阅读说明：本技术 提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料 (Method for improving rice blast resistance of rice and related biological material thereof ) 是由 李莉 李懿星 张大兵 邱牡丹 王天抗 宋书锋 于 2019-02-02 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料。本发明提供了一种培育目的水稻的方法,包括如下步骤：抑制出发水稻中RAY1蛋白的活性,得到目的水稻；所述目的水稻与所述出发水稻相比,表现出对稻瘟病的抗性增强；所述RAY1蛋白为序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明利用CRISPR/Cas9技术,定点编辑水稻RAY1基因,通过移码突变,敲除了水稻了RAY1基因,使蛋白RAY1失活,获得了抗病性明显提高的新一代水稻新种质。(The invention discloses a method for improving rice blast resistance of rice and a related biological material thereof. The invention provides a method for cultivating target rice, which comprises the following steps: inhibiting the activity of RAY1 protein in the original rice to obtain the target rice; the target rice shows an enhanced resistance to rice blast as compared with the starting rice; the RAY1 protein is a protein composed of an amino acid sequence shown by SEQ ID No.1 in a sequence table. The invention utilizes CRISPR/Cas9 technology to edit rice RAY1 gene at fixed point, and eliminates rice RAY1 gene through frame shift mutation, so that protein RAY1 is inactivated, and a new generation of new rice germplasm with obviously improved disease resistance is obtained.)

提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料

技术领域

本发明涉及生物技术育种领域，具体涉及一种提高水稻稻瘟病抗性的方法及其相关生物材料。

背景技术

稻瘟病是由Magnaporthe oryzae(无性世代：Pyricularia oryzae)侵染引起的水稻主要的病害，是我国乃至世界水稻生产上最重要的病害之一。稻瘟病在世界范围内普遍发生，对水稻产量造成的损失可达11％～30％，在严重发病的田块，产量损失高达80％，甚至颗粒无收，严重影响粮食产量与质量。植物病害导致作物生产遭受破坏性的产量损失，威胁着全球粮食安全。反复过量施用农药来控制植物病害已经污染了全球的许多环境。目前，作物抗性的遗传改良是预防疾病爆发最经济和最环保的方法。尽管在植物育种中已经部署了许多赋予种族特异性抗性的抗性(R)基因，但它们的抗性通常仅在几年内保持有效，可能是由于对强毒种族进化的强烈选择压力。相反，由多个基因或数量性状基因座(QTL)控制的广谱抗性通常是持久的，对疾病管理更有效。因此，培育抗性持久且高效的水稻品种，成为目前水稻生产上的迫切要求。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何提高水稻对稻瘟病的抗性。

为了解决上述技术问题，本发明首先提供了一种培育抗稻瘟病水稻的方法。

本发明所提供的培育抗稻瘟病水稻的方法，包括如下步骤：抑制出发水稻中RAY1蛋白的活性，得到目的水稻；所述目的水稻与所述出发水稻相比，表现出对稻瘟病的抗性增强；所述RAY1蛋白为序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。

上述方法中，所述抑制出发水稻中RAY1蛋白的活性可为抑制出发水稻中RAY1蛋白的全部活性或部分活性。

上述方法中，所述抑制出发水稻中RAY1蛋白活性可通过使所述RAY1蛋白的编码基因的功能丧失实现。

所述RAY1蛋白的编码基因可为如下1)或2)：1)序列表中SEQ ID No.2所示的DNA分子；2)序列表中SEQ ID No.3所示的DNA分子。

上述方法中，使所述RAY1蛋白的编码基因的功能丧失，可采用现有技术中的任何方式，以使基因产生缺失突变、插入突变或碱基变换突变，进而使基因的功能丧失。

上述方法中，使所述RAY1蛋白的编码基因的功能丧失可为使所述RAY1蛋白的编码基因的全部功能丧失或部分功能丧失。

上述方法中，使RAY1蛋白编码基因功能丧失，可采取化学诱变、物理诱变、RNAi、基因定点编辑、同源重组等方法。

无论采取哪种方法，既可将RAY1蛋白的整个编码基因作为靶标，又可将调控RAY1蛋白编码基因表达的各个元件作为靶标，只要能实现基因功能丧失即可。如可以将RAY1的编码基因的第1外显子、第2外显子、第3外显子和/或第4外显子作为靶标。

上述基因组定点编辑中，可采用锌指核酸酶(Zinc finger nuclease，ZFN)技术、类转录激活因子效应物核酸酶(Transcription activator-like effectornuclease，TALEN)技术或成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关系统(Clusteredregularlyinterspaced short palindromic repeats/CRISPR associated，CRISPR/Cas9system)技术，以及其它能实现基因组定点编辑的技术。

本发明的具体实施例中采用了CRISPR/Cas9技术，其中涉及的靶序列为TCGTCGAGAGCTACGAGAT，所使用的sgRNA(向导RNA)的编码基因如序列表中SEQ ID No.4所示。

进一步具体的，本发明中使用了能表达向导RNA和Cas9的重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1。所述重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1为用包含有特异sgRNA编码基因和U3启动子的DNA片段替换载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono上两个BsaⅠ酶切位点之间的片段，并保持pYLCRISPR/Cas9-MTmono的其它核苷酸不变得到的重组载体；具体为用序列表中SEQID No.5所示的DNA分子替换掉载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono的两个BsaⅠ酶切位点之间的片段得到的。上述方法适用于任何水稻，如：水稻粳稻品种(Oryza sativa subsp.japonica)或水稻籼稻品种(Oryza sativa subsp.indica)，只要含有上述靶序列即可。本发明列举的例子是水稻日本晴(Oryza Sativa L.spp.japonica)。

为了解决上述技术问题，本发明还保护抑制RAY1蛋白活性的物质在提高水稻对稻瘟病抗性中的应用；所述RAY1蛋白为序列表中SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白。

上述应用中，所述抑制RAY1蛋白的活性可为抑制RAY1蛋白的全部活性或部分活性。

上述应用中，所述抑制RAY1蛋白的物质可为如下(1)-(3)任意一种：(1)特异sgRNA，所述特异sgRNA的靶序列为TCGTCGAGAGCTACGAGAT；(2)编码(1)所述特异sgRNA的DNA分子；(3)表达(1)所述特异sgRNA的载体。

上述应用中，所述特异sgRNA的编码基因如序列表中SEQ ID No.4所示。

上述应用中，所述表达特异sgRNA的载体为重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1。所述重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1为用包含有特异sgRNA编码基因和U3启动子的DNA片段替换载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono的两个BsaⅠ酶切位点之间的片段并保持pYLCRISPR/Cas9-MTmono的其它核苷酸不变得到的重组载体；具体为用序列表中SEQ ID No.5所示的DNA分子替换掉载体pYLCRISPR/Cas9-Mtmono上两个BsaⅠ酶切位点之间的片段得到的。

上述应用中，所述水稻为水稻粳稻品种(Oryza sativa subsp.japonica)或水稻籼稻品种(Oryza sativa subsp.indica)。所述水稻粳稻品种可为水稻日本晴(OryzaSativa L.spp.japonica)。

为了解决上述技术问题，本发明还提供一种特异sgRNA，其在水稻基因组中的靶序列为：TCGTCGAGAGCTACGAGAT。

为了解决上述技术问题，本发明还提供一种重组质粒，含有Cas9蛋白的编码基因、sgRNA的编码基因和U3启动子；所述sgRNA的靶序列为：TCGTCGAGAGCTACGAGAT。

本发明利用CRISPR/Cas9技术，定点编辑水稻RAY1基因，通过移码突变，敲除了水稻了RAY1基因，使蛋白RAY1失活，获得了抗病性明显提高的新一代水稻新种质。获得的RAY1定点编辑株系与野生型对照相比，水稻对稻瘟病的抗性增强。由此可见，本发明对提高水稻抗病性具有重要意义，为抗病新品种的开发提供了新的材料。

附图说明

图1为PCR扩增RAY1cDNA全长序列凝胶电泳图。

图2为中间载体pYLgRNA-U3的图谱。

图3为pYLgRNA-U3-RAY1测序序列与中间载体pYLgRNA-U3序列比对图。

图4为中间载体pYLgRNA-U3-RAY1表达盒扩增电泳检测图。

图5为基因组编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono载体图谱。

图6为PCR检测重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1转化大肠杆菌的单克隆菌落的结果电泳图。

图7为RAY1突变类型及突变后编码的氨基酸类型。

图8为株系L-46水稻植株与日本晴NIP的苗期的稻瘟病接种鉴定结果；其中ZA18、ZB10、ZB13、ZB20、ZC2、ZC10、ZG1为稻瘟病生理小种。

图9为稻瘟病抗性相关基因OsPR1a、OsPR10、PBZ1在株系L-46、L-47和L-48水稻植株中与日本晴NIP中的相对表达量。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

表达载体pYLgRNA-U3在文献“史江伟，李懿星，宋书锋，邱牡丹，邓尧，李莉.CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osal基因.杂交水稻(HYBRID RICE)，2017，32(3)：74-78.”中公开过，公众可从湖南杂交水稻研究中心所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

表达载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono在文献“史江伟，李懿星，宋书锋，邱牡丹，邓尧，李莉.CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osal基因.杂交水稻(HYBRID RICE)，2017，32(3)：74-78.”中公开过，公众可从湖南杂交水稻研究中心所获得获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

水稻品种日本晴(NIP)在文献“MP，A Robust CRISPR/Cas9System forConvenient,High-Efficiency Multiplex Genome Editing in Mono cot and DicotPlants.Mol Plant.2015Aug 3；8(8):1274-84.doi:10.1016/j.molp.2015.04.007.Epub2015Apr 24.”中公开过，公众可从湖南杂交水稻研究中心所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)生理小种ZA18、ZB10、ZB13、ZB20、ZC2、ZC10和ZG1在文献：“Characterization of molecular identity and pathogenicity of riceblast fungus in Hunan pr ovince of China.Plant Disease,2017,101(4)：557-561.”中公开过，公众可从湖南杂交水稻研究中心所获得，该生物材料只为重复本发明的相关实验所用，不可作为其它用途使用。

实施例1、RAY1蛋白编码基因的克隆及测序

以水稻日本晴cDNA为模板，RAY1FL-F(ATGGAGATGCACGAGTGCTG)与RAY1FL-R(ATGGAGATGCACGAGTGCTG)为引物，进行PCR扩增。扩增产物为一条大小约1300bp的DNA片段，结果如图1所示。经序列测定，该DNA片段长度为1332bp，具有序列表中SEQ ID No.3所示的核苷酸序列，将其命名为RAY1。其编码一个由443个氨基酸组成的蛋白质RAY1，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示。RAY1基因基因组DNA全长1659bp，含有4个外显子和3个内含子，其核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

实施例2、水稻RAY1基因靶标位点的选择及敲除载体的构建

一、靶序列的设计

在RAY1基因的CDS区域确定NGG(N为任意碱基)上游第20个碱基为A的序列，将紧邻“A”的下游19个碱基组成的序列作为待选靶位点(由于中间载体pYLgRNA-U3启动子转录起始碱基为A，与NGG上游第20个碱基相同，因此，视剩余19个碱基序列为待选靶位点)，获得靶位点序列：TCGTCGAGAGCTACGAGAT。其位于RAY1基因gDNA的第3外显子上，具体为序列表中SEQ ID No.2第864-882位所示的DNA分子，即序列表中SEQ ID No.3第653-671位所示的DNA分子。

二、重组质粒的构建

1、中间载体pYLgRNA-U3-RAY1的构建

(1)RAY1靶位点接头引物设计及合成

靶位点序列确定后，在靶序列正义链5’前加GGCA，反义链5’前加AAAC，得到靶位点接头引物。靶位点接头引物序列如下：

RAY1-Cas9-F：GGCATCGTCGAGAGCTACGAGAT

RAY1-Cas9-R：AAACATCTCGTAGCTCTCGACGA

(2)RAY1靶位点接头的制备

将RAY1靶位点接头引物RAY1-Cas9-F和RAY1-Cas9-R用ddH2O稀释成浓度为10μM的母液，各取10μL至80μL去离子水中至终体积为100μL，充分混匀后90℃热激30s，移至室温完成退火，获得RAY1靶位点接头，标记为RAY1-Cas9。

(3)RAY1中间载体的构建

将1μL pYLgRNA-U3载体质粒(如图2所示)、1μL 10×T4DNA Ligase Buffer、1μL靶位点接头RAY1-Cas9、1μL BsaⅠ限制性内切酶和0.5μL 10×T4DNA Ligase混合均匀，用PCR仪进行反应，反应条件为：37℃5min，20℃5min，5个循环，获得RAY1中间载体。对RAY1中间载体进行测序确认，结果显示：RAY1中间载体比pYLgRNA-U3载体质粒多出19个碱基，该19个碱基为RAY1靶位点序列(如图3框体所示)。这表明RAY1靶位点序列已经成功构建入pYLgRNA-U3载体质粒中，将该中间载体命名为pYLgRNA-U3-RAY1。

2、重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1的构建

(1)RAY1中间载体表达盒的扩增

以中间载体pYLgRNA-U3-RAY1为模板，Uctcg-B1(TTCAGAGGTCTCTCTCGCACTGGAATCGGCAGCAAAGG

)和gRcggt-BL(AGCGTGGGTCTCGACCGGGTCCATCCACTCCAAGCTC)为引物进行PCR扩增，得到扩增产物。将扩增产物进行凝胶电泳检测，确定其为一条大小约550bp DNA分子(如图4所示)，该扩增结果与预期一致。回收纯化该扩增产物，并将其命名为RAY1中间载体表达盒。该表达盒包含sgRNA编码基因和U3启动子，其中sgRNA靶标序列为TCGTCGAGAGCTACGAGAT，sgRNA编码基因如序列表中SEQ ID No.4所示。

(2)RAY1定点编辑终载体的构建及转化

利用BsaⅠ限制性内切酶和T4DNA Ligase，酶切并连接基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono(如图5所示)和RAY1中间载体表达盒，获得RAY1基因定点编辑终载体。转化大肠杆菌，涂布于含有卡那霉素的平板上，37℃过夜培养。

(3)重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1的检测

随机挑取步骤(2)中过夜培养的4个单克隆菌落，分别命名为RAY1-cas9-1、RAY1-cas9-2、RAY1-cas9-3和RAY1-cas9-4，利用pYLCRISPR/Cas9-MT载体检测引物SP1(CCCGACATAGATGCAATAACTTC)和SP2(GCGCGGTGTCATCTATGTTACT)对4个单克隆菌落进行PCR检测。PCR扩增产物进行凝胶电泳，电泳结果(如图6所示)表明，RAY1-cas9-2单克隆菌落能扩增出大小为550bp的条带，该结果与预期一致。

提取RAY1-cas9-2单克隆的质粒DNA进行测序。测序结果显示：序列表中SEQ IDNo.5所示的DNA片段成功替换掉基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-Mtmono上两个BsaⅠ酶切位点之间的DNA片段。这表明含有U3启动子和sgRNA编码基因的表达盒成功构建到基因编辑载体pYLCRISPR/Cas9-MTmono上，即RAY1的基因组定点编辑载体构建成功，获得重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1。

实施例3、利用重组质粒培育目的水稻

一、重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1转化水稻日本晴

利用农杆菌介导转化水稻愈伤组织的方法，将RAY1基因定点编辑重组载体pYLCRISPR/Cas9-MT-RAY1转化水稻日本晴愈伤组织，筛选并鉴定获得阳性突变体。

二、定点编辑的检测

利用PCR检测阳性突变体，测序获得3种突变类型的纯合突变体，分别命名为RAY1-46、RAY1-47和RAY1-48。测序结果表明(如图7所示)，突变体RAY1-46在RAY1基因CDS的第660-670位上缺失11个碱基，在RAY1蛋白氨基酸序列的第220位出现移码，在第430位翻译终止；突变体RAY1-47在RAY1基因CDS的第668位和第669位之间插入了1个碱基T，在RAY1蛋白氨基酸序列的第223位出现移码，在第434位翻译终止；突变体RAY1-48在RAY1基因CDS的第668位和第671位之间缺失2个碱基，在RAY1蛋白氨基酸序列的第223位出现移码，在第433位翻译终止。

三、突变体对稻瘟病的抗性鉴定

1、对稻瘟病抗性的初步鉴定

正常培育突变体RAY1-46、突变体RAY1-47和突变体RAY1-48，分别收获突变体RAY1-46、突变体RAY1-47和突变体RAY1-48的T₁代种子，种植T₁代种子，苗期筛选出没有外源载体且遗传稳定的T₁代水稻株系。将筛选后的突变体RAY1-46、突变体RAY1-47和突变体RAY1-48的T₁代水稻株系分别记为L-46、L-47和L-48。

分别用稻瘟病生理小种ZA18、ZB10、ZB13、ZB20、ZC2、ZC10和ZG1接种水稻突变体株系L-46、L-47和L-48，进行稻瘟病抗谱测定。同时设置野生型水稻日本晴和稻瘟病高感品种co39作为对照。具体方法如下：分别用5‰的明胶溶液将不同生理小种配置成5×10⁴个孢子/毫升的孢子悬浮液，用喷枪均匀把孢子悬浮液喷洒于两叶一心或三叶期的水稻幼苗的叶表面，然后将接种后的水稻幼苗暗培养24小时，再转入光暗交替(12小时光照，12小时黑暗)环境中进行培养，其中培养的环境温度为27℃，相对湿度为90％。每个突变株系和对照均接种10株水稻植株，实验重复三次。一周后调查发病情况(评判标准见表1)。根据发病情况计算突变体和野生型水稻植株的病情指数。

水稻苗期叶片病情指数公式为：病情指数＝∑(各级病株数×相应级数)/(调查总株数×9)×100。

表1水稻植株发病情况评判标准

结果如表2、3和图8所示，株系L-46、L-47和L-48的病情指数远远低于野生型水稻日本晴和co39，野生型水稻日本晴和co39对检测的所有稻瘟病菌小种均无抗性，而株系L-46、L-47和L-48的水稻植株对检测的所有稻瘟病菌小种均表现出抗性。

表2突变体T1代水稻植株与野生型水稻植株发病情况调查结果

表3突变体T1代水稻植株与野生型水稻植株的病情指数统计表

2、株系L-46、L-47和L-48中稻瘟病抗性相关基因OsPR1a、OsPR10、PBZ1的表达特性分析

分别采集水稻品种日本晴、株系L-46、L-47和L-48的水稻植株的叶鞘和叶片提取总RNA，利用DNAseDNaseⅠ处理除去残留DNA，利用oligdT将其反转录为cDNA。以此cDNA为模板，分别用引物PR1a-QF/QR(PR1a-QF：CGTCTTCATCACCTGCAACT和PR1a-QR：TGTCCATACATGCATAAACACG)、PR10-QF/QR(PR10-QF：CTCATCCTCGACGGCTACTT和PR10-QR：ATCAGGAAGCAGCAATACGG)和PBZ1-QF/QR(PBZ1-QF：GGGTGTGGGAAGCACATACA和PBZ1-QR：CCTCGAGCACATCCGACTTT)进行qRT-PCR扩增，检测稻瘟病抗性相关基因OsPR1a、OsPR10、PBZ1在日本晴、L-46、L-47和L-48中的表达量。并以ACTIN为检测内参，所用引物为ACTIN-QF(ACTIN-QF：TGCTATGTACGTCGCCATCCAG)和ACTIN-QR(ACTIN-QR：AATGAGTAACCACGCTCCGTCA)。

结果如图9所示，株系L-46、L-47和L-48的植株中，稻瘟病抗性相关基因OsPR1a、OsPR10、PBZ1的表达量相对于水稻野生型品种日本晴都上调。具体而言，相对于水稻日本晴，OsPR1a、OsPR10、PBZ1在水稻突变株系L46中分别上调8.2倍、10.6倍和2.6倍；在水稻突变株系L47中分别上调7.9倍、11.5倍和2.5倍；在水稻突变株系L48中分别上调8.9倍、10.8倍和3.0倍。这一结果表明RAY1基因负调控稻瘟病抗性相关基因OsPR1a、OsPR10、PBZ1的表达，从而调控水稻植株对稻瘟病的抗病性。