中variant2、3 ，Subfamily B中variant 1中的一种或两种以上蛋白抗原，其中所述载体蛋白上至少1个位点上的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸含有叠氮基或炔基端基。
所述的非天然氨基酸为苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物或赖氨酸衍生物。优选的，所述的非天然氨基酸为含有叠氮基的赖氨酸衍生物。更优选的，所述的非天然氨基酸为：
。
在本发明的一个实施方式中，所述的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原Subfamily A中variant2，所述突变位点可为SEQ ID NO:1中任何位点上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自示于SEQ ID NO:1的序列的第2-10位或其他不影响抗原表位的位点。
在本发明的一个实施方式中，所述的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原Subfamily A中variant3，所述突变位点可为SEQ ID NO:2中任何位点上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:2的序列的第2-10位或其他不影响抗原表位的位点。
在本发明的一个实施方式中，所述的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原Subfamily B中variant 1，所述突变位点可为SEQ ID NO:3中任何位点上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:3的序列的第2-10位位或其他不对影响抗原表位的位点。
经过突变后，所述定点突变的蛋白与突变前的目的蛋白的氨基酸的序列的区别在于：突变前蛋白氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸的连接方式如下式所示：
,
其中，所述的N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸 。
本发明还提供一种定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白抗原偶联物，所述的偶联物为本发明所述的定点突变的载体蛋白与含有或修饰的炔基端基的化合物制备得到，所述的分子为含有糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物，或者，糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物通过末端炔基的修饰得到的修饰物。
本发明所述的定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白与含有或修饰的炔基端基的分子通过Click反应制备得到。所述的Click反应可以为一价铜介导的Click反应，也可以是环辛炔或其衍生物介导的无铜Click反应。
本发明所述的糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物可为糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物的末端炔基的修饰物，通过一价铜的催化作用，实现定点偶联制备得到偶联物，或者糖、核酸、氨基酸、多肽或小分子化合物为以环辛炔或其衍生物为修饰基的修饰物，直接实现定点偶联。
优选的，本发明所述的定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的偶联物，突变前蛋白氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为如下结构：
，或者
其中，
N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸，
R2为糖、核酸、氨基酸、多肽或羧基端修饰基团。
本申请还提供了一种免疫原性组合物，其中本发明所述的糖缀合物以及药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。
本发明还提供了所述的定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白、所述的定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的偶联物，或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。
优选的，所述的疫苗为脑膜炎球菌疫苗。
具体的，本发明涉及一种定点突变的蛋白，其中所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上突变蛋白，其中所述蛋白抗原上至少1个位点的氨基酸被突变为非天然氨基酸，所述非天然氨基酸含有叠氮基、炔基端基或其他活性基团。
所述的蛋白选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白中的一种或两种以上形成的变异体蛋白，优选的，所述的蛋白抗原选自B群脑膜炎球菌fHBP蛋白Subfamily A中variant2、3 、Subfamily B中variant 1。
所述的非天然氨基酸为苯丙氨酸衍生物、酪氨酸衍生物、谷氨酰胺衍生物、丙氨酸衍生物、半胱氨酸衍生物、丝氨酸衍生物或赖氨酸衍生物。
所述的非天然氨基酸为
。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点为SEQ ID NO:1中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:1序列的第2-10位氨基酸。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点为SEQ ID NO:2中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:2的序列的第2-10位氨基酸。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点可为SEQ ID NO:3中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:3的序列的第2-10位氨基酸。
所述蛋白的氨基酸序列的第N位氨基酸被突变为Lys-azido，所述突变氨基酸的连接方式如下式所示：
,
其中，所述的N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸。
具体的，本发明还涉及一种定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的偶联物，所述的偶联物为权利要求1-8任意一项所述的定点突变的蛋白进一步与修饰化合物偶联，所述修饰化合物为TLR2受体激动剂。
所述激动剂为选自三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A、二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或其类似物。
所述蛋白的氨基酸序列的第N位氨基酸被突变修饰为如下结构：
，或者，
其中，
N为突变位点，AA为突变位点前后的氨基酸，
n=1~20，R2为TLR2受体激动剂。
所述的R2为三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A、二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或其类似物，优选三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物，选自如下结构式的类似物：
、或,其中n，m=1~6。
所述的R2为单磷酰脂质A受体激动剂衍生物，优选单磷酰脂质A受体激动剂，结构式如下：
，n=1~20，R端可与定点突变的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白偶联，
其中，R3选自磷酸根或H；
R4选自， n为1,3,5；或；
R8选自H或OH；
R5选自；
R6选自H或；
R7选自或。
其中所述偶联物中B群脑膜炎球菌fHBP蛋白：修饰化合物的摩尔比为1:1-30。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点为SEQ ID NO:1中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:1的序列的第2-10位氨基酸。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点为SEQ ID NO:2中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:2的序列的第2-10位氨基酸。
所述B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的突变位点可为SEQ ID NO:3中第2-30氨基酸序列上一个或多个的氨基酸，优选地，所述突变位点选自：示于SEQ ID NO:3的序列的第2-10位氨基酸。
具体的，本发明还涉及一种疫苗或免疫原性组合物，所述疫苗包含权利要求1-8任意一项所述的定点突变的蛋白或权利要求9-17任意一项所述的偶联物中一种或多种
其中所述疫苗或免疫原性组合物同时包含权利要求5-7中的三种定点突变的蛋白形成多价疫苗或免疫原性组合物，或同时包含权利要求15-17中的三种偶联物形成多价疫苗或免疫原性组合物。
所述B群脑膜炎球菌fHBP定点突变的蛋白或偶联物的剂量为10~100微克。进一步包含药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂。所述疫苗或免疫原性组合物进一步与ACW135Y群流脑结合疫苗联合使用。
所述疫苗或免疫原性组合物的每剂量含5~10微克A群脑膜炎球菌多糖抗原，每剂量含5~10微克C群脑膜炎球菌多糖抗原，每剂量含5~10微克W135群脑膜炎球菌多糖抗原，每剂量含5~10微克Y群脑膜炎球菌多糖抗原，每剂量含10~100微克B群脑膜炎球菌fHBP定点突变的蛋白或偶联物。
具体的，本发明还涉及所述的定点突变的蛋白、所述的偶联物，或所述的免疫原性组合物在制备疫苗中的用途。其中所述的疫苗为脑膜炎球菌疫苗。
具体的，本发明还涉及一种定点突变和定点修饰蛋白抗原的方法，所述方法包括使用基因密码子扩展技术将非天然氨基酸定点引入到蛋白特定位点获得定点突变的蛋白，所述定点突变的蛋白进一步与修饰化合物偶联，所述修饰化合物为脂质蛋白类受体激动剂。
所述非天然氨基酸为。
所述脂质蛋白类受体激动剂选自三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸、单磷酰脂质A、二棕榈酰-S-甘油基-半胱氨酸或其类似物。
所述三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物，选自如下结构式的类似物：
、或,其中n，m=1~6。
具体的，本发明还涉及一种用于定点突变和定点修饰蛋白抗原的三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物，选自如下结构式的类似物：
、或,其中n，m=1~6。
相比于其他方法，本发明的优点可体现在如下中的一个或几个：
1. 可以在蛋白质任意位点引入非天然氨基酸，从而创造可以仅对该位点进行特异性修饰的蛋白抗原；
2. 利用非天然氨基酸上特有的活性基团，可以实现高效，特异性地修饰目的；
3. 通过修饰条件的优化，利用环辛炔介导的无铜Click反应，可以实现高效，对蛋白无害，简单易行的修饰反应；
4. 通过引入结构确认的修饰基团，得到的B群脑膜炎球菌fHBP蛋白的偶联物成分均一，质量可控，保证免疫原性同时可显著降低副反应程度；
5.本发明制备的偶联物，可以与ACW135Y群流脑结合疫苗联合使用，提高其保护覆盖度。
附图说明
图1 MenB-V1.55蛋白粒径图；
图2 MenB-V2.16蛋白粒径图；
图3 MenB-V1.55-G2-L1蛋白粒径图；
图4 MenB-V2.16-S3-L1蛋白粒径图；
图5 MenB-V2.16-S3-L1蛋白粒径图。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1 定点突变的MenB蛋白表达质粒的构建
1. 突变位点的选择
天然MenB在其N末端发生脂化修饰，这一修饰不影响MenB蛋白三维结构，起到将抗原锚定到细胞膜上的作用。结构研究显示MenB蛋白N末端前20个氨基酸并未折叠形成二级结构，呈舒展状态，其作用是将抗原部分穿过细菌外膜暴露于细菌表面。因此突变的位点优先选择N末端的20个氨基酸，其中优先选择第2-10位。具体突变位点的信息见表1-3，其中氨基酸位置分别是指在SEQ ID NO：1-3 所示的序列上的位置。
SEQ ID NO.1：
cgssggggsggggvtadigtgladaltapldhkdkglksltledsisqngtltlsaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqvykqshsaltalqteqeqdpehsekmvakrrfrigdiagehtsfdklpkdvmatyrgtafgsddaggkltytidfaakqghgkiehlkspelnvdlavayikpdekhhavisgsvlynqdekgsyslgifgekaqevagsaevetangihhiglaakq
SEQ ID NO.2：
cgssggggvaadigagladaltapldhkdkslqsltldqsvrkneklklaaqgaektygngdslntgklkndkvsrfdfirqievdgqlitlesgefqiykqdhsavvalqiekinnpdkidslinqrsflvsglggehtafnqlpdgkaeyhgkafssddaggkltytidfaakqghgkiehlktpeqnvelaaaelkadekshavilgdtrygseekgtyhlalfgdraqeiagsatvkigekvheigiagkq
SEQ ID NO.3：
cgssggggvaadigtgladaltapldhkdkglksltledsisqngtltlsaqgaektfkvgdkdnslntgklkndkisrfdfvqkievdgqtitlasgefqiykqdhsavvalqiekinnpdkidslinqrsflvsglggehtafnqlpsgkaeyhgkafssddaggkltytidfaakqghgkiehlktpeqnvelasaelkadekshavilgdtrygseekgtyhlalfgdraqeiagsatvkirekvheigiagkq
表1 V1.55突变位点
表2 V2.16突变位点
表3V3.45突变位点
2. 表达质粒的获得
根据NCBI GenBank公布的MenB V.155, V2.16及V3.45基因序列（genbank序列号分别为AAR84481， AAR84445，AAR84435，分别对应SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3），经分别全基因合成获得基因全长DNA片段，然后分别融合构建于pET28a载体的NcoI和XhoI两个酶切位点之间，保留C末端His纯化标签，分别获得pET28a-MenB-V1.55，pET28a-MenB-V2.16，pET28a-MenB-V3.45表达质粒。
3. 定点突变
使用全式金公司的Fast Mutagenesis System定点突变试剂盒，根据其使用说明，用前述pET28a-MenB-V1.55，pET28a-MenB-V2.16和pET28a-MenB-V3.45表达质粒做模版，使用表4-6中的突变引物对，完成各突变；对于突变后获得的质粒，进行测序验证工作。测序结果表明，均成功将各突变位点基因突变为TAG，得到9个定点突变的质粒。
MenB-V1.55的9个突变克隆命名为：
pET28a-MenB-V1.55-G2，pET28a-MenB-V1.55-S3，pET28a-MenB-V1.55-S4，pET28a-MenB-V1.55-G5，pET28a-MenB-V1.55-G6，pET28a-MenB-V1.55-G7，pET28a-MenB-V1.55-G8，pET28a-MenB-V1.55-S9，pET28a-MenB-V1.55-G10。
MenB-V2.16的9个突变克隆命名为：
pET28a-MenB-V2.16-G2，pET28a-MenB-V2.16-S3，pET28a-MenB-V2.16-S4，pET28a-MenB-V2.16-G5，pET28a-MenB-V2.16-G6，pET28a-MenB-V2.16-G7，pET28a-MenB-V2.16-G8，pET28a-MenB-V2.16-V9，pET28a-MenB-V2.16-A10。
MenB-V3.45的9个突变克隆命名为：
pET28a-MenB-V3.45-G2，pET28a-MenB-V3.45-S3，pET28a-MenB-V3.45-S4，pET28a-MenB-V3.45-G5，pET28a-MenB-V3.45-G6，pET28a-MenB-V3.45-G7，pET28a-MenB-V3.45-G8，pET28a-MenB-V3.45-V9，pET28a-MenB-V3.45-A10。
表4 MenB V1.55 突变引物列表
表5 MenB V2.16突变引物列表
表6 MenB V3.45突变引物列表
实施例 2 突变蛋白的Lys-azido掺入表达及纯化
将实施例1的获得的表达质粒pET28a-MenB-V1.55-G2、pET28a-MenB-V2.16-S3、pET28a-MenB-V3.45-S4在LB培养基中37℃培养12~16小时后，再经二次扩增至菌液OD值到0.6~1.0时，加入Lys-azido至终浓度1mM，37℃继续扩增30分钟，加入IPTG至终浓度0.5mM，阿拉伯糖终浓度0.2%，24℃诱导表达12小时后收集菌体。
将收集的菌体用Ni-NTA-Bind-Buffer平衡重悬，超声破碎，离心去除细胞碎片，经过Ni-NTA金属螯合亲和层析，用Ni-NTA-Wash-Buffer充分洗涤，最后用Ni-NTA-Elute-Buffer洗脱，得到初步纯化的蛋白样品pET28a-MenB-V1.55-G2，pET28a-MenB-V2.16-S3，pET28a-MenB-V3.45-S4纯度约为90%。
V1.55、V2.16、V3.45的其他突变蛋白也分别按上述方法制备，限于篇幅，未全部记载入本申请说明书中。
实施例3 三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物8的合成
三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物8合成路线如下：
1、将化合物1（5g）和丙酮叉（5g）溶于二氯甲烷中（100ml），待溶解完全后，冰水浴中缓慢加入PTSA（0.9g），加入完全后撤去冰浴，室温下搅拌2小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物2。
2、将化合物2（5g）溶于DMF（100ml）中，后依次加入EDCI（5g）、HOBT（3.5g）、TEA（10g），搅拌3~5分钟，后加入化合物a（6g），加入完毕后，置于80℃油浴锅中反应过夜。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物3。
3、将化合物3（5g）溶于二氯甲烷（100ml）中，溶解完全后，向体系中加入1N HCl甲醇溶液（20ml），室温搅拌3小时。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物4。
4、将化合物4（5g）溶于DMF（100ml）中，溶解完全后，依次向体系中依次加入三苯基氯硅烷（8g）和咪唑（1g），40℃下搅拌过夜。反应结束后，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物5。
5、将化合物5（5g）和化合物b（6g）溶于DMF（100ml）中，同时加入分子筛（10g），后加入浓硫酸3~5滴，置于80℃油浴锅中反应过夜。反应结束后，过滤除去分子筛，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物6。
6、将化合物6（5g）溶于乙酸（100ml）中，溶解完全后， 120℃下回流6h。TLC法监测反应进程，待原料反应完全后，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物7。
7、将化合物7（5g）和化合物c（6g）溶于DMF（100ml）中，同时加入分子筛（10g），后加入浓硫酸3~5滴，置于80℃油浴锅中反应过夜。反应结束后，过滤除去分子筛，减压蒸馏除去溶剂，采用硅胶层析柱纯化得化合物8。
流程图如下：
采用相同方法，可得三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸其他类似物L1-L15：
实施例4突变蛋白pET28a-MenB-V1.55-G2与三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物通过铜催化Click反应偶联
反应体系如下：
pET28a-MenB-V1.55-G2蛋白 1微克每微升
三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸化合物8 20微克每微升
Cu2+ 1mM
BTTES 400微摩尔
PBS 0.01M（pH≈7）
Cu丝小段（足量）
注：（1,2,3-triazol-1-yl）ethanesulfonic acid，简称BTTES）
反应条件：4℃，垂直混悬30分钟，反应结束后加入EDTA至1mM终止反应，获得的最终产物是三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物与pET28a-MenB-V1.55-G2蛋白定点偶联结合物MenB-V1.55-G2-L1。
实施例5突变蛋白pET28a-MenB-V2.16-S3与三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物通过铜催化Click反应偶联
同实施例4操作步骤，得到三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物与pET28a-MenB-V2.16-S3蛋白定点偶联结合物MenB-V2.16-S3-L1。
实施例6突变蛋白pET28a-MenB-V3.45-S4与三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物通过铜催化Click反应偶联
同实施例4操作步骤，得到三棕榈酰-S-甘油半胱氨酸类似物与pET28a-MenB-V3.45蛋白定点偶联结合物MenB-V3.45-S4-L1。
用实施例4~6的方法，同时制备了不同脂质体的蛋白定点偶联结合物，见下表：
实施例7三价fHBP蛋白疫苗的配制
选择本发明所制备的突变蛋白修饰物中的三个突变体，将三种变异型重组B群fHBP脂化蛋白MenB-V1.55-G2-L1、MenB-V2.16-S3-L1、MenB-V3.45-S4-L1，分别以氢氧化铝佐剂吸附，4℃搅拌过夜，吸附率在95%以上。以0.15mol每升氯化钠稀释配制，至蛋白终浓度分别为240微克每毫升。铝含量终浓度为0.45~0.6毫克每毫升，pH值5.8~7.2。
实施例8流行株的杀菌力（SBA）试验
采用B群脑膜炎球菌440902菌株，该菌株为ST4821序列型，属ST4821序列群，为国内近期B群脑膜炎球菌流行菌株，fHBP分型为V2变异体。
靶菌的制备：培养流行性脑膜炎球菌440902菌株，于8~12%养血琼脂平板上，37℃6~10%二氧化碳培养16~18小时，刮取菌苔至生理盐水中，细菌比浊法计数，根据计数，将靶菌稀释至1X106。
将待检小鼠血清于56℃灭活1小时，以灭火小鼠血清固有补体活性。实验过程中将Pel-Freez幼兔子补体加入到待检小鼠血清中，同时设置灭火补体、补体对照，倍比稀释至96孔培养板上，并滴加新鲜配制的靶菌10微升。震荡混匀后于37℃培养2~4小时。
点样：取培养后的混合菌液，以10微升的量滴加至固定营养琼脂综合培养基上，37℃ 5%二氧化碳培养过夜。
显色：将含有150~300微克每毫升的TTC的软琼脂覆盖在过夜培养的固体影响琼脂综合培养基上，以适宜温度、适宜时间显色。
计数：高清拍摄显色菌落照片，采用图像扫描技术，以专有分析软件分析并计算细菌菌落个数，以杀菌力结果计算软件计算杀菌滴度，结果如下：
小鼠血清杀菌力滴度
菌株440902
MenB-V1.55-G2-L1
MenB-V2.16-S3-L1
MenB-V3.45-S4-L1
三价fHBP
生理盐水
杀菌力滴度
26±1.5
1373±52.3
458±15.1
1420±67.1
2.2±0.1
实施例9 其他偶联物杀菌力（SBA）试验结果
实施例10急性毒性和异常毒性试验
本试验利用不同剂量的药物急性毒性反应，将一定剂量的供试品溶液（实施例4、5和6中制备MenB-V1.55-G2-L1、MenB-V2.16-S3-L1、MenB-V3.45-S4-L1组成得到的三价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗），注入受试动物（小鼠、豚鼠）体内，在规定时间内观察动物出现的毒性反应症状和死亡情况，按段供试品是否复核规定的质量要求及其安全性程度。
试验方法：NIH小鼠，体重：18~22克/只，每组5只；豚鼠，体重250~350克/只，每组2只；
注射剂量及分组
异常毒性试验：按2015版《中国药典》三部附录XIIF项异常毒性检查发规定的接种剂量：小鼠，腹腔注射0.5ml（1人用剂量），豚鼠，腹腔注射5ml（10个人用剂量）。
重复给药试验：按以上试验给药后，观察受试动物三天内未出现异常症状，继续饲养至第七天，受试动物健存、正常，且体重增加，再次重复给与以上剂量集中给药，再连续观察7天，判定结果。
急性毒性试验：按2015版《中国药典》三部附录XIIF项异常毒性检查法规定接种剂量的5倍剂量给药，用各价B群流脑蛋白原液配制浓缩疫苗，给药剂量为小鼠，腹腔注射0.5ml（5个人用剂量），豚鼠腹腔注射5ml（50个人用剂量）。
实验结果判定
小鼠、豚鼠接种供试品后，连续观察7天，观察期内，动物应全部健康、存活，且无异常反应，到期时动物体重增加，判定供试品合格。
试验结果
3价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗异常毒性、急性毒性试验
结果分析
无论是常规剂量异常毒性、常规剂量重复给药和5倍常规剂量急性毒性试验，接种后，各组动物活动、进食均正常，无异常反应，且均健存，体重增加，试验证实，供试品具有可靠的安全性。表明3价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗异常毒性和急性毒性试验合格。
结论3价B群脑膜炎球菌蛋白疫苗异常毒性和急性毒性试验合格。
实施例11对比定点修饰脂质蛋白与野生型脂蛋白粒径分析
利用Dynamic Light Scattering (DLS)，Zetasizer Nano ZS对各个脂质蛋白MenB-V1.55-G2-L1、MenB-V2.16-S3-L1、MenB-V3.45-S4-L1大小分布进行分析，通过定点修饰偶联蛋白得到脂质蛋白的粒度分布均匀，产品均一性良好；而通过传统发酵得到的野生型脂蛋白MenB-V1.55、MenB-V2.16粒度分布不均匀、有聚集物存在，见图1~图5，其中图1为MenB-V1.55蛋白粒径，两个主要粒径范围为20纳米和90纳米，图2为MenB-V2.16蛋白粒径，两个主要粒径范围为30纳米和400纳米；图3为MenB-V1.55-G2-L1蛋白粒径，主要粒径范围为50纳米，图4为MenB-V2.16-S3-L1蛋白粒径，主要粒径范围为60纳米，图5为MenB-V2.16-S3-L1蛋白粒径，主要粒径范围为50纳米。
本发明虽然以较佳实施例公开如上，但并不是用来限定权利要求，任何本领域技术人员在不脱离本发明构思的前提下，都可以做出若干可能的变动和修改，因此本发明的保护范围应当以本发明权利要求所界定的范围准。
序列表
<110> 康希诺生物股份公司
<120> 一种定点突变的载体蛋白及其在制备疫苗中的用途
<130> 111
<160> 57
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> MenB
<400> 1
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Thr Ala
1 5 10 15
Asp Ile Gly Thr Gly Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His
20 25 30
Lys Asp Lys Gly Leu Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln
35 40 45
Asn Gly Thr Leu Thr Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly
50 55 60
Asn Gly Asp Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Asp Phe Ile Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr
85 90 95
Leu Glu Ser Gly Glu Phe Gln Val Tyr Lys Gln Ser His Ser Ala Leu
100 105 110
Thr Ala Leu Gln Thr Glu Gln Glu Gln Asp Pro Glu His Ser Glu Lys
115 120 125
Met Val Ala Lys Arg Arg Phe Arg Ile Gly Asp Ile Ala Gly Glu His
130 135 140
Thr Ser Phe Asp Lys Leu Pro Lys Asp Val Met Ala Thr Tyr Arg Gly
145 150 155 160
Thr Ala Phe Gly Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile
165 170 175
Asp Phe Ala Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Ser
180 185 190
Pro Glu Leu Asn Val Asp Leu Ala Val Ala Tyr Ile Lys Pro Asp Glu
195 200 205
Lys His His Ala Val Ile Ser Gly Ser Val Leu Tyr Asn Gln Asp Glu
210 215 220
Lys Gly Ser Tyr Ser Leu Gly Ile Phe Gly Glu Lys Ala Gln Glu Val
225 230 235 240
Ala Gly Ser Ala Glu Val Glu Thr Ala Asn Gly Ile His His Ile Gly
245 250 255
Leu Ala Ala Lys Gln
260
<210> 2
<211> 255
<212> PRT
<213> MenB
<400> 2
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Ala Gly
1 5 10 15
Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Ser Leu
20 25 30
Gln Ser Leu Thr Leu Asp Gln Ser Val Arg Lys Asn Glu Lys Leu Lys
35 40 45
Leu Ala Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Tyr Gly Asn Gly Asp Ser Leu
50 55 60
Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Val Ser Arg Phe Asp Phe Ile
65 70 75 80
Arg Gln Ile Glu Val Asp Gly Gln Leu Ile Thr Leu Glu Ser Gly Glu
85 90 95
Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala Leu Gln Ile
100 105 110
Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile Asn Gln Arg
115 120 125
Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala Phe Asn Gln
130 135 140
Leu Pro Asp Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe Ser Ser Asp
145 150 155 160
Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala Ala Lys Gln
165 170 175
Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln Asn Val Glu
180 185 190
Leu Ala Ala Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His Ala Val Ile
195 200 205
Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr Tyr His Leu
210 215 220
Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val
225 230 235 240
Lys Ile Gly Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly Lys Gln
245 250 255
<210> 3
<211> 258
<212> PRT
<213> MenB
<400> 3
Cys Gly Ser Ser Gly Gly Gly Gly Val Ala Ala Asp Ile Gly Thr Gly
1 5 10 15
Leu Ala Asp Ala Leu Thr Ala Pro Leu Asp His Lys Asp Lys Gly Leu
20 25 30
Lys Ser Leu Thr Leu Glu Asp Ser Ile Ser Gln Asn Gly Thr Leu Thr
35 40 45
Leu Ser Ala Gln Gly Ala Glu Lys Thr Phe Lys Val Gly Asp Lys Asp
50 55 60
Asn Ser Leu Asn Thr Gly Lys Leu Lys Asn Asp Lys Ile Ser Arg Phe
65 70 75 80
Asp Phe Val Gln Lys Ile Glu Val Asp Gly Gln Thr Ile Thr Leu Ala
85 90 95
Ser Gly Glu Phe Gln Ile Tyr Lys Gln Asp His Ser Ala Val Val Ala
100 105 110
Leu Gln Ile Glu Lys Ile Asn Asn Pro Asp Lys Ile Asp Ser Leu Ile
115 120 125
Asn Gln Arg Ser Phe Leu Val Ser Gly Leu Gly Gly Glu His Thr Ala
130 135 140
Phe Asn Gln Leu Pro Ser Gly Lys Ala Glu Tyr His Gly Lys Ala Phe
145 150 155 160
Ser Ser Asp Asp Ala Gly Gly Lys Leu Thr Tyr Thr Ile Asp Phe Ala
165 170 175
Ala Lys Gln Gly His Gly Lys Ile Glu His Leu Lys Thr Pro Glu Gln
180 185 190
Asn Val Glu Leu Ala Ser Ala Glu Leu Lys Ala Asp Glu Lys Ser His
195 200 205
Ala Val Ile Leu Gly Asp Thr Arg Tyr Gly Ser Glu Glu Lys Gly Thr
210 215 220
Tyr His Leu Ala Leu Phe Gly Asp Arg Ala Gln Glu Ile Ala Gly Ser
225 230 235 240
Ala Thr Val Lys Ile Arg Glu Lys Val His Glu Ile Gly Ile Ala Gly
245 250 255
Lys Gln
<210> 4
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 4
ggagatatac catgggttgt tagagcagcg gtggtggtgg tag 43
<210> 5
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 5
ctaacaaccc atggtatatc tcc 23
<210> 6
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 6
gatataccat gggttgtggt tagagcggtg gtggtggtag tgg 43
<210> 7
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 7
ctaaccacaa cccatggtat atc 23
<210> 8
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 8
ataccatggg ttgtggtagc tagggtggtg gtggtagtgg tgg 43
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 9
ctagctacca caacccatgg tat 23
<210> 10
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 10
ccatgggttg tggtagcagc tagggtggtg gtagtggtgg cgg 43
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 11
ctagctgcta ccacaaccca tgg 23
<210> 12
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 12
tgggttgtgg tagcagcggt tagggtggta gtggtggcgg tgg 43
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 13
ctaaccgctg ctaccacaac cca 23
<210> 14
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 14
gttgtggtag cagcggtggt tagggtagtg gtggcggtgg tgt 43
<210> 15
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 15
ctaaccaccg ctgctaccac aac 23
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 16
gtggtagcag cggtggtggt tagagtggtg gcggtggtgt tac 43
<210> 17
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 17
ctaaccacca ccgctgctac cac 23
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 18
gtagcagcgg tggtggtggt tagggtggcg gtggtgttac cgc 43
<210> 19
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 19
ctaaccacca ccaccgctgc tac 23
<210> 20
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 20
gcagcggtgg tggtggtagt tagggcggtg gtgttaccgc aga 43
<210> 21
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 21
ctaactacca ccaccaccgc tgc 23
<210> 22
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 22
ggagatatac catgggttgt tagagcagcg gtggtggtgg cgt 43
<210> 23
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 23
ctaacaaccc atggtatatc tcc 23
<210> 24
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 24
gatataccat gggttgtggt tagagcggtg gtggtggcgt tgc 43
<210> 25
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 25
ctaaccacaa cccatggtat atc 23
<210> 26
<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 26
ataccatggg ttgtggtagc tagggtggtg gtggcgttgc agc 43
<210> 27
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<213> Artificial sequence
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ctagctacca caacccatgg tat 23
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<400> 28
ccatgggttg tggtagcagc tagggtggtg gcgttgcagc aga 43
<210> 29
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ctagctgcta ccacaaccca tgg 23
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<211> 43
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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tgggttgtgg tagcagcggt tagggtggcg ttgcagcaga tat 43
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<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
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ctaaccgctg ctaccacaac cca 23
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<211> 43
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<213> Artificial sequence
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gttgtggtag cagcggtggt tagggcgttg cagcagatat tgg 43
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<213> Artificial sequence
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<212> DNA
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gtggtagcag cggtggtggt taggttgcag cagatattgg tgc 43
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<213> Artificial sequence
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