阅读说明：本技术 Hla-a2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列及其应用 (HLA-A2 restricted bladder cancer tumor neoantigen peptide sequence and application thereof ) 是由 沈海波 王颖 王晨 段黄琪 曹志伟 于 2019-03-12 设计创作，主要内容包括：本发明公开了HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列,选自以下12个基因的抗原序列的任意一种或任意多种组合：CDKN1A基因,RHOB基因,CDC42基因,DDB1基因,AHNAK基因,ANP32A基因,ALDH16A1基因,MET基因,PRDX6基因,MKI67基因,GAK基因,DSG3基因,其抗原序列分别为如SEQ ID NO:1-12所示。此外,本发明公开了上述抗原序列在制备膀胱癌诊断试剂和膀胱癌治疗药物中的应用。(The invention discloses an HLA-A2 restricted bladder cancer tumor neoantigen peptide sequence, which is selected from any one or any combination of antigen sequences of the following 12 genes: CDKN1A gene, RHOB gene, CDC42 gene, DDB1 gene, AHNAK gene, ANP32A gene, ALDH16A1 gene, MET gene, PRDX6 gene, MKI67 gene, GAK gene and DSG3 gene, and the antigen sequences are respectively shown in SEQ ID NO. 1-12. In addition, the invention discloses application of the antigen sequence in preparation of a bladder cancer diagnostic reagent and a bladder cancer treatment drug.)

HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列及其应用

技术领域

本发明属于肿瘤免疫治疗领域，具体涉及HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列；此外本发明还涉及HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在制备膀胱癌诊断试剂和膀胱癌治疗药物中的应用。

背景技术

肿瘤新抗原(neoantigen)是指在肿瘤发生发展过程中由体细胞基因突变产生的抗原表位。得益于肿瘤基因组计划的实施和TCGA(The cancer genome atlas，癌症和肿瘤基因图谱)公共数据库，肿瘤细胞中的突变基因信息可以通过生物信息学分析而获得，由此形成了基于肿瘤基因组序列的肿瘤新抗原谱的概念。其一方面反映了肿瘤细胞本身的突变状态，进而影响肿瘤细胞的生物学行为；同时其中免疫原性强的抗原(肽)则成为启动特异性细胞免疫应答的重要候选抗原，并有望推动基于肿瘤新抗原的免疫疗法在肿瘤免疫治疗中的应用 (Carreno BM等人，Science,2015,348(6236):803-8；Ott PA等人，Nature,2017,547(7662):217)。目前肿瘤新抗原在肿瘤免疫治疗中的应用可以用于T细胞受体嵌合型T细胞的制备，体外诱导抗原特异性T细胞及肿瘤新抗原疫苗的制备(Spear TT等人，CancerImmunology Immunotherapy,2016,65(3):293-304)，其中肿瘤新抗原疫苗在黑色素瘤中已经得到成功应用(Sahin U等人，Nature,2017,547(7662):222)。

膀胱癌是肿瘤突变荷载较高的肿瘤(Schumacher T N等人，Science,2015, 348(6230):69-74)，但是目前尚未有膀胱癌肿瘤抗原肽的相关报道。现有TCGA的数据中含有来自于不同人群的膀胱癌和外周血的全外显子测序数据，为我们利用生物信息学方法预测HLA-A2限制性的突变抗原肽提供了原始数据。目前，基于大样本的肿瘤抗原候选肽的预测方法众多，预测得到的突变肽还需要通过体外亲和力测定和肿瘤患者中的免疫反应性测定后，才能得以验证。

同时，由于目前肿瘤新抗原肽在肿瘤患者中的突变率较低，具有明显的个体化特征，导致基于肿瘤抗原肽的肿瘤免疫治疗的个性化程度极高，治疗成本高昂，筛选得到的肿瘤抗原肽可能尚无法覆盖较多人群，因此有必要建立肿瘤抗原肽库，使其在患者中的覆盖率达到较高水平，将筛选获得肿瘤新抗原用于肿瘤疫苗或是用于建立抗原特异性T细胞进行细胞治疗。

发明内容

本发明要解决的技术问题之一是提供HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列，利用TCGA数据库中的膀胱癌外显子测序和生物信息学方法，预测高亲和力的HLA-A2限制性野生型和突变型抗原体，并通过体外亲和力测定和膀胱癌人群外周免疫反应性分析，获得具有一定覆盖率及高免疫反应性的膀胱癌肿瘤新抗原。

本发明要解决的技术问题之二是提供HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在制备膀胱癌诊断试剂和膀胱癌治疗药物中的应用。包括在制备膀胱癌的肿瘤疫苗和抗原特异性T细胞的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用如下技术方案：

在本发明的一方面，提供HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列，选自以下抗原序列的任意一种或任意多种组合：

CDKN1A基因，突变型肽段序列：FVTETPLEV，如SEQ ID NO:1所示；

RHOB基因，突变型肽段序列：YLDTDVILM，如SEQ ID NO:2所示；

CDC42基因，突变型肽段序列：YLQTDVFLV，如SEQ ID NO:3所示；

DDB1基因，突变型肽段序列：TLAEDLNLL，如SEQ ID NO:4所示；

AHNAK基因，突变型肽段序列：YLDLKGPKV，如SEQ ID NO:5所示；

ANP32A基因，突变型肽段序列：TLIANLPKL，如SEQ ID NO:6所示；

ALDH16A1基因，突变型肽段序列：GLDGAVDMV，如SEQ ID NO:7所示；

MET基因，突变型肽段序列：LQSEGSPLV，如SEQ ID NO:8所示；

PRDX6基因，突变型肽段序列：IIDDRNWEL，如SEQ ID NO:9所示；

MKI67基因，突变型肽段序列：KLGDVITII，如SEQ ID NO:10所示；

GAK基因，突变型肽段序列：VLDEGGSPI，如SEQ ID NO:11所示；

DSG3基因，突变型肽段序列：YLARIEENI，如SEQ ID NO:12所示。

作为本发明优选的技术方案：

CDKN1A基因的氨基酸突变位点为：G61V；

RHOB基因的氨基酸突变位点为：P75L；

CDC42基因的氨基酸突变位点为：P73L；

DDB1基因的氨基酸突变位点为：S25L；

AHNAK基因的氨基酸突变位点为：D4855Y；

ANP32A基因的氨基酸突变位点为：S56L；

ALDH16A1基因的氨基酸突变位点为：G343V；

MET基因的氨基酸突变位点为：R1148Q；

PRDX6基因的氨基酸突变位点为：R108W；

MKI67基因的氨基酸突变位点为：H84L；

GAK基因的氨基酸突变位点为：S829L；

DSG3基因的氨基酸突变位点为：S273L。

作为本发明优选的技术方案，所述抗原序列的突变类型为错义突变。

作为本发明优选的技术方案，所述抗原序列经过如下步骤筛选获得：

(1)HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的预测；

(2)HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的结合力检测；

(3)HLA-A2限制性膀胱癌突变抗原肽的亲和力常数测定。

作为本发明优选的技术方案，步骤(1)具体为：HLA-A2阳性膀胱癌患者的外周血单个核细胞分离后，利用肿瘤新抗原进行了酶联免疫斑点实验。

作为本发明优选的技术方案，步骤(2)具体为：对肿瘤新抗原刺激后产生的免疫反应进行统计学分析，选取了比值位于阈值以上且突变型平均荧光强度位于前列的预测肽段用于重复实验，在重复实验中，筛选出能够稳定表达主要组织相容性复合物分子，平均荧光强度高于阴性对照，且与野生型肽段的差异较大的肽段作为肿瘤新抗原候选肽段。

在本发明的一方面，提供所述的HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在制备膀胱癌治疗药物中的应用。所述膀胱癌治疗药物包括膀胱癌的肿瘤疫苗和抗原特异性T细胞等。

在本发明的一方面，提供所述的HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在制备膀胱癌诊断试剂(如无创尿液诊断试剂盒)中的应用。所述膀胱癌诊断试剂包括无创尿液诊断试剂盒等。

所述HLA-A2是最常见的HLA基因型(HLA，即人类白细胞抗原，是在抗原识别过程中必需的复合物，A2是其中最常见的一种亚型)，所述HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列指该抗原肽序列仅由HLA-A2复合物识别。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：通过上述技术方案的实施，我们筛选获得了 12条在中国人膀胱癌患者中具有免疫反应性的HLA-A2限制性突变型膀胱癌抗原肽，可作为膀胱癌肿瘤疫苗的候选抗原肽，并由这些抗原体外诱导产生抗原特异性T细胞，用于膀胱癌患者的细胞治疗。在查阅相关专利后，我们发现申请公布号为CN 105473742 A和CN105705653 A关于膀胱癌的两项专利涉及本专利的两个基因CDKN1A(AG1)和MET(AG8)，但这两者均不涉及膀胱癌的肿瘤新抗原研究。因此，本发明筛选的12条HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在本领域是全新的，且该12条膀胱癌肿瘤新抗原肽序列在人群反应性检测(经过酶联免疫斑点实验)证明其可作为膀胱癌肿瘤疫苗的候选抗原肽，并由这些抗原体外诱导产生抗原特异性T细胞，用于膀胱癌患者的细胞治疗。与现有技术相比，本发明建立的膀胱癌肿瘤新抗原肽库能够提高肿瘤新抗原疗法在患者中的覆盖率，同时作为一种精准治疗疗法，能降低患者的治疗成本，提高患者的治疗效果。

附图说明

图1A、图1B、图1C和图1D是本发明的肿瘤新抗原预测肽段的结合力检测结果示意图。其中，图1A为57对预测肽段用流式检测出的平均荧光强度，按照突变型肽段的平均荧光强度由高到低排序。图1B为57对预测肽段突变型与野生型的平均荧光强度比值，由高到低排序，阈值为均值1.5。图1C为和图1D为18对预测肽段的重复实验，同时将前12对肽段重新编号。Genes:基因名；MFI：平均荧光强度；Ratio：平均荧光强度比值；Wild-type: 野生型肽段；Mutant-type:突变型肽段。图1C为野生型肽段和突变型肽段的平均荧光强度示意图；图1D为野生型肽段的平均荧光强度比值示意图。

图2是本发明的肿瘤新抗原候选肽段的亲和力检测结果示意图。其中，每条肽段的平均荧光强度已扣去阴性对照的平均荧光强度。Concentration:肽段浓度；PositiveControl: 阳性对照；AG：抗原肽编号；Mt：突变型肽段；MFI：平均荧光强度。

图3A和图3B是本发明的流式分析法进行患者HLA-A2分型结果示意图。其中，图3A代表HLA-A2阳性患者，图3B代表HLA-A2阴性患者。

图4A、图4B和图4C是本发明的膀胱癌肿瘤新抗原候选肽段在中国人群膀胱癌患者中的免疫反应性检测结果示意图。其中，图4A是12对候选肽段在26例膀胱癌患者(样本号为P1-P26)外周血中的免疫反应性检测，酶联免疫斑点实验检测干扰素-γ的分泌，分泌量大于5表示有反应。图4B是26号患者(样本号为P26)的酶联免疫斑点实验结果。图4C是26例膀胱癌患者对于野生型及突变型肽段的平均反应性。图中，Patients(P):患者编号；Wild-type(wt)：野生型肽段；Mutant-type(mt):突变型肽段；AG：抗原肽编号；BLANK：空白对照；PHA：阳性对照；Total points/num of tested peptides:总反应点数与测试肽段数的比值；Lg-Reaction:总反应点数与测试肽段数比值的对数。

图5是本发明突变型与野生型肽段的配对样本T检验统计图；图5中，Lg-Reaction:总反应点数与测试肽段数比值的对数；Wild-type(wt)：野生型肽段；Mutant-type(mt):突变型肽段。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明进行更加具体的说明。应当理解,此处所描述的实施例是用于解释本发明,而非用于限定本发明。

一、实验材料：

1.T2细胞系

T2细胞是转染了人类白细胞抗原嵌合分子的B淋巴母细胞永生细胞株，其本身不可合成β2微球蛋白，细胞表面人类白细胞抗原的表达不稳定，当添加外源性β2微球蛋白后可以将外源性抗原肽递呈到细胞表面，形成稳定的人类白细胞抗原-抗原肽复合物。美国Stanford 大学引进。

2.试剂

抗原肽：上海生工

Ficoll分离液：Alere Technologies AS 1114547

1640培养基：Gibco

胎牛血清：Gibco

β2微球蛋白：Sigma M4890-250UG

FITC-抗HLA-A2抗体：克隆号BB7.2，abcam公司产品

ELISPOT试剂盒：U-CyTech biosciences CT 230-PR20

二、实验方法：

1.HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的预测

从TCGA数据库中检索膀胱癌样本，每例样本分别包含癌症样本和正常样本，同时从 TCGA level3获得基因表达量均值。从Firehose数据库获得膀胱癌样本中突变位点信息，突变只包含筛选出的错义突变。利用基因对应的转录本信息下载得到蛋白序列和对应突变。遍历计算中国汉族人群高频人类白细胞抗原(HLA)亚型(包括I型和II型)与所有肽段的亲和力，按照亲和力结果分类(1)0-50＝强结合；(2)50-500＝弱结合；(3)>500＝无结合，根据亲和力分类选取癌症样本强结合而正常样本无结合的人类白细胞抗原和肽段配对。将所有配对按照不同亚型做出对应列表，并在通过计算野生型和突变型肽段的亲和力差值与表达量的乘积之后得到了每个基因突变的分值，差值越大，基因表达量越高，分值越大。列表按照分值排序后顺序靠前的配对说明是我们要找的高结合力和高表达量的配对，实验使用数据可根据数量需要取排名靠前的配对。

2.HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的结合力检测

为了确认肿瘤新抗原预测肽段能否引起T细胞表面主要组织相容性复合物的表达，我们将T2细胞(0.5×10⁶/ml)、β2微球蛋白(Sigma,3ug/mL)和膀胱肿瘤新抗原候选肽段(10 ug/mL)在37℃培养箱共同孵育4小时，阳性对照组为加入已知阳性OVA66抗原肽L235(序列为FLPDHINIV)，阴性对照组为不加抗原肽，同时设置T2细胞对照组为不加入β2微球蛋白及抗原肽。孵育结束后，采用直接免疫荧光法标记T2细胞表面的主要组织相容性复合物分子的表达，由流式细胞术测定T2细胞表面主要组织相容性复合物分子的平均荧光强度，以确定膀胱肿瘤候选抗原肽的结合能力。在得到每对肽段对应的平均荧光强度后，按照突变型肽段的平均荧光强度高低排序，同时参考突变型与野生型的平均荧光强度比值(采用均值或中位数作为阈值)，来选取突变型肽段平均荧光强度靠前的肽段，得到能够刺激T2细胞产生高表达量主要组织相容性复合物，同时具有与野生型肽段差异表达的肿瘤新抗原候选肽段。在重复实验中剔除不能稳定表达主要组织相容性复合物分子的肽段。

3.HLA-A2限制性膀胱癌突变抗原肽的亲和力常数测定

将T2细胞(0.5×10⁶/ml)、β2微球蛋白(Sigma,3ug/mL)和不同浓度(0、0.4、2、10、20ug/mL)的肿瘤新抗原候选肽段共同孵育4小时后,经免疫荧光法标记T2细胞后，由BDFACS CantoII收集T2细胞并检测细胞表面主要组织相容性复合物分子的平均荧光强度，选择以呈现50％的最强平均荧光强度的候选肽段浓度来表示亲和力水平。

4.外周血单个核细胞的分离

取膀胱癌患者15mL外周血，肝素抗凝，按照体积比1:1加入到5mL Ficoll分离液上，采用缓慢升降模式，常温2300rpm水平离心22min。轻轻吸取中间PBMCs层，并转移至含有10mL 1640培养基的离心管中，1500rpm离心10min，弃上清；再用10mL 1640培养基重悬PBMCs细胞，1500rpm离心10min，弃上清，最后用1mL 1640完全培养基(含10％ FBS)重悬细胞。细胞计数。

5.流式分析法进行患者HLA-A2分型

流式检测用于分析细胞表面的主要组织相容性复合物分子的表达量。孵育结束的细胞用 PE-鼠抗人-HLA-A2(克隆号BB7.2，Sigma公司产品)于4℃避光孵育40分钟进行表面标志物染色。FACS CantoⅡ流式细胞仪收集细胞，并采用FlowJo软件(Treestar公司)分析。

6.酶联免疫斑点实验

取ELISPOT培养板，每孔加入25μl 70％乙醇，室温放置1min；用200μl无内毒素的PBS (10010,invitrogen)洗涤2次，将板子在灭菌的滤纸上拍干；每孔加入50μl抗IFN－γCoating Antibody，4℃过夜后，去除液体，每孔加入200μl PBS洗涤3次。每孔加入200μlBlocking Buffer，37℃封闭1h；去除封闭液，每孔加入100μl 2.5×10⁶/ml PBMC细胞悬液及相应的刺激物。其中实验孔中加入2μg/ml抗原肽，以2.5μg/ml PHA作为阳性对照；37℃，5％CO2以及100％湿度细胞培养箱中培养20h；去除细胞液，每孔加入200μl室温PBS洗涤2次。之后再用250μl PBST(PBS含0.05％Tween-20)洗涤5次；每孔加入100μl抗IFN －γDetection Antibody，用封口膜粘贴密封，并于37℃结合1h或4℃过夜；弃上清液，每孔加入250μl PBST洗涤5次。每孔加入100μl Streptavidin-HRP溶液，用封口膜粘贴密封，并于37℃结合1h；弃上清液，每孔加入250μl PBST洗涤5次；每孔加入100μl AEC底物室温避光显色30min；去除ELISPOT板子底部塑料板，用蒸馏水彻底洗涤PVDF膜正反面，以终止反应；室温避光干燥过夜，用酶联斑点计数仪读取斑点数。

7.统计分析

我们用SPSS(IBM，SPSS，Statistics version21)软件进行了统计分析，P<0.05被认为有意义。

三、实验结果

1.HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的预测

TCGA中膀胱癌样本共412例，每例样本分别包含癌症样本和正常样本。从Firehose获得膀胱癌样本中基因数目：16195，突变数目：84719，突变只包含筛选出的错义突变。利用基因对应的转录本信息下载得到13718条蛋白序列，对应突变数目64134。遍历计算中国汉族人群高频人类白细胞抗原亚型的亲和力后，共得到34种人类白细胞抗原亚型与128268条肽段遍历配对的亲和力(包括64134条癌症样本肽段和64134条正常样本肽段)。根据亲和力分类选取癌症样本强结合而正常样本无结合的配对，共从2180556个配对中筛选出8827 对配对，其中包含了30个亚型(其余4个亚型没有满足条件的配对)。我们选取了共有920 对人类白细胞抗原-A*02：01限制性肽段配对中的前57对进行了化学合成。表1中包括了每个基因名称、氨基酸突变位点、野生型和突变型的肽段序列及亲和力、基因表达量、分值。

表1

表1是57对人类白细胞抗原-A2限制性预测肽段信息。列表按照分值排序。基因下标为氨基酸突变位点，数字(N)表示第N位氨基酸发生突变。亲和力代表对应9肽结合力，数值越小结合力越强；表达量代表从TCGA level3获得的基因表达量均值；分值代表野生型和突变型肽段的亲和力差值与表达量的乘积。

2.HLA-A2限制性野生型和突变型膀胱癌抗原肽的结合力检测

在第一次实验中，几乎所有肽段的突变型平均荧光强度均高于阴性对照(4665)，野生型肽段平均荧光强度与阴性对照基本持平。其中CDKN1A_G61V、RHOB_P75L、AHNAK_D4855Y三个基因编码的预测肽段突变型平均荧光强度高于阳性对照(10400)，并且这三个基因的突变型与野生型的平均荧光强度比值位于57对肽段的前列(见图1A和图1B)。我们选取了比值位于阈值以上(阈值为均值1.5)且突变型平均荧光强度位于前18位的预测肽段用于重复实验。在重复实验中，这18对肽段中有6对突变型的平均荧光强度低于阴性对照，且与野生型差异不大，故不能成为肿瘤新抗原候选肽段。剩下的12对肽段的突变型在重复实验中仍旧能够稳定表达主要组织相容性复合物分子，平均荧光强度高于阴性对照，且与野生型肽段的差异较大(见图1C和图1D)。

3.HLA-A2限制性膀胱癌突变抗原肽的亲和力常数测定

在不同浓度时，12对肿瘤新抗原候选肽段的突变型表现出不同的亲和力，随浓度升高而增加。突变型肽段的亲和力水平位于0.6-11ug/ml的范围内，亲和力最高的是AG2-Mt，最低的是AG8-Mt(见图2)。

4.外周血单个核细胞的分离

26例HLA-A2阳性膀胱癌患者外周血单个核细胞全部良好分离。

5.流式分析法进行患者HLA-A2分型

HLA-A2阳性膀胱癌患者的细胞表面PE荧光表达量明显高于阴性患者的表达量，可确认为HLA-A2阳性患者(见图3A和图3B)。其中图3A为HLA-A2阳性患者，图3B为HLA-A2阴性患者。

6.酶联免疫斑点实验

膀胱癌患者的外周血单个核细胞在受到12条肿瘤新抗原候选肽段的刺激后，呈现出了高低不同的免疫反应性。不同患者对于不同候选肽段的反应性不尽相同，但从整体来看，突变型肽段的反应性要高于野生型(见图4A、图4B、图4C和表2)。图4A、图4B和图4C是本发明的膀胱癌肿瘤新抗原候选肽段在中国人群膀胱癌患者中的免疫反应性检测结果示意图。其中，图4A是12对候选肽段在26例膀胱癌患者(样本号为P1-P26)外周血中的免疫反应性检测，酶联免疫斑点实验检测干扰素-γ的分泌，分泌量大于5表示有反应。图4B是26号患者(样本号为P26)的酶联免疫斑点实验结果。图4C是26例膀胱癌患者对于野生型及突变型肽段的平均反应性。以P26为例，我们可以看到AG2、AG6、AG9、AG12肽段刺激其外周血单个核细胞后引起了一定程度的免疫反应，而对应的野生型肽段并没有引起足够的免疫反应，说明该病人的外周血单个核细胞能够识别并针对这四条肿瘤新抗原肽段产生免疫杀伤效应。图中，Patients(P):患者编号；Wild-type(wt)：野生型肽段；Mutant-type(mt):突变型肽段；AG：抗原肽编号；BLANK：空白对照；PHA：阳性对照；Total points/num of testedpeptides:总反应点数与测试肽段数的比值。

7.统计分析

突变型与野生型肽段的配对样本T检验，P<0.05，差异有统计学意义，即在总体水平，由这12条肿瘤新抗原肽段组成的肽段库能够在膀胱癌患者中引起特异性的识别(见图5)。图5中，Lg-Reaction:总反应点数与测试肽段数比值的对数；Wild-type(wt)：野生型肽段； Mutant-type(mt):突变型肽段。

通过上述技术方案的实施，我们筛选获得了以下12条在中国人膀胱癌患者中具有免疫反应性的HLA-A2限制性突变型膀胱癌抗原肽(见表2)。这12条肽段既可以在肽段虚拟筛选跟体外筛选中表现出较强的亲和力(见上述实验结果1、2、3)，由其组成的肽段库又可以在膀胱癌患者的外周血单个核细胞中激发足够的免疫杀伤效应(见上述实验结果4、5、6、7)，所以可作为膀胱癌肿瘤疫苗的候选抗原肽，并由这些抗原体外诱导产生抗原特异性T细胞，用于膀胱癌患者的细胞治疗。

表2 12条HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽段的基本信息

以上仅是本发明的具体应用范例，对本发明的保护范围不构成任何限制；对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以列举说明。凡采用等同变换或者等效替换而形成的类似此种的技术方案，均落在本发明权利保护范围之内。

序列表

<110>上海交通大学医学院附属新华医院

<120> HLA-A2限制性膀胱癌肿瘤新抗原肽序列及其应用

<130> WH-NP-19-100150

<160>12

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 1

FVTETPLEV 9

<210> 2

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 2

YLDTDVILM 9

<210> 3

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 3

YLQTDVFLV 9

<210> 4

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 4

TLAEDLNLL 9

<210> 5

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 5

YLDLKGPKV 9

<210> 6

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 6

TLIANLPKL 9

<210> 7

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 7

GLDGAVDMV 9

<210> 8

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 8

LQSEGSPLV 9

<210> 9

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 9

IIDDRNWEL 9

<210> 10

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 10

KLGDVITII 9

<210> 11

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 11

VLDEGGSPI 9

<210> 12

<211>9

<212>PRT

<213> 人工序列（未知）

<400> 12

YLARIEENI 9