阅读说明：本技术 一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白及其制备方法，疫苗组合物，用途 (Group B epidemic encephalitis fHbp-V2 recombinant protein and preparation method thereof, vaccine composition and application ) 是由 刘建东 张静飞 徐颖之 张敬仁 刘建凯 郑海发 于 2019-12-20 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白及其制备方法,疫苗组合物,用途,所述疫苗抗原蛋白基因来自中国流行的B群流脑菌株,所述抗原蛋白免疫小鼠可以诱导产生平均滴度为102600的结合抗体反应和针对fHbp-V2和fHbp-V3的B群流脑菌株的杀菌抗体反应,可以用来预防fHbp-V2和fHbp-V3基因的B群流脑菌株导致的感染。(The invention provides a B-group epidemic encephalitis fHbp-V2 recombinant protein, a preparation method thereof, a vaccine composition and application thereof, wherein antigen protein genes of the vaccine are from Chinese epidemic B-group epidemic encephalitis strains, and an antigen protein immune mouse can induce and generate a binding antibody reaction with the average titer of 102600 and a bactericidal antibody reaction aiming at the B-group epidemic encephalitis strains of fHbp-V2 and fHbp-V3 and can be used for preventing infection caused by the B-group epidemic encephalitis strains of fHbp-V2 and fHbp-V3 genes.)

一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白及其制备方法，疫苗组合物， 用途

技术领域

本发明属于疫苗领域，具体涉及一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，该重组蛋白的氨基酸序列，编码该重组蛋白的基因，包含该重组蛋白的疫苗组合物，该重组蛋白的制备方法，该重组蛋白在制备预防脑脊髓膜炎或菌血症疾病的疫苗中的用途。

背景技术

流行性脑脊髓膜炎(简称流脑)属于我国规定的乙类传染病，是一种由革兰氏阴性的奈瑟双球菌导致的以急性脑脊髓膜炎和败血症为主要症状的通过呼吸道传播的传染病，婴幼儿和青少年是发病的主要人群，脑膜炎奈瑟球菌通常不会导致疾病，以无症状的形式在人体的鼻咽部定植，在某些情况下可以导致脑脊髓膜炎和菌血症。我国流脑的发病率已经下降到了0.01/10万以下，中国疾控预防控制中心发布的2018年中国法定传染病数据显示中国的流脑发病率为0.0075/10万，致死率为8-15％。

根据其荚膜多糖的性质可以将流脑分为13个血清群，其中A、B、C、W和Y血清群是主要的流行菌群，超过95％的流脑感染病例是由这些血清群感染导致的。其中A、C、W、Y群流脑的相应的荚膜多糖疫苗和多糖结合疫苗已经上市销售，用于预防这四种流脑血清群的感染。而B群流脑因为其荚膜多糖是人体细胞的唾液酸酰基蛋白的类似物导致其免疫原性低，不能用于研究B群流脑疫苗。

fHbp是位于流脑外膜的一种可以结合H因子的脂蛋白，H因子在补体系统中具有重要的作用，fHbp可以通过结合H因子的方式逃避免疫系统对流脑菌株的杀伤作用，是一种重要的B群流脑疫苗抗原。根据fHbp的蛋白序列，fHbp主要分为3个变异群V1、V2和V3，每个变异群内fHbp抗原的同源性为91.6-99％，不同变异群间fHbp抗原的同源性最低为62.8％。根据中国疾控中心关于B群流脑的研究数据显示中国与欧美地区流行B群流脑菌株的fHbp基因是不同的，欧美地区流行菌株的fHbp基因主要是V1，占流行菌株的70％，中国流行B群流脑菌株的fHbp基因主要是V2。

欧美地区已经有2个上市的B群流脑疫苗产品，一个疫苗包含两种fHbp抗原蛋白，分别是fHbp-V1.45和fHbp-V3.55，另一个疫苗也包含fHbp-V1.1的蛋白，这三种fHbp的蛋白在中国B群流脑菌株中均未发现，所以筛选中国流行B群流脑菌株的fHbp抗原蛋白对于研制符合中国B群流脑流行情况的疫苗具有重要作用。

发明内容

本发明提供一种B群流脑fHbp-V2重组蛋白，具有如seq ID NO.1所示的氨基酸序列。

本发明提供一种B群流脑fHbp-V2基因序列，编码如权利要求1所述B群流脑fHbp-V2重组蛋白。

优选的，上述的B群流脑fHbp-V2基因序列，其核苷酸序列如seq ID NO.2所示。

优选的，上述的B群流脑fHbp-V2基因序列，根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化后合成后的核苷酸序列如seq ID NO.3所示。

本发明提供一种疫苗组合物，其特征在于，包括上述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白及作为佐剂的氢氧化铝、完全弗氏佐剂、或不完全弗氏佐剂。

优选的，所述的B群流脑fHbp-V2重组蛋白含量为200ug/ml。

优选的，所述氢氧化铝佐剂的含量为1mg/ml。

本发明提供上述B群流脑fHbp-V2重组蛋白抗原在制备预防脑脊髓膜炎或菌血症疾病的疫苗中的用途。

本发明提供一种上述B群流脑fHbp-V2重组蛋白的制备方法，包括以下步骤：

获取基因序列：从中国疾控中心保存的B群流脑的fHbp基因亚变异型V2.18菌株通过PCR基因扩增的方法获取如seqID NO.2所示的fHbp-V2基因的核苷酸序列，其中用于扩增的PCR引物分别为：上游引物：TGACCTGCCTCATTGATGC，下游引物：GCCGTCCGAACACGATAATTTACCG；

密码子优化：对如seq ID NO.2所示的fHbp基因的核苷酸序列用lasergene软件进行大肠杆菌密码子偏好性优化合成获得如seq ID NO.3所述核苷酸序列；

构建原核表达质粒：

将经过密码子优化后的fHbp-V2基因与原核pET28a表达载体经Nco l和EcoR I限制性内切酶双酶切，基因片段回收后用T4 DNA连接酶进行连接，连接产物转化DH5a感受态细胞，培养，鉴定；

构建表达菌株：

构建成功的克隆转化BL21(DE3)表达感受态细胞诱导，培养，诱导表达，并用SDS-PAGE蛋白电泳鉴定菌体蛋白的表达；筛选表达量高的菌株；

fHbp-V2重组蛋白的表达和纯化：

将表达量高的菌株进行培养、收集、破碎、纯化获得fHbp-V2重组蛋白。

本发明涉及的fHbp-V2重组蛋白抗原基因序列来源中国流行的B群流脑的菌株，菌株的fHbp基因属于亚变异型V2.18(Variant 2.18，来自于中国疾病预防控制中心)，抗原基因根据大肠杆菌的密码子偏好性进行密码子优化合成后克隆到原核表达载体pET28a后，表达纯化后获得B群流脑fHbp-V2重组蛋白抗原，获得的fHbp-V2抗原的免疫血清能产生针对fHbp-V2和fHbp-V3的B群流脑菌株的杀菌抗体，效果显著。

本发明的fHbp-V2重组蛋白抗原可诱导针对B群流脑fHbp-V3菌株的交叉杀菌抗体反应，可以用于预防B群流脑fHbp-V2和fHbp-V3菌株的感染。

本发明的优点为筛选获得的fHbp-V2重组蛋白抗原基因来自中国流行的B群流脑菌株，可以用于预防中国B群流脑菌株的流行。

附图说明

图1：fHbp-V2基因序列双酶切的DNA电泳图；

图2：pET28a载体双酶切的DNA电泳图；

图3：fHbp-V2基因原核表达蛋白菌株的表达情况的SDS-PAGE图；

图4：纯化后的fHbp-V2重组蛋白的SDS-PAGE图；

图5：fHbp-V2重组蛋白免疫血清诱导产生的结合抗体反应；

图6：fHbp-V2重组蛋白免疫血清诱导产生的杀菌抗体反应；

具体实施方式

为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面结合具体实施方式对本发明作进一步详细描述。

本专利的实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如《分子克隆：实验室手册》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件进行。

实施例1.fHbp-V2原核表达质粒的构建

1.1.获取基因序列

从中国疾控中心保存的B群流脑的fHbp基因的亚变异型V2.18菌株通过常规PCR基因扩增的方式获取如seq ID NO.2所示的fHbp-V2基因的核苷酸序列，用于扩增的PCR引物分别为：上游引物：TGACCTGCCTCATTGATGC，下游引物：GCCGTCCGAACACGATAATTTACCG，PCR条件为95℃预变性5min；95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环；72℃后延伸5min；

1.2密码子优化：

为了更好的表达目的蛋白，去掉seq ID.NO.2所示的fHbp基因的信号肽核苷酸序列并用lasergene软件进行大肠杆菌密码子偏好性优化合成获得如seq ID NO.3所述核苷酸序列；

1.3.fHbp-V2基因和pET28a载体的双酶切

将优化合成连接在PMD-19T载体上的fHbp-V2基因用Nco I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切处理，37℃条件下过夜酶切，酶切的DNA电泳结果如图1所示；

将原核表达载体pET28a载体用Nco I和EcoR I限制性内切酶进行双酶切处理，37℃条件下过夜酶切，酶切的DNA电泳结果如图2所示。

1.4.酶切片段的回收与连接

经Nco I和EcoR I限制性内切酶过夜酶切的fHbp-V2基因和pET28a基因片段首先进行胶回收，回收的基因片段用T4 DNA连接酶进行连接，连接体系为：

组分	体积(μL)
		ddH20	3
10×buffer	2
		T4连接酶	1
pET28a载体基因	4
		fHbp-V2基因	10

1.5.连接产物的转化和PCR鉴定

连接产物转化DH5α感受态细胞，然后涂布在含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上37℃过夜培养，挑取生长的菌落进行PCR鉴定，鉴定引物为pET28a载体的通用引物，引物序列为：

上游引物：5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′

下游引物：5′-GCTAGTTATTGCTCAGCGG-3′

PCR的作用体系为：

PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性30s；58℃退火30s；72℃延伸60s；30个循环；72℃后延伸5min；4℃终止反应。PCR鉴定正确的菌落送测序鉴定。

实施例2.fHbp-V2原核表达菌株的建立

测序正确的fHbp-V2原核表达质粒转化BL21(DE3)感受态细胞，涂布于含有卡那霉素抗性的LB固体培养基上，挑取菌落至含有5ml液体LB培养基的试管中，37℃转速180rpm的摇床上培养至菌液的0D值到0.2-0.4时，加入5μL的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达，诱导表达3h后12000rpm收集菌体，用PBS溶液重悬后跑SDS-PAGE蛋白电泳鉴定菌体蛋白的表达。图3所示为fHbp-V2原核表达蛋白菌株的表达情况。

实施例3.fHbp-V2重组蛋白的表达和纯化

3.1.fHbp-V2重组蛋白的表达

1)、取鉴定表达量高的fHbp-V2原核表达菌液50μL接种到含有10mL液体LB培养基的试管中，37℃转速180rpm的摇床上过夜培养，第二天早晨接种到含有2L液体LB培养基的培养瓶中培养。

2)、培养至菌液的0D值到0.2-0.4时，加入2mL的IPTG进行诱导表达，16℃转速180rpm的摇床上表达20h。

3)、菌液进行8000rpm离心30min，收集菌体，用200mL的PH7.5，30mM/L的Tris溶液重悬菌体形成菌体悬液。

4)、用高压匀浆机进行菌体的破碎，破碎条件为压力600bar，流速38.00HZ，破碎时间10min。

5)、破碎后的溶液进行10000rpm离心收集上清液进行目的蛋白的纯化。

3.2.fHbp-V2重组蛋白的纯化

采用Sepharose DEAE作为纯化填料，平衡缓冲液为PH7.5，30mM/L的Tris缓冲液，洗脱液为PH7.5，30mM/L的Tris，0.5M/L的NaCl溶液。图4所示为纯化后的fHbp-V2重组蛋白。

实施例4.fHbp-V2重组蛋白浓度的测定

1)标准样品制备：取6支大试管，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0ml标准蛋白质溶液(浓度为100μg/ml)，用水补足到1.0ml；

2)按照合适的稀释度将待测样品稀释至1.0ml；

3)每支试管加入5ml酒石酸钠与硫酸铜50：1混合液，在漩涡混合器上迅速混合，室温反应10分钟；

4)逐管加入0.5毫升Folin酚试剂与水1∶1混合液，立即混匀，室温显色30分钟。

5)以未加蛋白质溶液的第一支试管为空白对照，测定各管中溶液650nm的吸光度值。以蛋白质的量为横坐标，吸光度值为纵坐标，绘制出标准曲线。根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。

实施例5.动物免疫

用氢氧化铝佐剂作为抗原佐剂，fHbp-V2抗原的最终浓度为蛋白200ug/ml，铝佐剂浓度为1mg/ml，吸附fHbp-V2重组蛋白后免疫Balb/C小鼠，吸附条件为300rpm磁力搅拌1h，免疫剂量为20ug/只/次，免疫方式为腹腔免疫，免疫三针，免疫间隔3周，每组10只小鼠，末次免疫后2周采血分离血清进行抗体的检测。进一步研究选取弗氏佐剂作为抗原的佐剂，第一针是完全弗氏佐剂，后两针为不完全弗氏佐剂(其中弗氏佐剂和不完全弗氏佐剂均为商业渠道购买)，佐剂与蛋白溶液进行等体积混合，然后进行乳化，形成入水不散的乳滴免疫动物，蛋白浓度为200ug/ml。选取肌肉免疫和腹腔免疫两种免疫方式，免疫剂量为20μg/只/次，免疫三针，免疫间隔3周，每组10只小鼠，末次免疫后2周采血分离血清进行抗体的检测。

6.ELISA检测结合抗体反应

37℃过夜包被纯化的浓度为10ug/mL的fHbp-V2抗原在96孔聚苯乙烯平板上，每孔包被100μL，弃去上清液，用PBST洗三次，拍干后用5％浓度脱脂乳溶液进行封闭，每孔200μL，37℃封闭2h，弃去溶液，用PBST洗三次，拍干后加入用封闭液稀释的小鼠血清溶液，每孔100μL，37℃反应1h，弃去溶液，用PBST洗三次，拍干后加入用封闭液稀释的山羊抗小鼠的带有HRP标记的二抗溶液，每孔100μL，37℃反应1h，弃去溶液，用PBST洗三次，拍干后加入TMB显色底物溶液，每孔100μL，反应5min后加入50μL的终止液进行终止反应，检测0D450的吸光光度值，判定血清的结合抗体反应滴度。图5所示为fHbp-V2重组蛋白免疫血清诱导产生的抗体的平均滴度为102600。

7.杀菌抗体检测

1).补体和血清样品灭活：将参比血清、待检血清和少量补体于56℃，30min灭活补体。

2).靶菌悬液浓度的配制(终浓度4000CFU/ml)：

挑选过夜培养的典型菌落接种到哥伦比亚血培养基平板上培养4-6h(划线)。刮取菌苔至DPBS缓冲液中混合均匀，在600nm波长下测量吸光度(0D值)为0.35左右，用DPBS缓冲液将测得0D值的菌悬液进行稀释至终浓度为4000CFU/ml，(稀释过程：根据检测出的0D值计算缓冲液的体积＝OD*10-0.1，即取0D值为0.35的细菌悬液100ul加入3.4ml的DPBS缓冲液混匀，即为0.35菌悬液的1/10，再依次做10倍系列稀释至1*10^-4后再稀释3-4倍，根据实验结果确定3或者4倍的稀释度，最终稳定在每12.5ul的菌落数为50CFU-60CFU。)

3).菌浓度质控：将稀释好的靶菌溶液与为灭活幼兔补体等体积混合，取25ul混合液(或直接取12.5ul稀释好的菌悬液)滴种于哥伦比亚血培养基平板过夜培养后进行细菌计数，平板上生长的菌落数应为50-60CFU是最优的靶菌浓度。

4).样品检测：使用96孔细胞培养板，每孔加入DPBS缓冲液25ul，每孔加入25ul的待检血清进行倍比稀释，然后加入12.5ul的未灭活的幼兔补体和12.5ul的菌悬液，同时需要设置阳性对照、补体对照孔和灭活补体对照孔。在摇床上震荡混匀5min，37℃，5％的CO2孵育1.5h。

5).将孵育的96孔板放在振荡器上，边震荡边加入含有TTC的显色培养基(约45℃)，每孔加入50ul，室温放置5min至琼脂彻底凝固，37℃，5％的CO2孵育过夜。

6).每批次实验需要设置三种细菌生长对照，

抗体对照：幼兔补体+菌液+灭活阳性抗体对照+稀释液

补体对照：幼兔补体+菌液+稀释液

灭活补体对照：灭活幼兔补体+菌液+稀释液

7).结果判定：以哥伦比亚血平板上(补体对照孔)生长的菌落数为原始靶菌数，细菌生长对照孔与细菌生长孔相似的待检孔记录为++++，(10％-45％)菌体死亡记录为+++，(50％-75％)菌体死亡记录为++，(75％-100％)菌体死亡记录为+，100％菌体死亡记录为-，能够杀死50％以上菌体的最大血清稀释度即为待检血清的杀菌抗体滴度。(杀菌抗体滴度第一孔以1∶4开始)选取的用来做杀菌实验的菌株为211009(fHbp-V3.94，来自于中国疾病预防控制中心)菌株和441304(fHbp-V2.16，来自于中国疾病预防控制中心)菌株，图6所示为用氢氧化铝作为佐剂，腹腔免疫方式fHbp-V2蛋白诱导产生的杀菌抗体反应，诱导产生的针对211009(fHbp-V3.94)菌株的杀菌抗体的平均滴度为26.4，针对441304(fHbp-V2.16)菌株的杀菌抗体的平均滴度为23.6。

后续确证实验用弗氏佐剂作为佐剂，肌肉免疫方式和腹腔免疫方式进行fHbp-V2重组蛋白免疫，免疫血清的杀菌抗体结果如表一所示，从杀菌抗体的结果来看，肌肉免疫方式产生的杀菌抗体反应好于腹腔免疫方式产生的杀菌抗体反应，小鼠血清产生的针对211009(fHbp-V3.94)菌株的杀菌抗体的几何平均滴度为56，针对441304(fHbp-V2.16)菌株的杀菌抗体的几何平均滴度为134.4。

表1：fHbp-V2抗原不同免疫方式诱导产生的杀菌抗体反应

序列表

<110> 北京民海生物科技有限公司

<120> 一种中国B群流脑fHbp-V2重组蛋白疫苗抗原及其制备方法

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> PRT

<213> 脑膜炎奈瑟氏(Neisseria meningitidis)

<400> 1

Met Gly Gly Val Ala Ala Ala Ile Gly Ala Gly Leu Ala Ala Ala Leu

1 5 10 15

Thr Ala Pro Leu Ala His Leu Ala Leu Ser Leu Gly Ser Leu Thr Leu

20 25 30

Ala Gly Ser Val Ala Leu Ala Gly Leu Leu Leu Leu Ala Ala Gly Gly

35 40 45

Ala Gly Leu Thr Thr Gly Ala Gly Ala Ser Leu Ala Thr Gly Leu Leu

50 55 60

Leu Ala Ala Leu Ile Ser Ala Pro Ala Pro Ile Ala Gly Ile Gly Val

65 70 75 80

Ala Gly Ala Leu Ile Thr Leu Gly Ser Gly Gly Pro Gly Ile Thr Leu

85 90 95

Gly Ala His Ser Ala Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Ile Ala Ala

100 105 110

Pro Ala Leu Ile Ala Ser Leu Ile Ala Gly Ala Ser Pro Leu Val Ser

115 120 125

Gly Leu Gly Gly Gly His Thr Ala Pro Ala Gly Leu Pro Ala Gly Leu

130 135 140

Ala Gly Thr His Gly Leu Ala Pro Ser Ser Ala Ala Ala Gly Gly Leu

145 150 155 160

Leu Thr Thr Thr Ile Ala Pro Ala Ala Leu Gly Gly His Gly Leu Ile

165 170 175

Gly His Leu Leu Thr Pro Gly Gly Ala Val Gly Leu Ala Ala Ala Gly

180 185 190

Leu Leu Ala Ala Gly Leu Ser His Ala Val Ile Leu Gly Ala Thr Ala

195 200 205

Thr Gly Ser Gly Gly Leu Gly Thr Thr His Leu Ala Leu Pro Gly Ala

210 215 220

Ala Ala Gly Gly Ile Ala Gly Ser Ala Thr Val Leu Ile Ala Gly Leu

225 230 235 240

Val His Gly Ile Gly Ile Ala Gly Leu Gly

245 250

<210> 2

<211> 822

<212> DNA

<213> 脑膜炎奈瑟氏(Neisseria meningitidis)

<400> 2

gtgaaccgaa ctgccttctg ctgcctttct ttgaccgccg ccctgattct gaccgcctgc 60

agcagcggag gcggcggtgt cgccgccgac atcggcgcgg ggcttgccga tgcactaacc 120

gcaccgctcg accataaaga caaaagtttg cagtctttga cgctggatca gtccgtcagg 180

aaaaacgaga aactgaagct ggcggcacaa ggtgcggaaa aaacttatgg aaacggcgac 240

agcctcaata caggcaaatt gaagaacgac aaaatcagcc gcttcgactt tatccgtcaa 300

atcgaagtgg acgggcggct cattaccttg gagagcggag agttccaaat atacaaacag 360

gaccactccg ccgtcgttgc cctacagatt gaaaaaatca acaaccccga caaaatcgac 420

agcctgataa accaacgctc cttccttgtc agcggtttgg gcggagaaca taccgccttc 480

aaccaactgc ctgacggcaa agccgagtat cacggcaaag cattcagctc cgacgatgct 540

ggcggaaaac tgacctatac catagatttc gccgccaaac agggacacgg caaaatcgaa 600

cacctgaaaa cacccgagca aaatgtcgag cttgccgccg ccgaactcaa agcagatgaa 660

aaatcacacg ccgtcatttt gggcgacacg cgctacggca gcgaagaaaa aggcacttac 720

cacctcgccc ttttcggcga ccgcgcccaa gaaatcgccg gctcggcaac cgtgaagata 780

agggaaaagg ttcacgaaat cggcatcgcc ggcaaacagt ag 822

<210> 3

<211> 753

<212> DNA

<213> 脑膜炎奈瑟氏(Neisseria meningitidis)

<400> 3

atgggcggcg ttgcggcgga cattggtgcc ggcctggcgg atgccctgac cgcgccatta 60

gatcataaag ataagagctt acagagcctg acgctggatc agagcgtgcg taaaaatgaa 120

aaactgaagc tggcggcgca gggtgcggaa aaaacctatg gcaatggcga cagcctgaat 180

acgggcaagc tgaagaacga taagattagc cgttttgact ttatccgtca gatcgaggtg 240

gacggtcgtc tgattaccct ggaaagcggc gagtttcaaa tctataaaca ggaccatagc 300

gcggtggtgg cgttacagat tgaaaagatc aacaatccgg acaagattga tagcctgatt 360

aaccagcgca gctttctggt gagcggttta ggtggcgagc ataccgcgtt taatcaactg 420

ccagatggca aggccgagta tcatggcaaa gcgtttagca gcgatgatgc gggtggcaaa 480

ctgacgtata ccattgattt cgccgcgaaa cagggccacg gcaaaattga acacctgaaa 540

accccggaac agaatgtgga gttagccgcc gccgaactga aagccgatga gaaaagtcat 600

gcggttatcc tgggtgatac ccgttatggc agcgaagaga aaggcacgta tcatttagcg 660

ttatttggcg atcgtgcgca ggaaattgcc ggtagtgcga ccgttaaaat ccgtgagaaa 720

gtgcatgaaa tcggtattgc gggcaaacag taa 753